微拟球藻NgAUREO1基因在调控脂肪酸代谢中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明克隆了微拟球藻(Nannochloropsis gaditana)的一个2080bp的蓝光诱导的bZIP类转录因子(NgAUREO1)的全长。该基因包括一个1398bp的ORF，192bp的5’端非编码区和490bp的3’端非编码区，编码465个氨基酸。该基因含有一个bZIP结构域可以结合到特定基因的启动子区域，从而调控特定基因的表达；以及一个LOV结构域可以感受470nm左右的蓝光，进而赋予该基因受蓝光调控的特性。该基因与无隔藻中的aureochromel基因的氨基酸序列相似性为59％。我们构建了该基因的酵母表达载体，并将此基因导入酿酒酵母中，提高了酵母的油脂含量。通过对重组酵母进行蓝光刺激证明了该基因可以蓝光作为开关调节其参与脂肪酸代谢的途径。
【专利说明】微拟球藻NgAUREOI基因在调控脂肪酸代谢中的应用 一、
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及从微拟球藻中克隆了一个新的编码区为1398bp的受蓝光调节的转录 因子相关基因（NgAUREOl)，并证明了该基因在调节脂肪酸代谢中的新功能。 二、
【背景技术】：
[0002] 随着当今世界能源危机的日趋严重，人们已经逐步把目光从传统的石油化工燃 料，转向生物质能源上。然而生物体油脂含量的高低是影响生物质能源发展的关键问题之 一。已经有许多科学家在这一问题上做了大量的研究。有的通过筛选油脂含量相对较高的 生物体作为原料，但仍无法满足生物质能源的需求；有的将生物体置于缺氮、低温等逆境中 以促进生物体油脂含量的增高，但是这必然导致生物量的降低；还有人提出通过基因工程 对生物体进行改造，使其可以大量积累油脂，然而实验结果多数不尽人意。究其原因主要是 所利用的基因多为调控单一通路的功能基因，其调控范围窄，影响能力弱，从而无法达到理 想的效果。
[0003] 转录因子也称反式作用因子，是指能够与基因启动子区域中顺式作用元件发生特 异性相互作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其他相关蛋白之间的相互作用可以激 活或抑制某些基因的转录。与基因技术定位于改造单个基因不同，转录因子技术影响一系 列基因的多条代谢路径，这些代谢路径在同时作用下完成正向或者负向的调控。目前这一 技术已经被证实可以促进次生代谢产物在植物细胞中的积累。
[0004] Aureochromel于2007年从无隔藻中被发现，研究表明该基因编码的蛋白具有转 录因子功能，可以特异性的结合TGACGT序列。这一序列是典型的S型或D型bZIP的结合位 点。该基因由一个碱性亮氨酸拉链结构域（bZIP)和一个感受蓝光的LOV结构域组成。正 是由于这一特殊的结构赋予了该转录因子受蓝光诱导的特性。研究表明，该基因控制着无 隔藻的分支发育活动。然而未有研究证明该基因具有其他功能。
[0005] 我们从微拟球藻（Nannochloropsis gaditana)中克隆了一个新的蓝光诱导的 bZIP类转录因子，并命名为NgAUREOl。该基因所编码的蛋白具有一个bZIP结构域用于结 合目的基因启动子区的特异性序列，以及一个可以感受波长为470nm的蓝光的LOV结构域。 该基因与无隔藻中aureochromel的氨基酸序列相似性为59%。我们构建了该基因的酵母 表达载体并将此转录因子导入酿酒酵母中，通过测定酵母脂肪酸的含量，证明了该转录因 子可以促进酵母细胞内油脂含量的增加。我们还通过对转有该基因的酿酒酵母进行蓝光照 射，并测定脂肪酸含量，证明了蓝光可以控制该转录因子参与脂肪酸的合成与分解。 三、
【发明内容】
：
[0006] 1、克隆了微拟球藻中的蓝光诱导转录因子NgAUREOl
[0007] 从本实验室所建立的微拟球藻转录组数据库中找到aureochromel基因的片段， 根据该片段设计了两对基因特异性引物（5GSP1，5GSP2和3GSP1，3GSP2)。利用TransZol Plant total RNA提取试剂盒提取微拟球藻RNA，用TransScript RT反转录试剂盒反转录形 成cDNA，通过PCR扩增得到NgAUREOl基因的全长，连接到pMD19-T载体上，导入感受态大肠 杆菌，挑选阳性克隆菌株进行菌液PCR鉴定。最后将带有目的基因片段的大肠杆菌送上海 生工测序。测序结果表明该基因的ORF为1398bp ;5'端非编码区为192bp ;3'端非编码区 为490bp，编码465个氨基酸。将测序结果与无隔藻中aureochromel基因的序列进行相似 性比较，发现微拟球藻中的aureochromel基因编码的氨基酸序列与无隔藻中相应基因编 码的氨基酸序列有59 %的同源性。将这个蛋白序列进行BLAST分析，显示该蛋白的241-300 位氨基酸为一个bZIP转录因子结构域；341-444位氨基酸为一个可以感受蓝光的LOV结构 域。以上分析说明该基因为微拟球藻中的一类新的可以感受蓝光的bZIP类转录因子，命名 为 NgAUREOl。
