配基修饰提高微球介质电荷密度促进蛋白质复性的方法
【专利摘要】本发明涉及配基再修饰提高微球介质电荷密度促进蛋白质复性的技术，属于生物【技术领域】中的蛋白质复性技术。在一次修饰微球介质的基础上，对其配基进行再修饰以提高表面带环氧基团微球介质的电荷密度。利用具有更高电荷密度的配基再修饰微球介质，进一步增强了微球介质与同电荷蛋白质分子间的静电排斥作用，从而更有效地抑制蛋白质聚集，大幅提高复性收率。相较于一次修饰微球介质辅助蛋白质复性，该法不仅具有介质用量少、蛋白质复性收率高的特点，而且对高盐等环境具有更好的耐受性。
【专利说明】配基修饰提高微球介质电荷密度促进蛋白质复性的方法【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及配基再修饰提高微球介质电荷密度促进蛋白质复性的技术，属于生物【技术领域】中的蛋白质复性技术。
【背景技术】
[0002]基因工程技术的快速发展，为人类破译重大疾病、开发新型药物提供了重要技术支撑。目前，基因工程药物开发已逐渐进入成熟期，此类药物的生产必须借助适宜的重组基因表达系统。细菌表达系统因其具有表达量高、易于放大等优点，被广泛使用。但是利用该表达体系生产重组蛋白质时，往往由于目标蛋白质的表达量过高而在细胞内发生错误折叠及聚集，生成包涵体。包涵体不具有生物学活性，必须通过折叠复性以获得具有生物学活性的天然结构。在包涵体蛋白质的折叠复性过程中，变性蛋白质或折叠中间体间的疏水性相互作用极易引发蛋白质分子间聚集，因此抑制蛋白质聚集是促进复性的关键。
[0003]在复性过程中，通过加入低浓度盐酸胍和尿素、精氨酸、表面活性剂等小分子添加剂可以提高折叠中间体或伸展肽链的溶解度，从而抑制蛋白质聚集(Molecular levelinsight into intra-solvent interaction effects on protein stability andaggregation.Advanced Drug Delivery Reviews, 2011，63，1074-1085)。但是大多数添加剂在抑制蛋白质聚集同时也会抑制蛋白质分子的折叠，造成折叠速率的降低。
[0004]近年来色谱复性技术受到研究者的广泛关注。色谱复性分为凝胶过滤色谱复性，吸附色谱复性以及固定化辅助因子色谱复性等。色谱复性集成了蛋白质复性和色谱分离纯化技术，同时实现了目标蛋白质的复性和分离纯化。但色谱介质与蛋白质分子间的吸附作用会导致蛋白质分子折叠速率的降低。此外，色谱复性后的产品浓度较低。
[0005]为了克服小分子添加剂辅助复性和色谱复性技术的不足，近来有报道提出利用与复性蛋白质带有同种电荷`的微球介质，如琼脂糖凝胶介质、经高分子量(平均分子量为60000)的聚乙烯亚胺PEI (将其命名为PEIL)—次修饰的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球介质PGMA-PEIL等抑制蛋白质聚集、促进蛋白质复性的方法(1n-exchangeresins greatly facilitate refolding of I ike-charged proteins at highconcentrations.Biotechnology and Bioengineering, 2011，108，1068-1077;1n-exchange resins facilitate like-charged protein refolding:Effects of porous solidphase properties.Journal of Chromatography A，2012，1225，168-173;Mono-sizedmicrospheres modified with poly(ethylenimine)facilitate the refolding oflike-charged lysozyme.Reactive and Functional Polymers，2012，72，889-896)。与传统的复性方法相比，同电荷微球介质促进蛋白质复性方法操作简单、介质回收方便且无需昂贵的大型设备。其中的琼脂糖凝胶介质比表面积较大，可被修饰为高电荷密度介质，但是其机械强度较差；相对于琼脂糖凝胶介质，无孔单分散PGMA-PEIL微球介质具有更好的机械强度，并可被修饰为超顺磁性微球从而大大简化分离操作，但是受到无孔微球介质较小的比表面积以及修饰方法本身的限制，PGMA-PEIL微球介质的电荷密度有限，限制了其辅助复性的效果。为了克服上述的缺陷，本发明提出了一种通过配基再修饰提高表面带环氧基团微球介质电荷密度的方法，相较一次修饰微球介质，该介质促进了蛋白质复性效果。该法不仅具有介质用量少、蛋白质复性收率高的特点，而且对高盐等环境具有更好的耐受性。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于建立一种配基再修饰提高表面带环氧基团微球介质的电荷密度促进同电荷蛋白质复性的方法。本发明在表面带环氧基团的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球介质PGMA表面修饰高分子量的聚乙烯亚胺制备得到一次修饰微球介质PGMA-PEIL后，选用2- 二乙氨基氯乙基DEAE及平均分子量为1200的聚乙烯亚胺PEI (将其命名为PEISWf一次修饰微球介质的配基进行再修饰以进一步提高微球介质的电荷密度。利用具有更高电荷密度的配基再修饰微球介质，进一步增强了微球介质与同电荷蛋白质分子间的静电排斥作用，从而更有效地抑制蛋白聚集，大幅提高复性收率。
