欧美杨PdHARDY基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一个欧美杨（Populus?deltoides×Populus?nigra）的逆境相关基因PdHARDY，该基因在植物抗盐过程中有重要作用，本发明将提供的基因命名为PdHARDY，其具有与序列表中的SEQ?ID?NO：3所示的碱基序列。本发明的抗逆相关基因PdHARDY在构建到表达载体pCAMBIA1304中时，在其转录起始核苷酸前加上启动子，同时加入可选择标记GFP以便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定和筛选，携带有本发明的逆境相关基因PdHARDY的表达载体可以通过多种方法转化植物宿主，用于培育抗盐的植物品种；本发明所述的基因在培育抗盐植物中具有广泛的应用前景。
【专利说明】欧美杨PdHARDY基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种来自欧美杨(Populusdeltoides XPopulus nigra)的 PdHARDY 基因及其应用。
【背景技术】
[0002]欧美杨(Populus deltoides XPopulus nigra)是中讳度地区最适合种植的短轮伐期工业用材集约经营树种之一。近年来我国引进了许多优良的欧美杨无性系用于营造大面积的速生丰产林并取得很好的经济和社会效益。但高盐等限制了其进一步的推广。因此，要将其引入高盐缺水地区时，筛选和培育抗盐的品系是前提。随着分子生物学的发展，利用分子生物学技术研究欧美杨抗盐分子机制已成为解决这一问题的重要途径，目前已有多个基因被发现与提高杨树的抗逆性有关。Karaba发现拟南芥抗旱相关的转录因子HARDY转入水稻后，转基因水稻光合速率增强，蒸腾速率下降，从而使得水分利用效率提高。转基因水稻在水分条件合适的情况下，产量明显提高(大约50%);干旱处理下，这种现象更为明显，转HARDY基因水稻产量相对于野生型提高了大约60%。因此该基因在其他植物上的研究与探讨值得期待。但该基因在欧美杨的研究还未见报道。
【发明内容】
[0003]本发明为解决现有技术中存在的上述问题，提供欧美杨中一种与逆境相关的bZIP基因，该基因在欧美杨中克隆，是HARDY基因家族的一员，命名为PdHARDY。其在抗盐反应中
具有重要作用。
[0004]本发明公开的欧美杨(Populus deltoides X Populus nigra)逆境相关基因PdHARDY，它具有如SEQ ID NO:3所示的碱基序列。其序列由627个碱基组成，自5’端第I到第627位残基为该基因的开放阅读框序列，其表达受到盐胁迫的诱导。
[0005]本发明的另一方面在于公开上文所述基因，具有如SEQ ID NO:3所示的碱基序列经过一个或几个碱基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO:3编码的蛋白具有相同活性的碱基序列；或者是与SEQ ID NO:3具有90%以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的碱基序列。
[0006]本发明的另一方面在于公开上文所述基因的扩增引物，具有如SEQ ID N0:1?2所不的喊基序列。
[0007]本发明的另一方面在于公开上文所述欧美杨(Populus deltoidesXPopulusnigra)的PdHARDY基因编码的蛋白质，具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸残基序列，其是有208个氨基酸残基组成的蛋白质。
[0008]本发明的另一方面在于公开上文所述蛋白质的衍生蛋白质，其特征在于:具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO:4编码的蛋白具有相同活性的氨基酸残基序列。
[0009]本发明的另一方面在于公开含有上文所述基因的表达载体。本发明所提供的抗逆相关基因PdHARDY，使用一种可以引导外源基因在植物表达中的表达载体转化植株，可获得对干旱胁迫抗逆性增强的转基因植株。优选的情况下，所述表达载体为质粒PCAMBIA1304。本发明的抗逆相关基因PdHARDY在构建到表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种强启动子或诱导性启动子均可，同时必须与编码序列的阅读框相同，要保证整个序列的翻译。为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定和筛选，可以在构建载体时对载体进行加工，例如加入可选择标记，通常可使用的标记是对抗生素抗性酶的基因和生物安全标记，也可以是GUS、GFP等可以产生颜色变化的酶或发光化合物的基因等。携带有本发明的逆境相关基因PdHARDY的表达载体可以通过多种方法转化植物宿主，用于培育抗盐的植物品种。
[0010]本发明的另一方面在于公开一种含有本发明上文所述基因的细胞系。在优选的技术方案中，上文所述细胞系为大肠杆菌ToplO细胞或农杆菌EH105细胞。
[0011]本发明的另一方面在于公开上文所述的基因在培育抗盐植物中的应用。所转化的植物宿主可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。本发明实施例中列举了农杆菌介导的拟南芥转化方法，并获得了转基因植株，试验结果有力的证明了转PdHARDY基因拟南芥具备更强的耐盐能力。
[0012]本发明的创新特征是:本发明成功的扩增了转录因子PdHARDY基因，其可以显著提高下游抗逆基因的表达进而 可广泛用于杨树抗盐品种的培育等领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为PdHARDY基因的表达示意图，其中:横坐标为时间(0、2、4、6、12h)，纵坐标为相对表达量，从图示结果可以看到PdHARDY基因在盐胁迫下表达量显著提高，且在不同时间点表达量不一致。此结果证明PdHARDY基因在盐胁迫被诱导表达。