[0008] 2、构建了 NgA UREOl基因的酵母表达载体pYES2-NgAURE01
[0009] 设计一对带有HindIII和SacI限制性酶切位点的引物（P1，P2)以微拟球藻cDNA 为模板扩增NgAUREOl基因，并将扩增产物纯化后连接到pMD19-T载体上，导入大肠杆菌中 进行繁殖。提取质粒利用HindlII和SacI限制性酶对pMD19-T和pYES2同时进行双酶切， 分别获取小片段和大片段，利用T4连接酶进行连接后转化大肠杆菌并进行PCR和酶切鉴定 后得到重组质粒pYES2-NgAURE01。
[0010] 3、证明了该基因可以促进脂肪酸积累的新功能
[0011] 分别将构建好的重组质粒pYES2-NgAURE01和空质粒PYES2,分别通过电击的方法 转化进入酿酒酵母细胞内。利用2%的半乳糖进行诱导，测定两者的油脂含量。实验表明， 转pYES2-NgAURE01质粒的酵母细胞的油脂含量比转空质粒pYES2的酵母细胞的油脂含量 要高。这表明了，NgAUREOl是一类可以促进细胞积累油脂的转录因子。本发明首次证明了 微拟球藻aureochromel基因具有积累油脂的功能，提示本发明的基因 NgAUREOl可以用于 微藻乃至其他各类生物质能源材料的遗传改造，从而获得高油脂含量的生物原料。对于开 发生物质能源具有重要的理论意义和实际意义。
[0012] 4、证明了 NgAUREOl基因可以蓝光作为开关进行脂肪酸代谢的调节
[0013] 将两组重组酵母先置于黑暗条件下诱导培养两天，然后给其中一组进行48小时 的蓝光刺激，另一组则保持在黑暗条件下。利用尼罗红染色法测定这两组酵母的油脂含量。 结果表明，在蓝光刺激后酵母的油脂含量明显降低，而再转移到黑暗条件下时，酵母的油脂 含量又会有所上升。提示本发明的基因 NgAUREOl可以在蓝光的控制下调节脂肪酸含量。
[0014] 四、附图简要说明：
[0015] 图1是表示酵母表达载体pYES2-NgAURE01构建流程的图。
[0016] 图2是重组酵母的PCR鉴定。
[0017] 图中扩增条带大小约为1400bp，电泳带从左到右分别编号为1、2、3、M。1-3为阳 性克隆，M为分子标记Marker。
[0018] 图3是酿酒酵母在不同时间段的尼罗红荧光值。
[0019] 横坐标为时间，纵坐标为荧光值。转PYES2的酿酒酵母表示为▲;转 pYES2-NgAURE01的酿酒酵母表示为·。
[0020] 图4是转PYES2与转pYES2-NgAURE01的酿酒酵母的油脂含量。
[0021] 纵坐标为油脂占酵母干重的质量百分比。
[0022] 图5是转pYES2_NgAURE01的酿酒酵母在蓝光与黑暗条件下的尼罗红荧光值。
[0023] 横坐标为时间，纵坐标为荧光值。▲表示在诱导第二天后进行48小时的蓝光刺 激，再转入黑暗中；表示在黑暗条件下诱导7天的油脂含量。 五、【具体实施方式】：
[0024] 所有实施例中的微生物培养和DNA操作均参考《分子克隆实验指南》（黄培堂等 译，科学出版社，北京（2002))和《精编分子生物学指南》（颜子颖等译，科学出版社，北京 (1998))。分子操作中的工具酶如限制性内切酶均购自Takara公司。
[0025] 实施例INgAUREOl基因的克隆
[0026] 从本实验室所建立的微拟球藻转录组数据库中找到aureochromel基因的片段， 根据该片段设计了两对基因特异性引物（5GSP1，5GSP2和3GSP1，3GSP2)。利用TransZol Plant total RNA提取试剂盒提取微拟球藻RNA，用TransScriptRT反转录试剂盒反转录形 成cDNA，通过PCR扩增得到NgAUREOl基因的全长。引物序列如下：
[0027] 5GSP1 :5'-GCTTCCTTGTTCAGTTCCTTCG-3'
[0028] 5GSP2 :5'-CAACCACTACCTCCGCCTCA-3'
[0029] 3GSP1 :5'-TACATCTGGCACTACGGGGC-3，