[0007]本发明是通过下述技术方案加以实现的:
[0008]配基再修饰提高微球介质电荷密度促进蛋白质复性的方法，其配基为DEAE或PEIS配基，步骤如下:
[0009]I)合成无孔单分散微球介质PGMA，并在PGMA微球介质表面修饰平均分子量为60000的聚乙烯亚胺PEIL，制备得到一次修饰微球介质PGMA-PEIL ；
[0010]2)通过亲核反应配基修饰于PGMA-PEIL微球介质表面的PEIL配基上，制备得到配基再修饰微球介质 PGMA-PEIL-DEAE 或 PGMA-PEIL-PEIS ；
[0011]3)将上述步骤2)中的配基再修饰微球介质加入同电荷蛋白质的复性缓冲液中，然后加入变性蛋白液复性；
[0012]4)复性完成后，离心收集上清液，获得复性蛋白质溶液。
[0013]所述的步骤3)复性缓冲液为:20~lOOmmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)U~3mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、0~0.lmol/L NaCl及0~2mol/L尿素的混合物；pH值为7.5~9.0。
[0014]所述的步骤3)同电荷蛋白质为与配基再修饰微球介质带有相同电荷的蛋白质。
[0015]所述的步骤2)中，PGMA-PEIL-DEAE的制备方法是:称取1.0~5.0g PGMA-PEIL微球介质于锥形瓶中，加入5~25mL浓度为0.1~1.5mol/L的2-二乙胺基氯乙烧盐酸盐溶液以及等体积的浓度为3.5mol/L的NaOH溶液，使PGMA-PEIL微球介质在反应体系中的浓度为50~100g/L ;上述体系置于50~60°C、50~170rpm条件下反应I~2h ;冷却后，将微球介质用去离子水，在转速为5000~8000rpm的条件下反复离心水洗，直至将游离的DEAE和NaOH清洗干净。
[0016]所述的步骤2)中，PGMA-PEIL-PEIS的制备方法是:称取1.0~5.0g PGMA-PEIL微球介质于锥形瓶中，加入10~50mL戍二醒体积分数为10%的50mmol/L、pH9.0的硼酸/硼酸钠缓冲液，使PGMA-PEIL微球介质在反应体系中的浓度为50~100g/L，于25~30°C、50~170rpm的条件下反应4~6h ;反应结束后,将微球介质用去离子水,在转速为5000~SOOOrpm条件下反复离心水洗，直至将游离的戊二醛清洗干净；随后，将微球介质移入10~50mL含有50~200g/L PEIS的50mmol/L、pH9.0的硼酸/硼酸钠缓冲液中，使微球介质在反应体系中的浓度为50~100g/L，于25~30°C、50~170rpm条件下反应48~60h ;反应结束后，将微球介质用去离子水，在转速为5000~SOOOrpm条件下反复离心水洗，去除未反应的PEIS ;接着，将微球介质移入10~50mL浓度为0.5mol/L的NaBH4溶液中，使微球介质在反应体系中的浓度为50~100g/L，于25~30°C、50~170rpm的条件下反应4~6h，以还原未反应醒基；最后用去离子水，在转速为5000~8000rpm条件下反复离心水洗,去除NaBH4。
[0017]所述的步骤4)方法是:将配基再修饰微球介质加入到由20~100mmol/L Tris -HC1、1 ~3mmol/L EDTA、0 ~0.lmol/L NaCl 及 0 ~2mol/L 尿素组成，且 pH 值为 7.5 ~9.0的复性缓冲液中，使最终复性体系中配基再修饰微球介质的浓度为20~150mg/mL ;上述混合物置于温度为20~37°C的空气振荡器中振荡预平衡直至温度恒定；加入待复性的变性蛋白液，使复性体系中蛋白质浓度为I~4mg/mL ;混合均匀后,置于空气振荡器中,在转速为50~170rpm条件下复性，复性温度与此前复性缓冲液预平衡的温度相同。
[0018]本发明的方法，应用于复性过程中易发生聚集的蛋白质复性，所述的蛋白质包括含有~硫键蛋白质和不含~硫键的蛋白质。
[0019]具体说明如下:
[0020]I)平均分子量为60000的聚乙烯亚胺PEI，本发明将高分子量的PEI命名为PEIL，制备得到一次修饰微球介质PGMA-PEIL ；
[0021]2)平均分子量为1200的聚乙烯亚胺PEI，本发明将低分子量的PEI命名为PEIS，制备得到配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-PEIS ；
[0022]3)所述的步骤 I)方法是:无孔单分散微球介质PGMA以及一次修饰微球介质 PGMA-PEIL 的合成方法见文献(Mono-sized microspheres modified withpoly (ethylenimine)facilitate the refolding of like-charged lysozyme.Reactiveand Functional Polymers, 2012, 72, 889-896)。
[0023]4)本发明的方法可用于含有二硫键蛋白质的复性和不含二硫键的蛋白质的复性。对于含有二硫键的蛋白质复性，复性体系中应添加适当的氧化还原系统，如氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽(GSSG/GSH)。
