一种高纯度酪蛋白磷酸肽制备方法
【专利摘要】一种高纯度酪蛋白磷酸肽制备方法，是将酪蛋白加水溶解，用胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶任意四中组成的复合蛋白酶和胃蛋白酶进行二次酶解，经杀菌，过滤后再经阳离子交换树脂和阴离子交换树脂二次纯化处理，用水洗弃去水洗液后，再用浓度为0.5%-1%的盐酸洗脱，纳滤膜脱盐、干燥而成。本发明可以有效提高酪蛋白磷酸肽的得率（≥17%）和纯度（≥90%），所制得的酪蛋白磷酸肽无苦味，水溶性好、20%CPP的水溶液澄清透明，颜色为纯白色粉末。本发明制备的乳源性酪蛋白磷酸肽的分子量主要在1000-5000之间，有利于人体吸收，是一种成本低，工艺简单的制备方法，适合工业化生产。
【专利说明】一种高纯度酪蛋白磷酸肽制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种以牛乳中酪蛋白为原料的高纯度酪蛋白磷酸肽的制备方法。
【背景技术】
[0002]酪蛋白磷酸肽(CPP)是以牛乳酪蛋白为原料，通过生物技术制得，具有促进钙、铁、锌等二价金属离子吸收和利用的多肽，可用于各种营养、保健食品。酪蛋白磷酸肽是用胰酶或胰蛋白酶水解的酪蛋白，经过精制、纯化制成，其核心结构为:一Se r (P) - Se r(P) — Se r (P) — G lu — G Iu — (Se r:丝氨酸，G Iu:谷氨酸，P:磷酸基)。这一结构中的磷酸丝氨酸残基(一 Se r (P)—)成簇存在，在肠道PH弱碱性环境下带负电荷，可阻止消化酶的进一步作用，使酪蛋白磷酸肽不会被进一步水解。酪蛋白磷酸肽能在小肠下端PH7~8环境下与钙结合而抑制磷酸钙沉淀的形成，使游离钙保持较高的浓度，促进钙的被动吸收。
[0003]尽管早在50年代，国外就开始了对酪蛋白磷酸肽的研究，但工业化制备的研究工作直到近年才真正开始，而我国在酪蛋白磷酸肤的研究方面较少。传统酪蛋白磷酸肽生产工艺，技术含量低，酪蛋白磷酸肽含量低(最高CPP含量多为20%左右)、产品有苦味、颜偏黄等缺点。中国专利公开的“一种制备酪蛋白磷酸肽的方法”(201310054681.5)，采用在酪蛋白中加入蛋白酶进行酶解反应，利用超滤膜分离出酶解产物酪蛋白磷酸肽，产物酪蛋白磷酸肽经纳滤膜脱盐处理后即得。该方法操作简单，设备要求低，收率高，产品质量好，而且反应温度低，能实现产业化生产，但其采用单一蛋白酶酶解，酪蛋白磷酸肽得率和含量较低(最高产品含量为16%左右)、产品没有进行脱苦。
[0004]本发明在传统酪蛋白磷酸肽生产技术的基础上，以牛乳中酪蛋白为原料，经过酶解、分离、纯化、脱苦、膜过滤、干燥等工艺生产酪蛋白磷酸肽，促进酪蛋白磷酸肽产品的升级，提闻了广品附加值。·
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种纯度高、无苦味、水溶性好、流动性好、颜色为纯白色的、工艺简单可应用于实际生产、成本较低的酪蛋白磷酸肽的制备方法。
[0006]为解决上述问题，本发明所提供的一种酪蛋白磷酸肽的方法，包括以下步骤:
(1)加酪蛋白6-10倍质量的水，在40°C-50°C条件下搅拌溶解；
(2)加入复合蛋白酶进行酶解，酶解条件为:加酶量为酪蛋白质量的0.05%-0.2%，反应温度40°C-50°C，反应时间I h -2h，pH 7.0_9.0，所述复合蛋白酶为胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶中的任意四种的混合物，复合蛋白酶酶解之后，再添加酪蛋白质量的0.05%-0.1%的胃蛋白酶在温度40°C -50°C、pH值4.0-5.0下再酶解lh-2h ；
