一种重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF及其构建和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于水产生物【技术领域】，具体的说是一种重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF及其构建和应用。重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF的氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1中所示。本发明是通过表面展示技术将菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子（RpTNF）展示于安全的微生物解脂耶罗威亚酵母（Yarrowia?lipolytica）上。操作简单，改造后的酵母可直接应用菲律宾蛤仔的水产养殖，可增强养殖动物抗弧菌感染能力，明显提高其存活率。因而实施将其应用在水产养殖领域中。
【专利说明】—种重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF及其构建和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于水产生物【技术领域】，具体的说是一种重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF及其构建和应用。
【背景技术】
[0002]免疫增强剂是指能够促进或诱发宿主防御反应，增强生物机体抗病能力的一类物质。因其具有安全、广谱、高效、无毒、无污染、低成本等诸多优点，目前已在畜牧养殖中作为饲料添加剂广泛应用。但快速发展的水产养殖业所需的免疫增强剂的开发和应用仍处于起步阶段，其中较为关键的就是解决活性物质的导入技术和应用方法的难题。
[0003]表面展示(Surface display)技术是一种较新的基因工程技术,它使表达的外源肽或蛋白质以融合蛋白形式展现在噬菌体或细胞的表面，被展示的多肽或蛋白质可以保持相对独立的空间结构和生物活性，借以研究多肽(蛋白质)的性质、相互识别和作用等。目前利用酵母菌进行表面展示的技术已发展相对成熟，其中利用酒精酵母表面展示的系统已经完全商品化。
[0004]TNF是机体免疫调控的关键组分,其功能活性包括诱发细胞凋亡、介导细胞毒反应、提闻吞曬细胞吞曬活性、诱导相关细胞因子和免疫效应物质的表达等多种功能，在机体的正常或病理条件下均发挥着重要的调控作用。
【发明内容】
[0005]本发明目的在于提供一种重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF及其构建和应用。
[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0007]一种重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF，重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1中所示。
[0008]进一步的说，通过表面展示技术将菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子(RpTNF)展示于解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)上，即得到具有序列表SEQ ID N0.1中氨基酸序列的重组蛋白RpTNF菌株。
[0009]所述表面展示过程为:
[0010]1)以菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子(RpTNF)编码区为模板，采用Pl和P2为引物进行PCR扩增，待用；
[0011]2)PCR扩增产物与？1?181载体通过T4连接酶连接，而后将连接产物与经HindIII，BamHI双酶切后表面展示载体连接；
[0012]3)将上述构建连接载体转入解脂耶罗维亚菌株中进行诱导培养，经免疫荧光检测，即得到具有序列表SEQ ID N0.1中氨基酸序列的重组蛋白RpTNF菌株；
[0013]所述引物分别Pl (5’-CGCAAGCTTCTCACTGGAAAGGAACAAC-3’)和 P2 (5’-CGCGGATCCGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAAATAATTGTCCCTTGTGTA-3’)。
[0014]所述重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF可作为抗弧菌感染的免疫增强剂。
[0015]所述重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF可作为提高菲律宾蛤仔存活率的免疫增强剂。
[0016]本发明所具有的优点:
[0017]本发明利用表面展示(Surface display)技术获得重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子(RpTNF)，经表面展示的重组RpTNF酵母菌可直接应用，不需要经过提纯，应用方式简单，且具有激活机体免疫，增加抗细菌感染能力，提高宿主的存活率等多重效果。
[0018]本发明是通过表面展示技术将菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子(RpTNF)展示于安全的微生物解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)上。操作简单,改造后的酵母可直接应用菲律宾蛤仔的水产养殖，可增强养殖动物抗弧菌感染能力，明显提高其存活率。因而实施将其应用在水产养殖领域中。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本发明实施例提供的不同剂量RpTNF酵母提高菲律宾蛤仔弧菌感染后存活率的情况图。
【具体实施方式】
[0020]下面的实验例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
[0021]实验例I
[0022]菲律宾蛤仔RpTNF酵母表面展示氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1中所示。
[0023]SEQ ID N0.1
[0024]MKPAAKLTGKEQPDLRKTDSNADMVPIREWRNGRELYDTKGFIRYGIRYRNGRLVVPVDGTYFI
[0025]YSNIDFFESCNPSSGLPDIKDINKPIKHGIFKFNILEGEENELVSNVQPHTISTNRYYNSYSSY
[0026]VSSLAELKAGDELSVKVSNITYIRYTRDNYFGVNLI
[0027]序列特征: [0028]长度:164个氨基酸
[0029]类型:蛋白
[0030]链型:单链
[0031]拓扑结构:线形
[0032]特性:编码的成熟多肽分子量为18.86kDa，等电点为8.54，具有一个完整的THD结构域。
[0033]来源:菲律宾給仔Ruditapes phiIippinarum
[0034]菲律宾蛤仔RpTNF酵母表面展示的载体构建:
[0035]1.重组载体的构建:
