专利名称：一种用于牛结核病诊断的真核表达cfp10-esat-6融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6融合蛋白，该蛋白为酵母表达系统真核表达所得，在牛结核病诊断中显示较好的应用前景。
背景技术：
牛结核病主要由牛型分枝杆菌感染牛引起的一种慢性细菌性疾病，也可感染人类和其他一些动物引起相应疾病，被国际兽医局(OIE)列为需通报的动物疫病。牛结核病直接影响牛的生产力及产品的国际贸易，造成巨大的经济损失，同时其作为一种重要的人兽共患病，也是公共卫生的重大威胁。虽然大部分发达国家由于采取“检疫-扑杀”的根除策略和强大的经济支撑，牛结核病流行率已降至很低水平，但至今尚无任何国家获得OIE “无结核”认可。另外，牛结核病在许多发展中国家仍十分流行，近年来随着养牛业突飞猛进的发展，我国一些地区的发病率也呈上升趋势。因此，如何有效预防和检测牛结核具有重要的经济和社会意义。鉴于分枝杆菌感染初期机体的免疫应答主要以细胞免疫为主，故牛结核的检疫主要通过细胞免疫应答为基础的检测手段，包括结核菌素皮内变态试验(TST)和抗原特异的Y-干扰素(IFN-Y )检测试验。其中TST是OIE指定也是应用最普遍的牛结核检测方法，但其敏感性和特异性受限。IFN-Y检测法主要检测特异性抗原体外刺激全血后产生的IFN-Y水平，但主要是作为TST的辅助检测手段。两种方法均使用到结核菌素纯化蛋白衍生物(pro)，PPD由分枝杆菌培养物灭活提纯得到，成分复杂，其特异性易受交叉反应影响，经常造成诊断结果的假阳性，给生产带来一些不必要的损失。因此探索特异、敏感的检测抗原对控制牛结核 有重要意义。CFPlO和ESAT6是结核分枝杆菌感染早期细胞介导免疫应答的主要优势抗原成分之一，编码这两种蛋白的基因只存在于结核分枝杆菌复合群(包括人型、牛型、非洲分枝杆菌等)及少数几种其他分枝杆菌中，而所有BCG菌株都缺失这两种基因。因此，这两种蛋白有望成为临床区分牛结核与禽结核感染以及区分自然感染与疫苗免疫的理想诊断抗原。国内外有关该种蛋白在结核病TST和IFN-Y检测试验中的研究均显示其较高的敏感性和特异性。但已有研究多利用大肠杆菌原核表达系统表达，缺少许多蛋白在翻译后所需的磷酸化、糖基化等修饰加工机制。与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，既有生长快、易于培养、遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物对表达的蛋白进行正确加工、修饰、合理的空间折叠等功能，非常有利于高活性蛋白的表达。本发明通过构建真核表达cfplO-esate融合基因的重组毕赤酵母，获得胞外分泌表达的CFP10-ESAT6融合蛋白，其在牛结核病诊断中显示出相对原核表达蛋白更高的敏感性和特异性。
发明内容
本发明为了克服原核表达系统表达蛋白的一些不足，利用酵母系统真核表达重组融合蛋白CFP10-ESAT-6，并将其应用于牛结核病临床诊断，提高检测结果的灵敏度和特异性。本发明所述真核表达的CFP10-ESAT-6蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。该蛋白通过以下方法获得:是通过酵母表达系统进行真核表达和纯化，过程为:将cfpl0-esat6片段插入pCR2.1-T载体转化大肠杆菌DH5 a，经PCR、酶切及测序筛选出阳性克隆；用EcoR I与Xba 1酶切、回收和连接0€ 10-68&丨6与？？102 0 4片段，构建重组质粒pPICZ a A-cfpl0-esat6,转化大肠杆菌DH5 a，筛选阳性克隆并转化毕赤酵母GS115，筛选阳性转化子；甲醇诱导表达重组毕赤酵母，上清液浓缩后进行纯化，并对纯化蛋白进行分析与鉴定，鉴定分析显示所得即为CFP10-ESAT-6蛋白。本发明所述CFP10-ESAT-6蛋白作为刺激原，用于牛结核病临床诊断。该应用是通过以下技术方案达到:(I) CFP10-ESAT-6蛋白的皮内变态反应试验试验操作方法同OIE规定的牛结核皮内变态反应试验操作流程，每头牛CFP10-ESAT-6蛋白注射量为40 u g。(2) CFP10-ESAT-6 蛋白的 IFN- y 检测试验将CFP10-ESAT-6蛋白作为刺激原，工作浓度为5 y g/mL,依照B0VIGAM Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for cattle说明书检测奶牛血衆样品中IFN-Y水平。本发明的优点主要表现在该CFP10-ESAT-6蛋白是通过酵母系统真核表达所得。酵母是低等真核生物，既具有生长快、易培养、遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物对蛋白的加工、修饰和空间折叠等功能，能有效克服大肠杆菌系统的不足，非常有利于高活性蛋白的表达。将本发明的CFP10-ESAT-6蛋白用于牛结核病诊断，其敏感性和特异性均较原核表达的融合蛋白有不同程度的提高。`