(3)将温度调节至8(T90°C，保温20min-30 min，进行灭菌；(4)调pH值4.0-5.0，过滤除去未酶解的大分子蛋白沉淀；
(5)上清液调整pH为4.0-5.0，使用阳离子交换树脂吸收纯化lh-4h，过滤，滤液调整纯化液pH为6.0-7.0,再使用阴离子交换树脂进行纯化lh-4h,先用水洗,弃去水洗液后,再用浓度为0.5%-1%的盐酸洗脱；
(6)洗脱液利用超滤膜分离出酪蛋白磷酸肽，再用纳滤膜脱盐，得到小于5000D的酪蛋白磷酸肽液；
(7)经过冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥的任意一种，对得到的产物进行干燥成粉。
[0007]步骤(2)中，所述复合蛋白酶中，任意四种蛋白酶的质量配比为I~4:1~4:1~4:1~4。优化的是,胰蛋白酶:中性蛋白酶:碱性蛋白酶:凝乳蛋白酶=4:3:2:1,或胰蛋白酶:碱性蛋白酶:木瓜蛋白酶:中性蛋白酶=2:3:1:4，或中性蛋白酶:碱性蛋白酶:凝乳蛋白酶:木瓜蛋白酶=1:2:3:4。
[0008]步骤(6)中，所述的超滤膜截留分子量为5000D，纳滤膜截留分子量为150D。
[0009]本发明采用由胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶制成的复合蛋白酶进行酶解一定时间之后，再用胃蛋白酶酶解，并采用先阳离子交换树脂吸收纯化，再使用阴离子交换树脂进行纯化的纯化工艺，可以有效提高酪蛋白磷酸肽的得率
17%)和纯度(酪蛋白磷酸肽含量>90%)，所制得的酪蛋白磷酸肽无苦味，水溶性好、20%CPP的水溶液澄清透明，颜色为纯白色粉末。本发明制备的乳源性酪蛋白磷酸肽的分子量主要在1000-5000之间 ，有利于人体吸收，是一种成本低，工艺简单的制备方法，适合工业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为阴阳离子交换树脂纯化处理前所得酪蛋白磷酸肽(CPP)的高效液相色谱图；
图2为阳离子交换树脂纯化处理所得酪蛋白磷酸肽(CPP)的高效液相色谱图；
图3为阴离子交换树脂纯化处理所得酪蛋白磷酸肽(CPP)的高效液相色谱图；
图4为先阳离子交换树脂纯化处理，再阴离子交换树脂纯化处理所得酪蛋白磷酸肽(CPP)的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0011]实施例1:一种高纯度酪蛋白磷酸肽的制备，包括以下步骤:
向反应釜中加纯水150L，开搅拌200rpm，加热至50°C，向反应釜中缓慢投入酪蛋白25Kg，将pH调至7.8 ;投入胰蛋白酶:中性蛋白酶:碱性蛋白酶:凝乳蛋白酶=4:3:2:1(质量比)混合制成的复合蛋白酶12.5g。酶解Ih后，将料液降温到37°C，将pH调至4.0，加入12.5g胃蛋白酶，继续酶解，Ih后酶解结束。调pH4.5灭酶，将温度调节至90°C，保温20 min。使用732阳离子交换树脂吸收纯化lh，过滤，滤液调整纯化液pH为7.0,使用717阴离子交换树脂进行纯化lh，先用水洗，弃去水洗液后，再用1%的盐酸洗脱。洗脱液调pH值6.8，采用5000D的超滤膜超滤，得到小于5000D的酪蛋白磷酸肽液，再用150D的纳滤膜脱盐。对滤液进行喷雾干燥，得到酪蛋白磷酸肽成品4.52kg，CPP含量≥90%，分子量为1000D-5000D，无苦味，水溶性好、20%CPP的水溶液澄清透明。[0012]实施例2:—种高纯度酪蛋白磷酸肽的制备，包括以下步骤:
向反应釜中加纯水200L，开搅拌200rpm，加热至45°C，向反应釜中缓慢投入酪蛋白25Kg，将pH调至7.5 ;投入胰蛋白酶:中性蛋白酶:木瓜蛋白酶:凝乳蛋白酶=3:2:4:1混合制成的复合蛋白酶25g。酶解1.5h后，将料液降温到40°C，将pH调至5，加入25g胃蛋白酶，继续酶解，Ih后酶解结束。调pH4.6，将温度调节至80°C，保温30 min,灭酶。过滤除去未酶解酪蛋白等大分子蛋白沉淀，上清液使用001X7阳离子交换树脂吸收纯化lh，过滤，滤液调整纯化液PH为6.5，使用美国Amberlite IRA-400阴离子交换树脂进行纯化2h，先用水洗，弃去水洗液后，再用1%的盐酸洗脱。洗脱液调PH值6.8，采用5000D的超滤膜超滤，得到小于5000D的酪蛋白磷酸肽液，再用150D的纳滤膜脱盐。对滤液进行喷雾干燥，得到酪蛋白磷酸肽成品4.75kg，CPP含量≥90%，分子量为1000D-5000D，无苦味，水溶性好、20%CPP的水溶液澄清透明。
[0013] 实施例3:—种高纯度酪蛋白磷酸肽的制备，包括以下步骤:
向反应釜中加纯水250L，开搅拌200rpm，加热至45°C，向反应釜中缓慢投入酪蛋白25Kg，将pH调至8.5 ;投入胰蛋白酶:碱性蛋白酶:木瓜蛋白酶:中性蛋白酶=2:3:1:4混合制成的复合蛋白酶50g。酶解2h后，将料液降温到37°C，将pH调至4.5，加入12.5g胃蛋白酶，继续酶解，Ih后酶解结束。调pH4.7，将温度调节至85°C，保温30 min，灭酶。过滤除去未酶解酪蛋白等大分子蛋白沉淀，上清液使用罗门哈斯AMBERJET UP6040阳离子交换树脂吸收纯化lh，过滤，滤液调整纯化液pH为7.0,使用德国Lewatit M500阴离子交换树脂进行纯化2h，先用水洗，弃去水洗液后，再用0.6%的盐酸洗脱。洗脱液调pH值5.0，采用5000D的超滤膜超滤，得到小于5000D的酪蛋白磷酸肽液，再用150D的纳滤膜脱盐。对滤液进行真空干燥，得到酪蛋白磷酸肽成品4.63kg，CPP含量≥90%，分子量为1000D-5000D，无苦味，水溶性好、20%CPP的水溶液澄清透明。
[0014]实施例4:一种高纯度酪蛋白磷酸肽的制备，包括以下步骤:
向反应釜中加纯水175L，开搅拌200rpm，加热至50°C，向反应釜中缓慢投入酪蛋白25Kg，将pH调至8.0 ;投入中性蛋白酶:碱性蛋白酶:凝乳蛋白酶:木瓜蛋白酶=1:2:3:4混合制成的复合蛋白酶37.5g。酶解1.5h后，将料液降温到37°C，将pH调至4.5，加入25g胃蛋白酶，继续酶解，Ih后酶解结束。调pH4.6，将温度调节至85°C，保温30 min，灭酶。过滤除去未酶解酪蛋白等大分子蛋白沉淀，上清液使用三菱WK60L阳离子交换树脂吸收纯化2h，过滤，滤液调整纯化液pH为6.8，使用SAlOAX阴离子交换树脂进行纯化2h，先用水洗，弃去水洗液后，再用0.8%的盐酸洗脱。洗脱液调pH值6.0，采用5000D的超滤膜超滤，得到小于5000D的酪蛋白磷酸肽液，再用150D的纳滤膜脱盐。对滤液进行真空干燥，得到酪蛋白磷酸肽成品4.7kg，CPP含量≥90%，分子量为1000D-5000D，无苦味，水溶性好、20%CPP的水溶液澄清透明。
