一种淡水小龙虾swd蛋白酶抑制剂的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂的制备方法，属于基因工程【技术领域】。本发明将淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂基因进行大肠杆菌原核表达，通过蛋白酶抑制剂活性检测试验，SWD蛋白酶抑制剂可以抑制细菌生长繁殖过程产生的蛋白酶的活性，而且具有广谱蛋白酶活性抑制剂作用，其在食品行业的抗菌处理、医药行业的抗菌药物开发等方面具有较大的应用价值。
【专利说明】—种淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂的制备方法，属于基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]在动物进化过程中，随着外界环境不断改变造成的各种挑战，生物体自身的免疫系统在接受各种外界免疫刺激的同时也在不断进化，到目前为止，依据动物体所处进化地位的高低，已经形成了两大类鲜明的免疫系统，一类是较为低等的先天免疫系统，另一类是后天形成的获得性免疫系统。先天免疫系统主要存在于无脊椎动物体内，然而，获得性免疫系统主要存在于高等的脊椎动物体内。对于不具有脊椎的甲壳类动物来说，先天免疫系统是它们防御细菌、真菌、病毒侵染的唯一防线，尤其是先天免疫系统中的细胞免疫和体液免疫两种方式担负着所有的免疫防御功能。[0003]先天免疫系统中的体液免疫方式存在着多种免疫效应分子，其中，抗菌肽分子是一类非常重要的能够针对细菌和真菌的入侵发挥免疫效应的分子，而且，抗菌肽分子也是甲壳类无脊椎动物与免疫反应相关的多种信号通路的最终发挥清除作用的功能分子。目前，发现的抗菌肽分子种类繁多，其中有一类分子的结构比较典型，在其氨基酸序列中存在着一个乳清酸性蛋白结构域，简称WAP结构域，这个结构域的特点就是存在着由8个半胱氨酸残基形成的4对二硫键。根据分子中存在的WAP结构域的个数，我们人为地将其分为具有单个WAP结构域的抗菌肽分子或者称为SWD抗菌肽分子、具有双WAP结构域的抗菌肽分子或者称为DWD抗菌肽分子。
[0004]多数抗菌肽分子不仅可以在甲壳类动物体内发挥清除细菌、真菌的作用，也可以在体外行使抗菌功能以及蛋白酶活性抑制剂作用，因此，其在食品行业的抗菌方面具有非常广阔的应用前景。此外，与目前我国医疗行业广泛使用的抗生素不同，源于甲壳类动物的抗菌肽分子发挥抗菌作用的同时，不会引起耐药性问题，因为抗菌肽分子发挥作用的过程是直接作用于细菌、真菌细胞壁的某一部位的氨基酸序列，从而引起细菌、真菌细胞壁某一部位的水解产生漏洞因而引起细菌、真菌细胞的内溶物外泄，使其死亡而被清除，所以，这类抗菌肽分子在医药行业也存在较大的应用前景。
[0005]淡水小龙虾在我国养殖规模非常大，是一类经济价值较高的水产养殖动物，在科研研究方面也是一个十分典型的甲壳类模式生物。淡水小龙虾的具有单个WAP结构域的抗菌肽分子在动物体内先天免疫系统中是一类重要的免疫效应分子，而且，其抗菌功能与蛋白酶活性抑制剂作用在体外也可以发挥。尤其，SWD抗菌肽分子的蛋白酶活性抑制剂作用在体外可以抑制细菌繁殖过程中产生的蛋白酶的活性，从而将细菌分泌蛋白酶水解环境中的有机物从而获得可吸收的营养物质的途径彻底切断，将细菌活活饿死，而且这种蛋白酶活性抑制剂作用不存在专一性，SffD抗菌肽分子的蛋白酶活性抑制剂作用具有广泛的抑制效果，凡是细菌繁殖过程中产生的蛋白酶的活性都可以被彻底抑制，因而，具有光谱抑制作用。所以，淡水小龙虾SWD抗菌肽分子在食品抗菌、医疗抗生素方面具有良好的应用空间。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂的制备方法，该方法制备的SWD蛋白酶抑制剂能够抑制细菌分泌的蛋白酶的活性。
[0007]技术解决方案:
[0008]本发明的具体方法如下:
[0009]I)淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂的cDNA的克隆与表达片段扩增:取体重约为20g-30g的冷冻保存的淡水小龙虾3只，在实验室超净工作台的无菌条件下，解剖摘取肝脏组织各30mg-50mg,利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA ExtractorCTrizol)动物总RNA快速抽提试剂盒进行总RNA的提取，之后，利用上海生工生物工程有限公司生产的一步法RT-PCR扩增试剂盒(M-MuLV)进行cDNA的反转录合成，并以此cDNA样品作为模板，以表达引物 SWD-F:5' -tac tea gaa ttc cag cgc aca cac tat gct~3'与 SWD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt tea tgc ac~3'作为扩增 SWD 蛋白酶抑制剂表达片段的前后引物进行PCR扩增反应，反应条件优选为:94°C预变性3min，94°C变性30s，53°C退火45s，72°C延伸30s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物；