[0024]本发明的关键技术有三点:首先，配基再修饰微球介质的合成。其次，利用配基再修饰微球介质促进同电荷蛋白质复性时，微球介质与变性蛋白质的加入顺序。在蛋白质由变性溶液稀释到复性缓冲液的最初阶段，变性蛋白质分子表面疏水残基暴露较多，容易发生蛋白质的聚集。所以，在促进蛋白质复性时，要先将同电荷的配基再修饰微球介质先加入到复性缓冲液中，然后再将变性蛋白液加入复性缓冲液。最后，复性完成后配基再修饰微球介质的处理。由于同电荷配基再修饰微球介质与复性蛋白质之间具有静电排斥作用，可通过离心将配基再修饰微球介质与蛋白质分离。配基再修饰微球介质依次经NaCl溶液、去离子水清洗后可重复利用。
[0025]本发明所述的配基再修饰提高表面带环氧基团微球介质的电荷密度促进同电荷蛋白质复性的方法具有以下优点:第一，本发明所述的配基再修饰方法可大幅度提高表面带环氧基团微球介质的电荷密 度，且该修饰方法简单、低毒、价格低廉。第二，无污染，本发明的配基再修饰微球介质作为固相存在于复性体系中，复性结束后易于去除，不会污染蛋白质；第三，与之前的离子交换凝胶介质促进蛋白质复性相比，本发明的刚性微球介质具有更高的机械强度。【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1:实施例1中的不同修饰条件下配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE的电荷密度；
[0027]图2:实施例2中的不同修饰条件下配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-PEIS的电荷密度；
[0028]图3:实施例3中的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE辅助lmg/mL还原变性溶菌酶的复性；
[0029]图4:实施例4中的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-PEIS辅助lmg/mL还原变性溶菌酶的复性；
[0030]图5:实施例5中的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE在20mg/mL和40mg/mL浓度下辅助还原变性溶菌酶的复性；
[0031]图6:实施例6中的不同电荷密度的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE辅助还原变性溶菌酶的复性；
[0032]图7:实施例7中的具有相同电荷密度的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE和PGMA-PEIL-PEIS辅助还原变性溶菌酶的复性；
[0033]图8:实施例8中的对比一次修饰微球介质PGMA-PEIL及配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE在0、0.05及0.1OmoI/L的NaCl浓度下辅助lmg/mL还原变性溶菌酶的复性。
【具体实施方式】
[0034]DEAE配基再修饰提高微球介质电荷密度促进蛋白质复性的方法，步骤如下:
[0035]I)合成无孔单分散微球介质PGMA，并在PGMA微球介质表面修饰平均分子量为60000的聚乙烯亚胺PEIL，制备得到一次修饰微球介质PGMA-PEIL ；
[0036]2)通过亲核取代反应将小分子DEAE修饰于PGMA-PEIL微球介质表面的PEIL配基上，制备得到DEAE配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE ；
[0037]3)将上述步骤2)中的DEAE配基再修饰微球介质加入同电荷蛋白质的复性缓冲液中，然后加入变性蛋白液复性；
[0038]4)复性完 成后，离心收集上清液，获得复性蛋白质溶液。
[0039]所述的步骤3)复性缓冲液为:20~lOOmmol/L三羟甲基氨基甲烷、I~3mmol/L乙二胺四乙酸二钠、0~0.lmol/L NaCl及0~2mol/L尿素的混合物；pH值为7.5~9.0。
[0040]所述的步骤3)同电荷蛋白质为与DEAE配基再修饰微球介质带有相同电荷的蛋白质。
[0041]所述的步骤2)方法是:称取1.0~5.0g PGMA-PEIL微球介质于锥形瓶中，加入5~25mL浓度为0.1~1.5mol/L的2-二乙胺基氯乙烷盐酸盐溶液以及等体积的浓度为3.5mol/L的NaOH溶液，使PGMA-PEIL微球介质在反应体系中的浓度为50~100g/L ；上述体系置于50~60°C、50~170rpm条件下反应I~2h ;冷却后，将微球介质用去离子水，在转速为5000~8000rpm的条件下反复离心水洗，直至将游离的DEAE和NaOH清洗干净；实验中，主要通过控制反应初始的DEAE浓度来控制最终合成的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE的电荷密度。
[0042]所述的步骤4)方法是:将DEAE配基再修饰微球介质加入到由20~IOOmmol/LTris-HClU ~3mmol/L EDTA、0 ~0.lmol/L NaCl 及 0 ~2mol/L 尿素组成且 pH 值为7.5~9.0的复性缓冲液中，使最终复性体系中DEAE配基再修饰微球介质的浓度为20~150mg/mL ;上述混合物置于温度为20~37°C的空气振荡器中振荡预平衡直至温度恒定；加入待复性的变性蛋白液，使复性体系中蛋白质浓度为I~4mg/mL ;混合均匀后，置于空气振荡器中，在转速为50~170rpm条件下复性，复性温度与此前复性缓冲液预平衡的温度相同。
[0043]PEIS配基再修饰提高微球介质电荷密度促进蛋白质复性的方法，步骤如下:
[0044]I)合成无孔单分散微球介质PGMA，并在PGMA微球介质表面修饰平均分子量为60000的聚乙烯亚胺PEIL，制备得到一次修饰微球介质PGMA-PEIL ；