[0030] 3GSP2 :5'-GCTAACACCGACGCTCAAACT-3，。
[0031] 将通过PCR扩增出来的NgAUREOl产物，经纯化回收，连接到pMD19-T载体上，送上 海生工进行序列测定。测序结果表明该基因的ORF为1398bp ;5'端非编码区为192bp ;3' 端非编码区为490bp，编码465个氨基酸。将测序结果与无隔藻中aureochromel基因的序 列进行相似性比较，发现微拟球藻中的aureochromel基因编码的氨基酸序列与无隔藻中 相应基因编码的氨基酸序列有59%的同源性。将这个蛋白
[0032] 序列进行BLAST分析，显示该蛋白的241-300位氨基酸为一个bZIP转录因子结构 域；341-444位氨基酸为一个可以感受蓝光的LOV结构域。以上分析说明该基因为微拟球 藻中的一类新的可以感受蓝光的bZIP类转录因子，命名为NgAUREOl。
[0033] 微拟球藻RNA的提取：
[0034] (1)向f/2液体培养基中接入微拟球藻，在25°C，光照强度80001x，光暗比为 12h/12h的条件下培养至指数生长后期；
[0035] (2)取Iml藻液于I. 5ml离心管中，离心收集，在液氮中研磨；
[0036] (3)加入Iml TRIzon，反复吹打几次，使样本充分裂解。室温放置5分钟，使蛋白 核酸复合物完全分离；
[0037] (4)向以上溶液中加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2-3分钟；
[0038] (5)4°C 12000rpm离心15分钟，此时样品分为三层：红色有机相，中间层和上层无 色水相，RNA主要在水相中，把水相转移到一个新的Rnase-Free离心管中；
[0039] (6)在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟；
[0040] (7) 4°C 12000rpm 离心 10 分钟，弃上清；
[0041] (8)加入lml75%乙醇洗涤沉淀；
[0042] (9) 4°C 12000rpm离心3分钟，小心吸弃上清；
[0043] (10)室温放置2-3分钟，晾干。加入30 μ 1的无 Rnase的水，充分溶解RNA ;
[0044] 细菌质粒 DNA 的制备（根据 Ε. Ζ. Ν. A. ? Plasmid Miniprep Kit):
[0045] (1)挑取单菌落接种于含适当抗生素的LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜；
[0046] (2)取I. 5ml菌液于离心管中，IOOOOrpm离心60秒；
[0047] (3)菌体沉淀重悬于250 μ 1溶液I中，振荡混匀并静置数分钟；
[0048] (4)加入250 μ 1溶液11颠倒混勻，静置2分钟；
[0049] (5)加入350 μ 1的溶液III颠倒混匀直到生成白色絮状沉淀；
[0050] (6) 13000rpm 离心 10 分钟；
[0051] (7)将上清转移至干净的 HiBind Miniprep Column (I)中；IOOOOrpm 离心 1 分钟；
[0052] (8)去除液体，向 HiBind Miniprep Column (I)中加入 500 μ 1 的缓冲液 HB, IOOOOrpm离心1分钟；
[0053] (9)去除液体，加入700 μ 1的DNA冲洗缓冲液，IOOOOrpm离心1分钟；
[0054] (10)去除液体，将空管在13000rpm的条件下，离心2分钟；
[0055] (11)将 HiBind Miniprep Column (I)置于新的 I. 5ml 的离心管上，加入 30 μ 1 的 无菌水，放置2分钟，13000rpm离心1分钟，获得DNA ;
[0056] (12)以上说用试剂均购置于OMEGA公司。
[0057] 质粒酶切条件：
[0058] 3(^1反应体系中，加入10父酶切缓冲液3 4 1，0嫩1-5以8，限制性内切酶14 1， 加无菌双蒸水补至30 μ 1，37°C反应1个小时，琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
[0059] DNA片段的回收（根据AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒）：
[0060] (1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切 碎。计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积（如IOOmg=IOOy 1);