[0010]2)原核表达载体的构建与转化克隆菌株DH5 a:将步骤(1)的PCR反应产物进行质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳处理，目的条带所在的胶条回收之后利用琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒(美国普洛麦格Promega公司产品)进行片段回收，之后利用EcoR I和Xho I核酸内切酶进行双酶切处理，之后，将经过EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切处理的pET-28a载体(TaKaRa公司产品)在16°C条件下连接10h_12h，连接酶为T4DNA连接酶(TaKaRa公司产品)，之后，将连接产物转化大肠杆菌DH5 a克隆菌株感受态细胞(TaKaRa公司产品)，转化过程利用“热激法”进行转化，将LB固体培养基平板在37°C培养12h-14h，抗性为卡那霉素抗性，获得转化后LB固体培养基平板；
[0011]3)阳性重组子的筛选与质粒提取:挑取步骤(3)的LB固体培养基平板表面的白色菌落作为模板，利用表达引物SWD-F:5/` -tac tea gaa ttc cag cgc aca cac tat gct~3/与SWD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt tea tgc ac~3'作为菌落PCR筛选阳性重组子的PCR反应引物，进行菌落PCR反应，程序为:94°C预变性5min，94°C变性30s，53°C退火45s，72°C延伸30s，循环35圈，后延伸5min，根据PCR结果，将筛选得到的阳性克隆菌株利用LB液体培养基进行摇瓶培养，添加的卡那霉素的最终质量体积浓度为IOOii g/mL，培养温度为37°C，摇床转速为180rpm-200rpm，培养时间为12h_14h，取生长状况良好的大肠杆菌菌株3mL，利用DNA质粒小量提取试剂盒(美国普洛麦格Promega公司产品)进行质粒提取，获得阳性重组质粒；
[0012]4)转化表达菌株BL21 (DE3)与阳性表达菌株的筛选:将步骤(3)的阳性重组质粒利用“热激法”转化大肠杆菌BL21 (DE3)表达菌株感受态细胞(TaKaRa公司产品)，转化过程利用“热激法”进行转化，将LB固体培养基平板在37°C培养12h-14h，抗性为卡那霉素抗性，之后，利用表达引物SWD-F:5/ -tac tea gaa ttc cag cgc aca cac tat gct~3/ 与SffD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt tea tgc ac~3'作为菌落 PCR 筛选阳性表达菌株的PCR反应引物，挑取固体LB培养基表面的白色菌落作为模板，进行菌落PCR反应，程序为:941预变性51^11，941:变性30s，53。。退火45s，72。。延伸30s，循环35圈，后延伸5min，根据PCR结果，将筛选得到的阳性表达菌株利用液体LB培养基3mL_5mL进行摇瓶震荡培养，添加的卡那霉素的最终质量体积浓度为IOOii g/mL，培养温度为37°C，摇床转速为180rpm-200rpm，培养时间为12h_14h，获得表达菌株培养液；
[0013]5) SWD蛋白酶抑制剂分子的诱导表达:将步骤(4)中的表达菌株培养液在无菌条件下吸取lmL，转接在新鲜的IOOmL液体LB培养基中，添加卡那霉素的浓度为100 u g/mL，培养温度为37 °C，摇床转速为180rpm-200rpm，培养时间为3h_4h，之后加入异丙基-P -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，IPTG的最终物质的量浓度为0.5mmol/L,其他条件不变的情况下诱导表达4h-5h之后,5000rpm-6000rpm条件下低速离心收集菌体，菌体沉淀利用IOmL的IXPBS 缓冲液重新悬起之后，冰浴上进行超声波破碎，破碎方法要求为:功率200w,破碎2s,间歇3s,全程60min,破碎后的液体经过10000rpm-12000rpm条件下高速离心收集上清液，获得菌体破碎后上清液；