[0014]图2为PdHARDY基因电泳图，其中:1是PdHARDY基因的电泳条带"是0嫩markerDL2000，从图示结果显示通过PCR扩增，可以得到欧美杨PdHARDY基因的全长(对照DNAmarker,电泳条带大小为627bp)，此结果证明PdHARDY基因片段长度是正确的。
[0015]图3为菌液PCR法筛选重组质粒，泳道1-6是用PdHARDY基因阳性克隆的结果；M是DNA marker DL2000，从图示结果显示1，3，4，5泳道PdHARDY基因已成功连接到pCAMBIA1304表达载体上(对照DNA marker,电泳条带大小为627bp)。
[0016]图4为测定叶片的叶绿素含量结果图。在200mmol -L-1NaCl处理24h后，野生型和转基因株系的叶绿素含量都降低了，但转基因株系的叶绿素含量相对野生型降低较少。其中叶绿素含量野生型降低了 77%，T2-3降低了 57%，Τ2-6降低了 37%，Τ2_14降低了 45.7%。
【具体实施方式】
[0017]下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0018]试验中使用试剂如T4-DNA连接酶、大肠杆菌感受态ToplO、pGEM-T克隆载体以及DNA凝胶回收试剂盒均购自天根生物公司，ExTaq酶及RNA反转录试剂盒购自大连宝生物(TaKaRa)工程公司，常用试剂购自拜尔迪公司。PCR仪购自Biometra，离心机购自SIGMA公司，紫外凝胶成像仪购自Bio-rad公司，超低温冰箱购自三洋公司，引物合成和测序由北京六合华大基因公司完成。
[0019]本发明使用的试验方法中，如无特殊说明，均为本领域技术人员的公知常识，各种缓冲溶液，检测试剂等，如无特殊说明，均可由商业途径获得或者由常规实验方法制备获得。
[0020]实施例1总RNA的提取
[0021]一.本发明所用欧美杨107材料取自河北保定，是一年生插条扦插于北京林业大学苗圃培养，扦插后为保持土壤湿润每三天浇一次透水，待长出新叶后，将长势类似的(生长3个月)欧美杨苗用250mM NaCl喷洒处理，并分别在0、2、4、6、12h摘取顶端叶置于液氮中，然后在-80°C超低温冰箱中保存备用。用于进行总RNA的提取和cDNA的合成。
[0022]二.利用CTAB方法从250mM NaCl胁迫的欧美杨叶片中提取总RNA的流程:
[0023](I)提取RNA前在2XCTAB缓冲液中加入0.1mM终浓度的DTT，65°C预热。
[0024](2)将0.5g液氮研磨好的材料置于2mL的Eppendorf管中，加入900 μ L预热的提取缓冲液，充分摇匀，65°C水浴15min，期间震荡2-3次。
[0025](3)将Eppendorf管取出冷却至室温，加三氯甲烷900 μ L，振荡lOmin。4°C，12000r.mirf1 离心 15min。
[0026](4)取约600 μ L上清，加等体积的三氯甲烧振荡6min。4°C, 12000r.mirT1离心15min。
[0027](5)取约400 μ L上清，加1/4体积即100 μ L的LiCl溶液，轻轻混匀，-20°C放置3h0 取出，4°C，12000r.mirT1 离心 15min。
[0028](6)弃上清，然后加70%乙醇700 μ L、500 μ L分别洗涤2次。完全吸掉乙醇，室温吹干后溶于20-30 μ LddH2O中备用。
[0029]三.以上述方法获得的叶片总RNA为模板,使用M-MLV Reverse Transcriptase试剂盒，按照试剂盒使用说明书的操作进行反转录，合成cDNA第I链，作为模板用于荧光定量PCR或PCR扩增的分析。
[0030]实施例2利用荧光定量PCR法检测欧美杨PdHARDY基因在逆境中的表达
[0031]根据欧美杨PdHARDY基因的保守序列，设计特异引物上游引物=PdHARDYl (SEQ IDN0.1)和下游引物:PdHARDY2 (SEQ ID N0.2)。
[0032]
【权利要求】
1.欧美杨(Populusdeltoides XPopulus nigra)的 PdHARDY 基因，其特征在于:具有如SEQ ID NO:3所不的喊基序列。
2.根据权利要求1所述基因，其特征在于:具有如SEQID NO:3所示的碱基序列经过一个或几个碱基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO:3编码的蛋白具有相同活性的碱基序列；或者是与SEQ ID NO:3具有90%以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的碱基序列。
3.—种扩增权利要求1所述基因的引物，具有如SEQ ID NO:1?2所示的碱基序列。
4.如权利要求1所述基因编码的蛋白质，其具有如SEQID NO:4所不的氣基酸残基序列。
5.根据权利要求4所述蛋白质的衍生蛋白质，其特征在于:具有如SEQID N0:4所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID N0:4编码的蛋白具有相同活性的氨基酸残基序列。
6.含有权利要求1所述基因的表达载体。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于:所述表达载体为质粒PCAMBIA1304。
8.含有权利要求1所述基因的细胞系。
9.根据权利要求8所述的细胞系，其特征在于:所述细胞系为大肠杆菌ToplO细胞或农杆菌H1105细胞。
10.权利要求1所述的基因 在培育抗盐植物中的应用。
【文档编号】C07K14/415GK103436541SQ201310442177
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】郭鹏, 董燕 申请人:大连民族学院