[0045]2)通过亲和加成反应将戊二醛上的活性醛基修饰于PGMA-PEIL微球介质表面的PEIL配基上，随后将平均分子量为1200的聚乙烯亚胺PEIS修饰于该活性醛基上，制备得到PEIS配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-PEIS ；
[0046]3)将上述步骤2)中的PEIS配基再修饰微球介质加入同电荷蛋白质的复性缓冲液中，然后加入变性蛋白液复性；
[0047]4)复性完成后，离 心收集上清液，获得复性蛋白质溶液。
[0048]所述的步骤3)复性缓冲液为:20~lOOmmol/L三羟甲基氨基甲烷、I~3mmol/L乙二胺四乙酸二钠、0~0.lmol/L NaCl及0~2mol/L尿素的混合物；pH值为7.5~9.0。
[0049]所述的步骤3)同电荷蛋白质为与PEIS配基再修饰微球介质带有相同电荷的蛋白质。
[0050]所述的步骤2)方法是:称取1.0~5.0g PGMA-PEIL微球介质于锥形瓶中，加入10~50mL戊二醛体积分数为10%的50mmol/L、pH9.0的硼酸/硼酸钠缓冲液，使PGMA-PEIL微球介质在反应体系中的浓度为50~100g/L，于25~30°C、50~170rpm的条件下反应
4~6h ;反应结束后，将微球介质用去离子水，在转速为5000~SOOOrpm条件下反复离心水洗，直至将游离的戊二醛清洗干净；随后，将微球介质移入10~50mL含有50~200g/L PEIS的50mmol/L、pH9.0的硼酸/硼酸钠缓冲液中，使微球介质在反应体系中的浓度为50~100g/L，于25~30°C、50~170rpm条件下反应48~60h ;反应结束后，将微球介质用去离子水，在转速为5000~8000rpm条件下反复离心水洗，去除未反应的PEIS ;接着，将微球介质移入10~50mL浓度为0.5mol/L的NaBH4溶液中，使微球介质在反应体系中的浓度为50~100g/L，于25~30°C、50~170rpm的条件下反应4~6h，以还原未反应醛基；最后用去离子水，在转速为5000~8000rpm条件下反复离心水洗,去除NaBH4。实验中，主要通过控制反应初始的PEIS浓度来控制最终合成的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-PEIS的电荷密度。
[0051]所述的步骤4)方法是:将PEIS配基再修饰微球介质加入到由20~IOOmmol/LTris-HClU ~3mmol/L EDTA、0 ~0.lmol/L NaCl 及 0 ~2mol/L 尿素组成且 pH 值为
7.5~9.0的复性缓冲液中，使最终复性体系中PEIS配基再修饰微球介质的浓度为20~150mg/mL ;上述混合物置于温度为20~37°C的空气振荡器中振荡预平衡直至温度恒定；加入待复性的变性蛋白液，使复性体系中蛋白质浓度为I~4mg/mL ;混合均匀后，置于空气振荡器中，在转速为50~170rpm条件下复性，复性温度与此前复性缓冲液预平衡的温度相同。
[0052]本发明的方法应用于复性过程中易发生聚集的蛋白质复性，所述的蛋白质包括含有二硫键蛋白质和不含二硫键的蛋白质。
[0053]下面的实例将对本发明提供的方法予以进一步的说明。
[0054]实施例1:不同修饰条件下配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE的电荷密度 [0055]合成PGMA微球介质并在其表面修饰平均分子量为60000的聚乙烯亚胺PEIL，制备得到电荷密度为287 ±9 ii mol/g的一次修饰微球介质PGMA-PEIL的方法见文献(Mono-sized microspheres modified with poly (ethylenimine)facilitate the refolding of like-charged lysozyme.Reactive and FunctionalPolymers, 2012, 72, 889-896)。
[0056]配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE的制备方法如下:称取三份质量分别为1.0,2.0及3.0g的PGMA-PEIL微球介质，分别移入50mL锥形瓶中；在各瓶中分别加入5mL、IOmL及15mL浓度分别为0.1mol/L、0.5mol/L及1.5mol/L的DEAE溶液后,再分别加入5mL、IOmL及15mL浓度为3.5mol/L的NaOH溶液，于60°C、170rpm的条件下反应Ih ;反应结束冷却后，将介质用去离子水在5000rpm转速下反复离心水洗，直至将游离的DEAE和NaOH清洗干净，制备得到具有不同电荷密度的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE。图1所示为上述对应条件下所合成的PGMA-PEIL-DEAE微球介质的电荷密度。由图可知，反应初始DEAE浓度分别为0.1mol/L、0.5mol/L及1.5mol/L时，所合成的PGMA-PEIL-DEAE微球介质的电荷密度分别为 353±6 V- mol/g、676±8 u mol/g及 824±28 u mol/g。可见,在一定的 DEAE 浓度范围内，增加反应液中DEAE浓度可提高配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE的电荷密度。