[0015]本发明中，复合蛋白酶和胃蛋白酶的二次酶解，可以有效提高酪蛋白磷酸肽的得率。为此，本发明用单一蛋白酶和实施例1-4所采用的复合蛋白酶和胃蛋白二次酶解作了对比试验。结果表明，使用胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或凝乳蛋白酶单一蛋白酶酶解，酪蛋白磷酸肽的得率分别为16 % >14.5% ,15.3%和14.8 %，二使用本发明实施例1_4的方法，酪蛋白磷酸肽的得率分别为18.08%, 18.0%、18.52%、18.88%，均远远高于使用单一蛋白酶酶解的酪蛋白磷酸肽的得率。[0016]采用复合蛋白酶酶解，还可以使酪蛋白磷酸肽(CPP)的分子量更小。实验表明，单一酶水解，所得酪蛋白磷酸肽主要分子量段为3000D-8000D，采用复合蛋白酶(CPP)，酪蛋白磷酸肽(CPP)得率为主要分子量段1000D-5000D。
[0017]本发明实验表明，阴、阳离子阳离子交换树脂单独纯化处理和阴阳离子阳离子交换树脂二次纯化处理存在明显差异。为此，本发明作了对比实验，其结果见图1、图2、图3、图4所示。实现表明，采用先阳离子交换树脂纯化处理，再阴离子交换树脂纯化处理所得酪蛋白磷酸肽(CPP)的纯度，明显高于单独用阴离子交换树脂或阳离子交换树脂单独纯化处理多的酪蛋白磷酸肽(CPP)的纯度。`
【权利要求】
1.一种高纯度酪蛋白磷酸肽制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)加酪蛋白6-10倍质量的水，在40°C-50°C条件下搅拌溶解； (2)加入复合蛋白酶进行酶解，酶解条件为:加酶量为酪蛋白质量的0.05%-0.2%，反应温度40°C-50°C，反应时间I h -2h，pH 7.0_9.0，所述复合蛋白酶为胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶中的任意四种的混合物，复合蛋白酶酶解之后，再添加酪蛋白质量的0.05%-0.1%的胃蛋白酶在温度40°C -50°C、pH值4.0-5.0下再酶解lh-2h ； (3)将温度调节至8(T90°C，保温20min-30 min，进行灭菌； (4)调pH值4.0-5.0，过滤除去未酶解的大分子蛋白沉淀； (5)上清液调整pH为4.0-5.0，使用阳离子交换树脂吸收纯化lh-4h，过滤，滤液调整纯化液pH为6.0-7.0,再使用阴离子交换树脂进行纯化lh-4h,先用水洗,弃去水洗液后,再用浓度为0.5%-1%的盐酸洗脱； (6)洗脱液利用超滤膜分离出酪蛋白磷酸肽，再用纳滤膜脱盐，得到小于5000D的酪蛋白磷酸肽液； (7)经过冷冻干燥、喷雾干燥、真空干燥的任意一种，对得到的产物进行干燥成粉。
2.根据权利要求1所述的高纯度酪蛋白磷酸肽制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述复合蛋白酶中，任意四种蛋白酶的质量配比为I~4:1~4:1~4:1~4:。
3.根据权利要求2所述的高纯度酪蛋白磷酸肽制备方法，其特征在于，复合蛋白酶的质量配比为:胰蛋白酶:中性蛋白酶:碱性蛋白酶:凝乳蛋白酶=4:3:2:1，或胰蛋白酶:碱性蛋白酶:木瓜蛋白酶:中性蛋白酶=2:3:1:4，或中性蛋白酶:碱性蛋白酶:凝乳蛋白酶:木瓜蛋白酶=1:2:3:4。
4.根据权利要求1所 述的高纯度酪蛋白磷酸肽制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述的超滤膜截留分子量为5000D，纳滤膜截留分子量为150D。
【文档编号】C07K1/36GK103571905SQ201310523826
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2013年10月30日
【发明者】曹庸, 李双祁, 刘飞, 彭维, 郭斌, 吴成顺, 黄慧明, 王海波 申请人:广州绿萃生物科技有限公司