图1.目的基因 cfpl0_esat6 的 PCR 扩增(A)、重组质粒 pCR2.l-cfpl0_esat6 (B)和 pPICZ a A-cfpl0-esat6 (C)的 PCR 和酶切鉴定图M.DL2000DNA marker ；1.目的基因 cfpl0_esat6 的 PCR 产物；2 和 4.重组质粒的PCR鉴定；3和5.重组质粒的双酶切鉴定。图2.酵母转化子的筛选鉴定图M.DL2000DNA marker ；1.转化子中目的基因的PCR扩增；2.阴性对照；3.阳性对照。图3.目的蛋白的SDS-PAGE鉴定图M.蛋白质 marker ;1.GS115_pPICZ a A 空载体对照；2.重组菌GS115_pPICZa A-cfpl0_esat6未诱导对照；3.重组菌诱导但未纯化；4.纯化后目的蛋白。图4.目的蛋白分别与抗CFPlO蛋白(A)、ESAT6蛋白(B)、His标签(C)和c-myc标签(D)单克隆抗体的western blotting分析M.蛋白质marker ;1.GS115_pPICZ a A 空载体对照；2.纯化的 CFPl0-ESAT-6 蛋白。
具体实施例方式以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式
加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见SambiOOk等 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edition, 2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ;the seriesMETHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego ;WoIffe，CHROMATIN STRUCTURE ANDFUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego,1998 ；METH0DS IN ENZYM0L0GY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.ffolffe,eds.),Academic Press,San Diego,1999 ;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119, Chromatin Protocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press, Totowa, 1999 等。实施例1:真核表达工程菌的构建1.引物的设计和目的基因的扩增根据本实验室构建并保存的cfplO-eSat6融合基因序列SEQ ID N0.4，结合pPICZ a A载体(Invitrogen公司)特点设计引物。去除cfpl0_esat6融合基因起始密码子和终止密码子，以使多克隆位点上游α信号肽及下游标签的表达。引物序列如下:
Pl (上游引物):5’ -GCGT GAATTCj GCAGAGATGAAGACCGATG-3’ (SEQ ID N0.2)(方框内碱基为限制性内切酶EcoR I识别位点)；P2 (下游引物):-TAAT fTCTAGAAAl TGCGAACATCCCAGTGACG_:V (SEQ ID N0.3)
(方框内带下划线碱基为限制性内切酶Xba I识别位点，为使c-myc和His不移码，加两个碱基AA)。提取本实验室构建并保存的重组菌BL21 (DE3)-pET_30a(+)-1hp-1inker-esat-6质粒DNA经100倍稀释作模板，建立如下PCR扩增体系:模板].0丨止
IOxPCR Buflier(MgCl2)5.0mL
dNTPs (2.5mM)4.0μ
上游引物 Ρ1(10μΜ)Ι.Ομ ,
上游引物 Ρ2( 0μΜ)Ι.Ομ
高保真DNA聚合酶(5U4iL)0.5μΕ