[0014]6) SWD蛋白酶抑制剂分子的亲和纯化:取步骤(5)的菌体破碎后上清液5mL利用His-tag镍柱(上海生工生物工程有限公司产品)进行亲和纯化，纯化结果利用质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据电泳结果合并目的重组蛋白质所在位置对应的I X elute洗脱液，得到目的重组蛋白质I X elute洗脱合并液；
[0015]7) SWD蛋白酶抑制剂分子的蛋白酶抑制剂活性的检测:将步骤(6)中目的重组蛋白质I X elute洗脱合并液，利用截留孔径为3500Da的透析袋(上海生工生物工程有限公司产品)对I XPBS缓冲液透析24h，12h期间更换一次I XPBS缓冲液，之后将透析后的淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂分子的蛋白透析液进行蛋白酶活性抑制剂检测试验，方法优先:首选选择在生长繁殖过程中能够分泌蛋白酶的细菌，我们选择一种革兰氏阳性细菌一枯草芽孢杆菌和一种革兰氏阴性细菌一绿脓杆菌，在不加抗生素的LB固体培养基上划线37°C过夜培养，然后用经过灭菌的牙签挑去细菌的单克隆，在同一个固体脱脂奶粉培养基上按照十字对角的方式分别接种四个单菌落，在上面覆盖一个经过灭菌的直径为Smm-1Omm的滤纸小圆片，然后，预留一个小圆片作为空白对照，在其他3个小圆片上分别滴加经过滤膜过滤除菌的SWD重组蛋白透析液、过滤除菌的IXPBS缓冲液、过滤除菌的与SWD重组蛋白透析液的蛋白质浓度相同的BSA蛋白溶液，28°C条件下培养10h-12h，观察透明圈出现的情况。
[0016]本发明的优点:利用本发明制备的淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂具有良好的蛋白酶抑制剂活性，可以广泛抑制细菌生长繁殖过程中分泌到细胞外的蛋白酶的活性，从而切断细菌的营养物质的来源，达到抑制细菌生长的作用，其在食品抗菌方面具有较大的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]附图1为重组淡水小龙虾SWD蛋白的诱导表达与亲和纯化的蛋白电泳结果图；
[0018]附图2为重组淡水小龙虾SWD蛋白的枯草芽孢杆菌分泌性蛋白酶活性抑制结果图；
[0019]附图3为重组淡水小龙虾SWD蛋白的绿脓杆菌分泌性蛋白酶活性抑制结果图。【具体实施方式】[0020]实施例1:淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂分子的重组表达与亲和纯化以及酶活抑制剂活性检测
[0021]图1中，I为诱导前大肠杆菌总蛋白，2为诱导后大肠杆菌总蛋白，3为纯化后的重组淡水小龙虾SWD蛋白，4为标准蛋白质分子量。
[0022]图2中，I为滤纸片上不加任何物质的对照，2为加15 ii LlXPBS的对照，3为加15uL BSA蛋白透析液对照，4为加15 ii L重组SWD蛋白透析液。
[0023]图3中，I为滤纸片上不加任何物质的对照，2为加15 ii LlXPBS的对照，3为加15uL BSA蛋白透析液对照，4为加15 ii L重组SWD蛋白透析液。
[0024]方法步骤如下:
[0025]I)淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂cDNA的克隆:取体重约为20g_30g的冷冻保存的淡水小龙虾3只，在实验室超净工作台的无菌条件下，解剖摘取肝脏组织各30mg-50mg，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)动物总RNA快速抽提试剂盒进行总RNA的提取，方法可以参照说明书进行，之后，利用上海生工生物工程有限公司生产的一步法RT-PCR扩增试剂盒(M-MuLV)进行cDNA的反转录合成，方法可以参照说明书进行，并以此cDNA样品作为模板，以表达引物SWD-F:5' -tac tea gaa ttc cag cgcaca cac tat gct~3'与SWD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt tea tgc ac~3'作为扩增SWD表达片段的前后引物进行PCR扩增反应，反应条件为:94°C预变性3min，94°C变性30s，53。。退火45s，72。。延伸30s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物；