[0057]实施例2:不同修饰条件下配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-PEIS的电荷密度
[0058]合成PGMA微球介质并在其表面修饰平均分子量为60000的聚乙烯亚胺PEIL，制备得到电荷密度为287 ±9 ii mol/g的一次修饰微球介质PGMA-PEIL的方法见文献(Mono-sized microspheres modified with poly (ethylenimine)facilitate the refolding of like-charged lysozyme.Reactive and FunctionalPolymers, 2012, 72, 889-896)。
[0059]配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-PEIS的制备方法如下:称取三份质量分别为1.0,2.0及3.0g的PGMA-PEIL微球介质，分别移入50mL锥形瓶中；在各瓶中分别加入入10mL、20mL及30mL戊二醛体积分数为10%的50mmol/L、pH9.0的硼酸/硼酸钠缓冲液，于25°C、170rpm的条件下反应4h ;反应结束后，将介质用去离子水在SOOOrpm转速下反复离心水洗，直至将游离的戊二醛清洗干净；随后，在各瓶中分别加入10mL、20mL及30mL分别含有100g/L、150g/L及200g/L平均分子量为1200的PEIS的50mmol/L、pH9.0硼酸/硼酸钠缓冲液，于25°C，170rpm条件下反应48h ;反应结束后，将介质用去离子水在8000rpm转速下反复离心水洗，去除未反应的PEIS ;接着，将介质分别移入10mL、20mL及30mL的
0.5mol/L NaBH4溶液中，于25°C，170rpm反应4h，以还原未反应醛基；最后用去离子水在SOOOrpm转速下反复离心水洗以去除NaBH4，制备得到具有不同电荷密度的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-PEIS。图2所示为上述对应条件下所合成的PGMA-PEIL-PEIS微球介质的电荷密度。由图可知，反应初始PEIS浓度分别为100g/L、150g/L及200g/L时，所合成的PGMA-PEIL-PEIS微球介质的电荷密度分别为481 ± 15 ii mo I /g、646 ± 24 ii mo I /g及665±28ii mol/g。可见，在一定的PEIS浓度范围内，增加反应液中PEIS浓度可提高配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-PEIS的电荷密度。
[0060]实施例3:配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE辅助lmg/mL还原变性溶菌酶的复性
[0061]溶菌酶在pH8.5复性条件下带正电荷，所以本发明合成的带有正电荷的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE可以辅助溶菌酶复性。本实施例中选用实施例1中所合成的电荷密度为824±28ii mol/g的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE辅助溶菌酶复性,并且以相同条件下不添加微球介质和添加电荷密度为287±9ii mol/g的一次修饰微球介质PGMA-PEIL辅助溶菌酶复性为对照。其中，在PGMA微球介质表面修饰平均分子量为60000的聚乙烯亚胺PEIL制备电荷密度为287±9 ii mol/g的一次修饰微球介质PGMA-PEIL的方法见文献(Mono-sized microspheres modified with poly(ethylenimine)facilitate the refolding of like-charged lysozyme.Reactive and FunctionalPolymers, 2012, 72, 889-896)。
[0062]变性溶菌酶样品:20mg/mL溶菌酶在含有8mol/L尿素、20mmol/L DTT、20mmol/LTris - HCl和3mmol/L EDTA且pH为8.5的变性缓冲液中于40°C还原变性3小时。复性实验在1.5mL的离心管中进行,将8mol/L尿素，10mmol/L GSSG溶液,20mmol/L GSH溶液及20mmol/L含3mmol/L EDTA的Tris - HCl缓冲液,按照计算配比进行混合,制备得到组成为一定量的尿素、GSSG、GSH、20mmol/L Tris - HCl 及 3mmol/L EDTA，pH 为 8.5 的复性缓冲液。对于不添加微球介质的溶菌酶复性，ImL上述复性缓冲液直接置于20°C空气振荡器中预平衡；对于添加微球介质的溶菌酶复性，上述复性缓冲液中加入浓度为100mg/mL的微球介质后置于20°C的空气振荡器中振荡混合预平衡，制成ImL复性缓冲液。将变性溶菌酶溶液用复性缓冲液稀释，稀释后体系中含有lmg/mL溶菌酶、0.6mol/L尿素、2mmol/L GSSG、6mmol/L GSH、0/100mg/mL —次修饰微球介质PGMA-PEIL或配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE、20mmol/L Tris - HCl 以及 3mmol/L EDTA，pH 为 8.5。上述溶菌酶复性体系在 20°C和 50rpm条件下复性3h后，测定溶菌酶的活性。复性后溶菌酶的活性是以溶壁微球菌为底物测定的。