[0061] (2)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混匀后于75°C加热，间断混合，直至凝胶块 完全熔化；
[0062] (3)加入 0· 5 个 BufferDE-A 体积的 BufferDE-B，混匀；
[0063] (4)吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管中，12000rpm离心1分钟。弃滤 液；
[0064] (5)将制备管置回2ml离心管，加500 μ I BufferWl，12000rpm离心30秒，弃滤液；
[0065] (6)将制备管置回21111离心管，加70(^181^€61^2，12000印111离心30秒，弃滤液 ；
[0066] (7)将制备管置回2ml离心管，12000rpm离心1分钟；
[0067] (8)将制备管置于洁净的I. 5ml离心管中，在制备膜中央加入25 μ 1的去离子水， 室温静置1分钟。12000
[0068] rpm离心1分钟洗脱DNA。
[0069]连接：
[0070] 10 μ 1反应体系中加入5 :1比例量的插入片段和载体片段，1μ 1的T4DNA连接酶， 16 °C放置10个小时左右。
[0071] 感受态细胞的转化：
[0072] (1)取100μ 1感受态细胞（购置于全式金公司）加5μ 1连接产物，轻轻混勻，冰 置30分钟；
[0073] (2)于42°C水中热激90秒，迅速置于冰上冷却2分钟；
[0074] (3)加200 μ I LB液体培养基，37°C振荡培养1个小时；
[0075] (4)均匀涂布于含有适当抗生素的LB平板上，37°C倒置培养过夜。
[0076] 重组质粒的筛选与鉴定：
[0077] a.酶切鉴定：挑取单菌落于含有适当抗生素的LB液体培养基中，37°C培养过夜提 取质粒DNA，用适当限制性内切酶进行酶切以判断是否为阳性克隆；
[0078] b. PCR检测：以质粒DNA为模板，用特定引物在适当条件下做PCR扩增反应，电泳 检测是否有特异条带。
[0079] 实施例2酵母表达载体pYES2-NgAURE01的构建：
[0080] 将 NgAUREOl 基因连接到 pMD19-T 载体上，并命名为 ρΤ-NgAUREOl。将 pT-NgAUREOl 用HindlII和SacI进行酶切，回收小片段，同时将pYES2用HindlII和SacI酶切，回收 大片段，连接小片段和大片段，转化大肠杆菌感受态细胞并进行PCR和酶切鉴定后得到 pYES2-NgAURE01。
[0081] 操作过程中有关质粒提取、酶切、回收、连接、细胞转化、重组质粒的酶切鉴定和 PCR鉴定均按照实施例1所述步骤进行。
[0082] 实施例3酿酒酵母的遗传转化：
[0083] 酵母感受态细胞的制备：
[0084] (1)将酿酒酵母接种到IOOml的YPD培养基中30°C过夜，250rpm，至密度达到 I X108cells / ml ；
[0085] (2)将细胞置于冰浴上15分钟停止生长；
[0086] (3)将细胞分装于2个灭菌的250ml离心管中，4°C 3000rpm离心5分钟；
[0087] (4)去除上清，将离心管置于冰上；
[0088] (5)加50ml的灭菌冰冷的水，涡旋重悬，每个离心管中定容到50ml，4°C 3000rpm 离心5分钟；
[0089] (6)用25ml的灭菌冰冷的水按（5)重复操作；
[0090] (7)加4ml的灭菌冰冷的IM山梨醇重悬细胞并转到冰的30ml离心管中， 4°C 3000rpm离心5分钟，弃上清；
[0091] (8)加入0. 5ml灭菌的冷的IM山梨醇重悬细胞，细胞体积定量到I. 3ml，细胞浓度 达到 lXIOlOcells / ml。
[0092] 酿酒酵母的转化：
[0093] (1)加入10 μ I DNA样品置于I. 5ml离心管中，置于冰上预冷；
[0094] (2)加入80 μ 1感受态细胞与DNA样品轻轻混匀并于冰上5分钟；
[0095] (3)将DNA与细胞混合物转到规格为0. 2cm的电转杯中，置于冰上冷冻，放入设备 中，进行电击；
[0096] (4)直接将Iml的冰冷的IM山梨醇加入电转杯中，并轻轻的转移到灭菌的管中；
[0097] (5)将电转化产物涂布于含有IM山梨醇的琼脂平板上，于30°C培养48-72小时。
[0098] 实施例4重组酵母的鉴定与检测