灭菌去离子水补足至50μ PCR 扩增条件-MV 5min，94°C 50s,65°C 45s,72°C lmin，循环 30 次，72。。IOmin0PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果，结果如图1 (A)所示。2.重组载体的构建和鉴定用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因片段，与pCR2.1-T载体(Invitrogen公司)16°C金属浴连接过夜，转化DH5a感受态。挑取白色菌落接种液体LB培养基，PCR和双酶切方法鉴定阳性克隆并测序正确。 测序正确的重组质粒和pPICZaA载体用EcoR I与Xba I双酶切后回收cfpl0-esat6和pPICZ a A片段，连接转化DH5 α感受态，转化产物涂布于低盐LB琼脂(含25 μ g/mL Zeocin)平板，PCR和双酶切筛选鉴定阳性克隆。3.毕赤酵母的转化与鉴定取80yL GS115感受态细胞与5μ g以Sac I单酶切的线性化重组质粒混合，1500V,25yF,200Q的条件下电击转化，用ImL预冷的lmol/L山梨醇悬浮后，将菌体悬液涂布于MD平板上，30°C培养3-5d。取MD平板上正常生长而在丽平板上生长缓慢的菌落点种到含Zeocin浓度100 μ g/mL的YPD平板上，然后将平板上的每个克隆依次转移到含Zcocin浓度为200 μ g/mL、300 μ g/mL、400 μ g/mL的YPD平板上，逐级的筛选高抗性转化子。煮冻煮的方法提取酵母模板，PCR挑选高抗性转化子用于表达。实施例2:重组蛋白的表达、纯化及鉴定1.目的蛋白的诱导表达首先通过诱导条件探索，确定最佳诱导时间为3d，最佳甲醇诱导浓度为1%。接种阳性克隆至25mL BMGY液体培养基，28_30°C，250rpm振荡培养至0D6(I(I=2，1500g室温离心5min，弃上清，用BMMY重悬细胞至0D_ = I，所得菌液置于IL三角瓶中，28-300C，250rpm振荡培养，每24h加甲醇至1.0%浓度，直至第3d，最大速度离心，分离样品的上清液。2.目的蛋白的纯化上述上清液经浓缩后通过His Bind purification kit进行纯化,具体操作按照说明书进行，概括为:安装纯化柱，取5mL树脂填料装入纯化柱，4°C过夜自然沉降；依次加入3vol无菌去离子水、5vol Charge buffer、3vol Binding buffer、样品液、IOvol Bingingbuffer、6vol Wash buffer 和 6vol Elute buffer ;收集 Elute buffer 即为纯化的蛋白溶液。
Bradford法测定纯化蛋白浓度，并进行SDS-PAGE和Westerning blotting分析，结果如图3、4所不。实施例3:CFP10-ESAT-6蛋白用于牛结核皮内变态反应试验首先进行比较变态反应试验，依照OIE牛结核检测比较变态反应试验操作:在牛颈部同侧间隔大约为12-15cm分别注射牛型PH)和禽型PPD，注射前测量注射位点皮肤厚度，注射72h后再次测量相同位置皮厚，计算两次测量的皮厚差。牛型PH)刺激的皮厚差大于禽型pro刺激的皮厚差且超过4mm判为阳性、皮厚差且在l_4mm之间判为可疑，否则判为阴性。目的蛋白的皮内变态反应试验试验，其操作方法同OIE牛结核检测皮内变态反应试验，仅以真核表达的CFP10-ESAT6融合蛋白代替牛型PPD，注射量为每头牛40 u g，测量皮厚差。将两种皮内变态反应试验的结果比较分析，如表I所示:表1.CFP10-ESAT-6蛋白皮内变态反应和比较变态反应的结果比较(单位:头)
权利要求
1.一种用于牛结核病诊断的真核表达CFP10-ESAT-6融合蛋白，其特征在于所述蛋白的氨基酸序列SEQ ID N0.1所示。
2.一种制备权利要求1所述CFP10-ESAT-6融合蛋白的制备方法，其特征在于，是通过酵母表达系统进行真核表达和纯化，过程为:将cfpl0-esat6片段插入pCR2.1-T载体转化大肠杆菌DH5 a，经PCR、酶切及测序筛选出阳性克隆；用EcoR I与Xba I酶切、回收和连接cfpl0_esat6与pPICZ a A片段,构建重组质粒pPICZ a A-cfpl0_esat6,转化大肠杆菌DH5 a，筛选阳性克隆并转化毕赤酵母GS115，筛选阳性转化子；甲醇诱导表达重组毕赤酵母，上清液浓缩后进行 纯化，并对纯化蛋白进行分析与鉴定。
全文摘要
本发明提供了一种用于牛结核病诊断的真核表达CFP10-ESAT-6融合蛋白，并将其应用于牛结核病的临床诊断。通过PCR扩增获得cfp10-esat6融合基因，构建重组质粒pPICZαA-(cfp10-esat6)，转入毕赤酵母菌GS115，经甲醇诱导和亲和层析获得高纯度的CFP10-ESAT-6融合蛋白。将其作为刺激原用于牛结核病诊断的皮内变态反应和抗原特异的牛IFN-γ试验，前者与比较变态反应结果相比具有47.4%敏感性和83.3%特异性，后者与牛IFN-γ试剂盒的阳性和阴性符合率分别为82.8%和87.4%，显示其较好的牛结核病诊断价值。
文档编号C07K19/00GK103204945SQ20131016180
公开日2013年7月17日 申请日期2013年5月3日 优先权日2013年5月3日
发明者焦新安, 陈祥, 孟闯, 时振华, 徐正中, 殷月兰, 孙林 申请人:扬州大学