[0026]2)原核表达载体的构建与转化克隆菌株DH5 a:将步骤(1)的PCR反应产物进行质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶 电泳处理，目的条带所在的胶条切胶回收之后，利用琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒(美国普洛麦格Promega公司产品)进行片段回收，并且利用EcoRI和Xho I核酸内切酶进行双酶切处理之后，与经过EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切处理的pET-28a载体(TaKaRa公司产品)在16°C条件下连接10h_12h，连接酶为T4DNA连接酶(TaKaRa公司产品)，之后，将连接产物转化大肠杆菌DH5 a克隆菌株感受态细胞(TaKaRa公司产品)，转化过程利用“热激法”进行转化，将LB固体培养基在37°C培养12h-14h，抗性为卡那霉素抗性，获得LB固体培养基平板；
[0027]3)阳性重组子的筛选与质粒提取:挑去步骤(2)中的LB固体培养基平板表面的白色菌落作为模板，利用表达引物SWD-F:5' -tac tea gaa ttc cag cgc aca cac tatgct-31 与 SWD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt tea tgc ac~31 作为菌落 PCR筛选阳性重组子的PCR反应引物，进行菌落PCR反应，程序为:94°C预变性5min，94°C变性30s，53°C退火45s，72°C延伸30s，循环35圈，后延伸5min，根据PCR结果，将筛选得到的阳性克隆菌株利用LB液体培养基进行摇瓶震荡培养，添加的卡那霉素的最终质量体积浓度为100 ii g/mL，培养温度为37°C，摇床转速为180rpm-200rpm，培养时间为12h_14h，之后，取生长状况良好的大肠杆菌菌株3mL，利用DNA质粒小量提取试剂盒进行质粒提取，获得阳性重组质粒；
[0028]4)转化表达菌株BL21 (DE3)与阳性表达菌株的筛选:将步骤(3)中的阳性重组质粒利用“热激法”转化大肠杆菌BL21 (DE3)表达菌株感受态细胞，将LB固体培养基在37°C过夜12h_14h培养，抗性为卡那霉素抗性，利用表达引物SWD-F:5' -tac tea gaa ttccag cgc aca cac tat gct~3'与SWD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt tea tgcac-3/作为菌落PCR筛选阳性表达菌株的PCR反应引物，挑去固体LB培养基表面的白色菌落作为模板，进行菌落PCR反应，程序为:94°C预变性5min，94°C变性30s，53°C退火45s，72°C延伸30s，循环35圈，后延伸5min，根据PCR结果，将筛选得到的阳性表达菌株利用液体LB培养基3mL-5mL进行摇瓶震荡培养，添加的卡那霉素的最终质量体积浓度为100 u g/mL，培养温度为37°C，摇床转速为180rpm-200rpm，培养时间为12h_14h，得到表达菌株培养液；
[0029]5)重组SWD蛋白酶抑制剂分子的诱导表达:将步骤(4)中的表达菌株培养液在无菌条件下吸取lmL，转接在新鲜的IOOmL液体LB培养基中，添加卡那霉素的最终质量体积浓度为IOOii g/mL，培养温度为37°C，摇床转速为180rpm-200rpm，培养时间为3h_4h，之后加入异丙基-P -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，IPTG的最终物质的量浓度为0.5mmol/L,其他条件不变的情况下诱导表达4h_5h之后,5000rpm-6000rpm条件下低速离心收集菌体，收集到的菌体沉淀用无菌的移液器枪头蘸取一小部分，用无菌水40 y L悬起，加入20 y L蛋白质样品处理液之后在沸水域中煮沸5min-10min,冷却后作为质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳的样品使用，聚丙烯酰胺凝胶电泳选择120v电压进行1.5h-2h，并且，将剩余的菌体沉淀保存在4°C冰箱中；