[0036]本发明中采用酵母菌表面展示的表达载体的具体信息参见文献(Yue L, ChiZj WangLj Liu Jj Madzak C，Li Jj Wang X:Construction of a new plasmid for surfacedisplay on cells of Yarrowia lipolytica.J Microbiol Methods 2008，72:116-123)。
[0037]通过PCR技术，使用5’末端分别添加了 HindIII，BamHI特定酶切位点的基因特异性引物 PI (5 ’ -CGCAAGCTTCTCACTGGAAAGGAACAAC-3 ’)和 P2 (5 ’ -CGCGGATCCGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAAATAATTGTCCCTTGTGTA-3’ )扩增菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子(RpTNF)基因含THD结构域的编码区片段。
[0038]反应条件为:首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环:94°C变性30秒，58°C退火30秒，72 °C延伸I分钟，共进行35个循环，最后72°C延伸10分钟。
[0039]将PCR产物纯化回收，与pMD18-T载体连接。转化后，挑取单克隆利用上述载体引物进行菌落PCR筛选并测序，验证测序正确后用质粒提取试剂盒提取阳性克隆质粒(大连宝生物工程有限公司)，待用；使用Hindlll，BamHI双酶切亚克隆质粒，用胶回收纯化试剂盒(大连宝生物工程有限公司)对酶切产物纯化回收；纯化片段与经HindIII，BamHI双酶切的酵母表面展示载体连接，完成载体的构建。
[0040]2.目的蛋白的表面展示:将上述构建的重组载体和空载体转化到解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica),挑取单克隆,经测序验证读码框正确,如序列表SEQ ID N0.1中氨基酸所示的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子(RpTNF)。将单克隆接种于200mL PBB液体培养基中，28°C震荡摇床中培养3-5天，然后取50 μ L涂片于多聚赖氨酸包被的载玻片上，通过免疫荧光的方法检测RpTNF在酵母菌的表达情况。载玻片上的酵母菌依次通过5%脱脂奶粉37°C封闭I小时，RpTNF多克隆抗体(RpTNF多克隆抗体参见如下文献中的记载进行构建，Cheng SF, Zhan WB, Xing J, Sheng XZ:Development and characterization of monoclonalantibody to the lymphocystis disease virus of Japanese flounder Paralichthysolivaceus isolated from China.Journal of Virological Methods 2006, 135:173-180)在37°C孵育30分钟，Invitrogen Axla488标记的突光抗体(Invitrogen公司的产品,抗体标记Axla488荧光蛋白)在37°C孵育30分钟后，利用荧光显微镜在488nm的激发波长下观察RpTNF在酵母菌表面的表达情况，酵母菌表面呈现绿色荧光，即得到具有序列表SEQ IDN0.1中氨基酸所示的栉孔扇贝肽聚糖识别重组蛋白RpTNF的菌株，进而表明RpTNF已被正确表达，并成功展不于细胞表面。
[0041]实施例2
[0042]表面展示RpTNF重组酵母提高提高菲律宾蛤仔抗弧菌感染的能力
[0043]实验中将蛤仔随机分为6组，除了每天投喂单胞藻饲料(？？)外，还按照以下设定添加上述展示的酵母菌:第1-3组分为投喂 含有RpTNF的上述展示的酵母菌，第4组投喂不含任何插入片段的IO5Cfu mL-1空白酵母菌，第5和6组不投喂酵母菌。每组有三个平行，每个平行含有28只蛤仔。第6天时，第1-5组加入IO6Cfuml/1.鳗弧菌，每日观察蛤仔的死亡率。实验结果如图1所示，10天后RpTNF酵母投喂组蛤仔的存活率明显高于空白和对照组，中剂量的RpTNF酵母投喂组的死亡率小于高剂量和低剂量组，且几乎没有死亡的蛤仔，显示了较强的免疫保护作用
[0044]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF，其特征在于:重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1中所示。
2.按权利要求1所述的重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF的构建方法，其特征在于: 通过表面展示技术将菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子(RpTNF)展示于解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia Iipolytica)上，即得到具有序列表SEQ ID N0.1中氨基酸序列的重组蛋白RpTNF菌株。
3.按权利要求2所述的重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF的构建方法，其特征在于: 所述表面展示过程为: O以菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子(RpTNF)编码区为模板，采用Pl和P2为引物进行PCR扩增，待用； 2)PCR扩增产物与pMD18-T载体通过T4连接酶连接，而后将连接产物与经Hindlll，BamHI双酶切后表面展示载体连接； 3)将上述构建连接载体转入解脂耶罗维亚菌株中进行诱导培养，经免疫荧光检测，即得到具有序列表SEQ ID N0.1中氨基酸序列的重组蛋白RpTNF菌株； 所述引物分别 Pl (5，-CGCAAGCTTCTCACTGGAAAGGAACAAC-3，)和 P2 (5，-CGCGGATCCGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAAATAATTGTCCCTTGTGTA-3，)。
4.按权利要求1所述的重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF的应用，其特征在于:所述重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF可作为抗弧菌感染的免疫增强剂。
5. 按权利要求4所述的重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF的应用，其特征在于:所述重组的菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF可作为提高菲律宾蛤仔存活率的免疫增强剂。
【文档编号】C07K14/525GK103467589SQ201310408959
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日
【发明者】宋林生, 邱丽梅, 刘瑞, 岳峰, 孙瑞, 蒋秋芬, 杨传艳, 衣启麟 申请人:中国科学院海洋研究所