称取一定量的溶壁微球菌溶于60mmol/L、pH6.2的磷酸缓冲液中，制得0.25mg/mL溶壁微球菌液；复性结束后，复性体系在SOOOrpm下离心2min并经适当稀释后，取0.1OmL稀释液与1.40mL溶壁微球菌液充分混合；在25°C下，测定上述混合液在450nm的吸光度随时间变化，记录0-60s内的吸光值降低速率；通过0-60s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收率。其它条件相同，复性体系中不添加微球介质、添加一次修饰微球介质PGMA-PEIL以及添加配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE的溶菌酶活性收率如图3所示。由图可知，在上述实验条件下，添加电荷密度为824±28i!m0l/g的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE可以大幅度的提高还原变性溶菌酶的活性收率，在溶菌酶浓度为lmg/mL时可以达到70%的活性收率，远高于不添加微球介质时达到22%的活性收率，也高于添加电荷密度为287±9 ii mol/g的一次修饰微球介质PGMA-PEIL时达到61%的活性收率。表明与一次修饰微球介质相比，具有更高电荷密度的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE能够更有效地辅助同电荷蛋白质复性。[0063]复性结束后，分别离心收集一次修饰微球介质PGMA-PEIL以及配基再修饰微球介质 PGMA-PEIL-DEAE,并用 1.0mol/L NaCl 溶液平衡 15min ;于 5000rpm 下离心 IOmin 除去上清，将吸附在微球介质上的杂质洗脱；最后用50mL去离子水在转速5000rpm下分三次离心水洗微球介质，清洗后微球介质保存于20%的乙醇溶液中。
[0064]实施例4:配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-PEIS辅助lmg/mL还原变性溶菌酶的复性
[0065]溶菌酶在pH8.5复性条件下带正电荷，所以本发明合成的带有正电荷的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-PEIS可以辅助溶菌酶复性。本实施例中选用实施例2中所合成的电荷密度为665±28ii mol/g的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-PEIS辅助溶菌酶复性，同时，以相同条件下不添加微球介质和添加电荷密度为287±9ii mol/g的一次修饰微球介质PGMA-PEIL辅助溶菌酶复性为对照。其中，电荷密度为287±9ii mol/g的一次修饰微球介质 PGMA-PEIL 的合成方法见文献(Mono-sized microspheres modified withpoly (ethylenimine)facilitate the refolding of like-charged lysozyme.Reactiveand FunctionalPolymers, 2012, 72, 889-896)。
[0066]变性溶菌酶样品:20mg/mL溶菌酶在含有8mol/L尿素、20mmol/L DTT、50mmol/LTris - HCl和3mmol/L EDTA，pH8.5的变性缓冲液中于40°C还原变性3小时。复性实验在1.5mL的离心管中进行,将8mol/L尿素，10mmol/L GSSG溶液,20mmol/L GSH溶液及50mmol/L含3mmol/L EDTA的Tris - HCl缓冲液，按照计算配比进行混合，制备得到组成为一定量的尿素、GSSG、GSH、50mmol/L Tris - HCl 及 3mmol/L EDTA, pH8.5 的复性缓冲液。对于不添加微球介质的溶菌酶复性，ImL上述复性缓冲液直接置于20°C的空气振荡器中预平衡；对于添加微球介质的溶菌酶复性，上述复性缓冲液中加入浓度为100mg/mL的微球介质后置于20°C的空气振荡器中振荡混合预平衡，制成ImL复性缓冲液。将变性溶菌酶溶液用复性缓冲液稀释，稀释后体系中含有lmg/mL溶菌酶、0.6mol/L尿素、2mmol/L GSSG、6mmol/LGSH、0/100mg/mL —次修饰`微球介质PGMA-PEIL或配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-PEIS、50mmol/L Tris - HCl 以及 3mmol/L EDTA，pH 为 8.5。上述溶菌酶复性体系在 20°C和 50rpm条件下复性3h后，测定溶菌酶的活性。复性后溶菌酶的活性是以溶壁微球菌为底物测定的。称取一定量的溶壁微球菌溶于60mmol/L、pH6.2磷酸缓冲液中，制得0.25mg/mL溶壁微球菌液；复性结束后，复性体系在SOOOrpm下离心2min并经适当稀释后，取0.1OmL稀释液与1.40mL溶壁微球菌液充分混合；在25°C下，测定上述混合液在450nm的吸光度随时间变化，记录0-60s内的吸光值降低速率；通过0-60s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收率。其它条件相同，复性体系中不添加微球介质、添加一次修饰微球介质PGMA-PEIL以及添加配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-PEIS的活性收率如图4所示。由图可知，在上述实验条件下，添加电荷密度为665 ± 28 y mol/g的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-PEIS可以大幅度的提高还原变性溶菌酶的活性收率，在溶菌酶浓度为lmg/mL时可以达到71%的活性收率，远高于不添加微球介质时达到22%活性收率，也高于添加电荷密度为287±9 ii mol/g的一次修饰微球介质PGMA-PEIL时达到61%活性收率。表明与一次修饰微球介质相比，具有更高电荷密度的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-PEIS能够更有效地辅助同电荷蛋白质复性。