[0099] 用灭菌的牙签沾取实施例3中平板上生长出的单菌落，加入到PCR反应液中，以合 成的NgAUREOl基因的特异性引物
[0100] Pl：TGCAAGCTTAAAATGTCTACCACCACCAT
[0101] P2 ：CGAGCTCTTATTCTTCTTCGTCAAAGTTG
[0102] (上述序列中划线部分分别为HindIII和SacI酶切位点）
[0103] 进行PCR扩增，可以得到约HOObp的条带，说明NgAUREOl基因已转入酿酒酵母 中。（见图2:重组酵母的PCR鉴定）
[0104] 实施例5重组酵母脂肪酸的测定
[0105] 尼罗红染色法测定中性脂含量：
[0106] (1)将重组酵母与转有空质粒的酵母接入诱导培养基中，加2%的半乳糖进行诱 导；
[0107] (2)取不同时间段的酵母1ml，加入50 μ 1的二甲基亚砜，混匀；
[0108] (3)加入10 μ 1的0. lg/Ι的尼罗红溶液，避光静置5分钟；
[0109] (4)在激发波长为488nm，发射波长为616nm的条件下测定菌液的突光值，此突光 值反映着中性脂的含量。
[0110] 结果显示，在诱导第3天时，荧光值达到最高，并且重组酵母的荧光值明显高于转 空质粒的酵母。（见图3 :酿酒酵母在不同时间段的尼罗红荧光值）
[0111] 菌体油脂提取及含量测定：
[0112] (1)将诱导3天的培养液经3000rpm离心15分钟，收集菌体，冷冻干燥24小时，称 重；
[0113] (2)每克菌体加入6ml4M的盐酸，振荡混匀，室温下放置30分钟；
[0114] ⑶转入沸水浴3分钟，_2〇°C速冷；
[0115] (4)加入IOml的氯仿：甲醇（1 :1)，充分振荡后，3000rpm离心15分钟；
[0116] (5)取氯仿层，加入等体积0· 1%的氯化钠溶液，混勻，3000rpm离心15分钟；
[0117] (6)用已知重量的试管收集氯仿层，挥发除去氯仿层，称重，得到的油脂产量。
[0118] 结果显示，转pYES2-NgAURE01的酿酒酵母的油脂含量比转pYES2的酿酒酵母的油 脂含量要高27. 8%。（见图4 :转pYES2与转pYES2-NgAURE01的酿酒酵母的油脂含量）
[0119] 实施例6重组酵母在蓝光刺激下脂肪酸的测定
[0120] 将两组重组酵母先置于黑暗条件下诱导培养两天，然后给其中一组进行48小时 的蓝光刺激，另一组则保持在黑暗条件下。利用尼罗红染色法测定这两组酵母的油脂含量。 结果表明，在蓝光刺激后酵母的油脂含量明显降低，而再转移到黑暗条件下时，酵母的油脂 含量又会有所上升。这表明，蓝光可以控制NgAUREOl在脂肪酸代谢中的作用。（见图5:转 pYES2-NgAURE01的酿酒酵母在蓝光与黑暗条件下的尼罗红荧光值）
[0121] 操作过程中尼罗红测定中性脂按照实施例5中所述步骤进行。
【权利要求】
1. 从微拟球藻中克隆的编码区为1398bp的受蓝光诱导的转录因子基因 NgAUREOl，该 基因的特征在于：该基因编码一条由465个氨基酸组成的蛋白，该蛋白由一个N端的碱性亮 氨酸拉链（bZIP)和一个C端的L0V感光结构域组成。
2. 根据权利要求1所述的基因，该基因所编码的氨基酸序列与无隔藻中的 aureochromel基因所编码的氨基酸序列具有59%的同源性，无隔藻中该基因的GenBank登 陆号 gi 1158853253 | dbj | BAF91488. 1。
3. 根据权利要求1所述的基因，该基因可用于构建成适合在酿酒酵母中表达NgAUREOl 基因的酵母表达载体pYES2-NgAURE01。
4. 根据权利要求3所述的酵母表达载体pYES2-NgAURE01，该酵母表达载体的特征 在于：驱动NgAUREOl基因的启动子为半乳糖启动子（GAL1)，终止子为CYC1，筛选标记为 Ampicillin抗性基因。
5. 根据权利要求3所述的酵母表达载体pYES2-NgAURE01，该载体可通过电击转化法导 入酵母细胞，生长出含有目的基因 NgAUREOl的转基因酵母。
6. 权利要求1所述的NgAUREOl基因在调节脂肪酸代谢中的应用。
7. 权利要求1所述的NgAUREOl基因在光遗传学中的应用。
【文档编号】C07K14/405GK104419711SQ201310428941
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月9日 优先权日:2013年9月9日
【发明者】郑明刚, 黄一江, 王玲, 郑立, 李妍, 仝颜丽, 赵燕燕, 王春, 周晓丽 申请人:郑明刚, 黄一江, 王玲