[0030]6)重组SWD蛋白酶抑制剂分子的亲和纯化:取步骤(5)剩余的保存在4°C冰箱中的菌体沉淀利用IOmL的IXPBS缓冲液重新悬起之后，冰浴上进行超声波破碎，超声波破碎的具体方法为:功率200w，破碎2s，间歇3s，全程60min，破碎后的液体经过10000rpm-12000rpm条件下高速离心收集上清液，取上清液5mL利用His-tag镍柱(上海生工生物工程有限公司产品)进行亲和纯化，具体方法为:先用IXPBS缓冲液IOmL反复缓慢冲洗柱子3次-5次，再用试剂盒中的I Xwash溶液5mL洗脱柱子，再用试剂盒中的I Xbinding溶液3mL洗脱柱子，接着将5mL超声波破碎后上清液反复上样3次-5次，目的是为了重组SWD蛋白能够充分结合在柱子上，之后用试剂盒中的IXbinding溶液IOmL洗脱柱子，再用试剂盒中的I X wash溶液6mL洗脱柱子,最后用试剂盒中的I X elute溶液3mL洗脱柱子，并且此时收集洗脱液，目的重组SWD蛋白就在此I X elute洗脱溶液中，纯化结果利用质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，最终根据电泳结果合并目的重组蛋白质所在位置对应的IXelute洗脱液，得到目的重组蛋白质IXelute洗脱合并液；
[0031]7)重组SWD蛋白酶抑制剂分子的蛋白酶抑制剂活性的检测:取步骤(6)中的3mL目的重组SWD蛋白质的I X elute洗脱合并液，利用截留孔径为3500Da的透析袋(上海生工生物工程有限公司产品)对IXPBS缓冲液透析24h，透析温度为4°C，并且，12h期间更换一次IXPBS缓冲液，之后将透析后的淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂分子的蛋白透析液进行蛋白酶抑制剂活性的检测试验，方法为:首选选择在生长繁殖过程中能够分泌蛋白酶的细菌，一种为革兰氏阳性细菌一枯草芽孢杆菌，一种为革兰氏阴性细菌一绿脓杆菌，在不加抗生素的LB固体培养基上划线37°C过夜培养，然后用经过灭菌的牙签挑去细菌的单克隆，在同一个固体脱脂奶粉培养基(配方为1%的脱脂奶粉与1%的琼脂)上按照十字对角的方式分别接种四个单菌落，在上面覆盖一个经过灭菌的直径为Smm-1Omm的滤纸小圆片，然后，预留一个小圆片作为空白对照，在其他3个小圆片上分别滴加经过滤膜过滤除菌的SWD重组蛋白透析液、过滤除菌的IX`PBS缓冲液、与SWD重组蛋白透析液的蛋白质浓度相同的过滤除菌的BSA蛋白溶液，28°C条件下培养10h-12h，观察透明圈出现的情况。[0032]结果显示，重组淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂分子能够充分抑制枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌分泌的蛋白酶的活性，在试验中滴加重组淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂分子的蛋白透析液 的位置都没有出现因为蛋白质水解而产生的透明圈。
【权利要求】
1.一种淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂的制备方法，其特征在于:方法步骤如下: 1)淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂的cDNA的克隆与表达片段扩增:取体重约为20g-30g的淡水小龙虾，在无菌条件下，解剖摘取肝脏组织各30mg-50mg，进行总RNA的提取，之后，进行cDNA的反转录合成，并以此cDNA样品作为模板，进行PCR扩增反应，获得PCR反应产物； 2)原核表达载体的构建与转化克隆菌株DH5a:将步骤(1)的PCR反应产物进行质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳处理，目的条带所在的胶条切胶回收之后利用琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒进行片段回收，利用EcoR I和Xho I核酸内切酶进行双酶切处理，之后，将经过EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切处理的pET-28a载体在16°C条件下连接10h_12h，将连接产物转化大肠杆菌DH5 a克隆菌株感受态细胞，转化过程利用“热激法”进行，获得LB固体培养基平板； 3)阳性重组子的筛选与质粒提取:挑去步骤(2)中的LB固体培养基平板表面的白色菌落作为模板，利用表达引物 SWD-F:5/ -tac tea gaa ttc cag cgc aca cac tat gct~3/与SWD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt tea tgc ac~31 作为菌落PCR筛选阳性重组子的PCR反应引物，进行菌落PCR反应，程序为:94°C预变性5min，94°C变性30s，53°C退火45s，72°C延伸30s，循环35圈，后延伸5min，根据PCR结果，将筛选得到的阳性克隆菌株利用LB液体培养基进行摇瓶震荡培养10h-12h，取生长状况良好的大肠杆菌菌株3mL，利用DNA质粒小量提取试剂盒进行质粒提取，获得阳性重组质粒； 