[0067]复性结束后，分别离心收集一次修饰微球介质PGMA-PEIL以及配基再修饰微球介质 PGMA-PEIL-PEIS，并用 1.0mol/L NaCl 溶液平衡 15min ;于 5000rpm 下离心 IOmin 除去上清，将吸附在微球介质上的杂质洗脱；最后用50mL去离子水在转速5000rpm下分三次离心水洗微球介质，清洗后微球介质保存于20%的乙醇溶液中。
[0068]实施例5:配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE在20mg/mL和40mg/mL浓度下辅助还原变性溶菌酶的复性
[0069]所用配基再修饰微球介质为实施例1中制备得到的电荷密度为824±28ii mol/g的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE。
[0070]变性溶菌酶样品:20mg/mL溶菌酶在含有8mol/L尿素、20mmol/L DTT、20mmol/LTris - HCl和lmmol/L EDTA，pH8.5的变性缓冲液中于40°C还原变性3小时。复性实验在1.5mL的离心管中进行,将8mol/L尿素，10mmol/L GSSG溶液,20mmol/L GSH溶液及20mmol/L含lmmol/L EDTA的Tris - HCl缓冲液，按照计算配比进行混合，制备得到组成为一定量的尿素、GSSG、GSH、20mmol/L Tris-HCl 及 lmmol/L EDTA，pH8.5 的复性缓冲液。对于不添加微球介质的溶菌酶复性，ImL上述复性缓冲液直接置于25°C空气振荡器中预平衡；对于添加微球介质的溶菌酶复性，上述复性缓冲液中加入浓度为20mg/mL或40mg/mL的微球介质后置于25°C空气振荡器中振荡混合预平衡，制成ImL复性缓冲液。将变性溶菌酶溶液用复性缓冲液稀释，稀释后体系中含有lmg/mL溶菌酶、0.6mol/L尿素、2mmol/L GSSG、6mmol/L GSH、浓度分别为0mg/mL、20mg/mL或40mg/mL的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE、20mmol/L Tris-HCl 以及 lmmol/L EDTA，pH 为 8.5。上述溶菌酶复性体系在 25°C和 170rpm条件下复性3h后，测定溶 菌酶的活性。复性后溶菌酶的活性是以溶壁微球菌为底物测定的。称取一定量的溶壁微球菌溶于60mmol/L、pH6.2的磷酸缓冲液中，制得0.25mg/mL溶壁微球菌液；复性结束后，复性体系在8000rpm下离心2min并经适当稀释后,取0.1OmL稀释液与1.40mL溶壁微球菌液充分混合；在25°C下，测定上述混合液在450nm的吸光度随时间变化，记录0-60s内的吸光值降低速率；通过0-60s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收率。复性体系中添加不同浓度的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE辅助溶菌酶复性的活性收率如图5所示。由图可知，在上述实验条件下，复性体系中添加20mg/mL配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE时，溶菌酶活性收率为68%，而添加40mg/mL PGMA-PEIL-DEAE时活性收率为72%，均高于不添加微球介质时达到22%活性收率。表明复性体系中添加配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE可以大幅度的提高还原变性溶菌酶的活性收率，并且在一定的微球介质浓度范围内，活性收率随着所添加配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE浓度的增加而升高。
[0071]复性结束后，离心收集配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE，并用1.0mol/L NaCl溶液平衡15min ;于5000rpm下离心IOmin除去上清,将吸附在微球介质上的杂质洗脱；最后用50mL去离子水在转速5000rpm下分三次离心水洗微球介质，清洗后微球介质保存于20%的乙醇溶液中。
[0072]实施例6:不同电荷密度的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE辅助还原变性溶菌酶的复性