4)转化表达菌株BL21(DE3)与阳性表达菌株的筛选:将步骤(3)中的阳性重组质粒利用“热激法”转化大肠杆菌BL21 (DE3)表达菌株感受态细胞，并且，利用表达引物SWD-F:5' -tac tea gaa ttc cag cgc aca cac tat gct~3/ 与SWD-R:5' -tac tea ctc gag cctgac ctt agt tea tgc ac_3'作为菌落PCR筛选阳性表达菌株的PCR反应引物,挑去固体LB培养基表面的白色菌落作`为模板，进行菌落PCR反应，程序为:94°C预变性5min，94°C变性30s，53°C退火45s，72°C延伸30s，循环35圈，后延伸5min，根据PCR结果，将筛选得到的阳性表达菌株利用液体LB培养基3mL-5mL进行摇瓶震荡培养，得到表达菌株培养液； 5)SffD蛋白酶抑制剂分子的诱导表达:将步骤(4)中摇瓶培养的表达菌株培养液在无菌条件下吸取lmL，转接在新鲜的IOOmL液体LB培养基中，添加卡那霉素最终的质量体积浓度为100 ii g/mL，培养温度为37°C，摇床转速为180rpm-200rpm，培养时间为3h_4h，之后加入IPTG进行诱导表达，IPTG的最终物质的量浓度为0.1mmoI/L-1.0mmoI/L,其他条件不变的情况下诱导表达4h-5h之后,5000rpm-6000rpm条件下低速离心收集菌体,菌体沉淀利用IOmL的IXPBS缓冲液重新悬起之后，冰浴上进行超声波破碎，破碎后的液体经过10000rpm-12000rpm条件下高速离心收集获得上清液； 6)SWD蛋白酶抑制剂分子的亲和纯化:取步骤(5)中的上清液5mL利用His-tag镍柱进行亲和纯化，纯化结果利用质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，最终根据电泳结果合并目的重组蛋白质所在位置对应的IXelute洗脱液，得到目的SWD重组蛋白质I X elute洗脱合并液； 7)SWD蛋白酶抑制剂分子的蛋白酶抑制剂活性的检测:将步骤(6)的目的重组蛋白质I X elute洗脱合并液，利用截留孔径为3500Da的透析袋对I XPBS缓冲液透析24h，12h期间更换一次I XPBS缓冲液，之后将透析后的淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂分子的蛋白透析液进行蛋白酶抑制剂活性的检测试验。
2.根据权利要求1所述的一种淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂的制备方法，其特征在于，淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂表达片段扩增方法，以表达引物SWD-F:5' -tac tea gaattc cag cgc aca cac tat gct~3/ 与SWD-R:5' -tac tea ctc gag cct gac ctt agt teatgc ac-3/作为扩增SWD表达片段的前后引物进行PCR扩增反应，反应条件为:94°C预变性3min，94°C变性 30s，53。。退火 45s，72。。延伸 30s，循环 35 圈，后延伸 5min。
3.根据权利要求1所述的一种淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂的制备方法，其特征在于:淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂活性的检测方法，首选选择在生长繁殖过程中能够分泌蛋白酶的细菌，分别选择革兰氏阳性细菌——枯草芽孢杆菌和革兰氏阴性细菌——绿脓杆菌，在不加抗生素的LB固体培养基上划线37°C过夜培养，然后用经过灭菌的牙签挑去细菌的单克隆，在同一个固体脱脂奶粉培养基上按照十字对角的方式分别接种四个单菌落，在上面覆盖一个经过灭菌的直径为8mm-10mm的滤纸小圆片，然后，预留一个小圆片作为空白对照，在其他3个小圆片上分别滴加经过滤膜过滤除菌的SWD重组蛋白透析液、过滤除菌的I X PBS缓冲液、过滤除菌的与SWD重组蛋白透析液的蛋白质浓度相同的BSA蛋白溶液，28 °C条件下过夜培养10h-12h，观察透明`圈出现的情况。
【文档编号】C07K1/22GK103667330SQ201310403117
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】杜志强, 王金星, 赵小凡, 张雪峰, 王建英 申请人:内蒙古科技大学