[0073]所用配基再修饰微球介质为实施例1中制备得到的三种电荷密度分别为353±6 ii mol/g、676±8 ii mol/g以及824±28 ii mol/g的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE。[0074]变性溶菌酶样品:20mg/mL溶菌酶在含有8mol/L尿素、20mmol/L DTT、20mmol/LTris - HCl和lmmol/L EDTA，pH8.5的变性缓冲液中于40°C还原变性3小时。复性实验在1.5mL的离心管中进行,将8mol/L尿素，10mmol/L GSSG溶液,20mmol/L GSH溶液及20mmol/L含lmmol/L EDTA的Tris - HCl缓冲液，按照计算配比进行混合，制备得到组成为一定量的尿素、GSSG、GSH、20mmol/L Tris-HCl 以及 lmmol/L EDTA, pH8.5 的复性缓冲液。上述复性缓冲液中分别加入浓度为100mg/mL的三种配基再修饰微球介质后置于25°C空气振荡器中振荡混合预平衡，制成ImL复性缓冲液。将变性溶菌酶溶液用复性缓冲液稀释，稀释后体系中含有 lmg/mL 溶菌酶、0.6mol/L 尿素、2mmol/L GSSG、6mmol/L GSH、100mg/mL 不同电荷密度的的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE、20mmoI/L Tris - HCl以及lmmol/L EDTA, pH为8.5。上述溶菌酶复性体系在25°C和170rpm条件下复性3h后，测定溶菌酶的活性。复性后溶菌酶的活性是以溶壁微球菌为底物测定的。称取一定量的溶壁微球菌溶于60mmol/L、pH6.2的磷酸缓冲中，制得0.25mg/mL溶壁微球菌液；复性结束后，复性体系在8000rpm下离心2min并经适当稀释后,取0.1OmL稀释液与1.40mL溶壁微球菌液充分混合；在25°C下，测定上述混合液在450nm的吸光度随时间变化，记录0_60s内的吸光值降低速率；通过0-60s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收率。复性体系中添加具有不同电荷密度的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE辅助溶菌酶复性的活性收率如图6所示。由图可知，在上述实验条件下，复性体系中添加电荷密度为353±6 ii mol/g的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE时，溶菌酶活性收率为60% ；添加电荷密度为676±8ii mol/g的PGMA-PEIL-DEAE时活性收率为70% ;添加电荷密度为824±28 u mol/g的PGMA-PEIL-DEAE时活性收率为73%。表明在一定范围内，配基再修饰微球介质促进同电荷蛋白质复性的活性收率随微球介质电荷密度的增加而升高。
[0075]复性结束后，分别离心收集三种配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE，并用
1.0mol/L NaCl溶液平衡15min ;于5000rpm下离心IOmin除去上清,将吸附在微球介质上的杂质洗脱；最后用50mL去离子水在转速5000rpm下分三次离心水洗微球介质,清洗后微球介质保存于20%的乙醇溶液中。
[0076]实施例7:具有相同电荷密度的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE和PGMA-PEIL-PEIS辅助还原变性溶菌酶的复性
[0077]所用配基再修饰微球介质为实施例1中制备得到的电荷密度为676±8 ii mol/g的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE和实施例2中制备得到的电荷密度为665±28 u mol/g的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-PEIS。
[0078]变性溶菌酶样品:40mg/mL溶菌酶在含有8mol/L尿素、40mmol/L DTTUOOmmol/LTris-HCl和lmmol/L EDTA, pH8.5的变性缓冲液中于40°C还原变性3小时。复性实验在1.5mL的离心管中进行,将8mol/L尿素,20mmol/L GSSG溶液,40mmol/L GSH溶液及100mmol/L含lmmol/L EDTA的Tris - HCl缓冲液,按照计算配比进行混合,制备得到组成为一定量的尿素、GSSG、GSHU00mmol/L Tris - HCl 及 lmmol/L EDTA, pH8.5 的复性缓冲液。上述复性缓冲液中分别加入浓度为lOOmg/mL的电荷密度为676±8y mol/g的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE和电荷 密度为665±28 u mol/g的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-PEIS后置于37°C空气振荡器中振荡混合预平衡，制成ImL复性缓冲液。将变性溶菌酶溶液用复性缓冲液稀释，稀释后体系中含有2mg/mL溶菌酶、2mol/L尿素、4mmol/L GSSG、8mmol/L GSH、lOOmg/mL 配基再修饰微球介质 PGMA-PEIL-DEAE 或 PGMA-PEIL-PEIS、IOOmmoI/L Tris - HCl 以及 lmmol/L EDTA，pH为 8.5。上述溶菌酶复性体系在 37°C和 170rpm条件下复性3h后，测定溶菌酶的活性。复性后溶菌酶的活性是以溶壁微球菌为底物测定的。称取一定量的溶壁微球菌溶于60mmol/L、pH6.2的磷酸缓冲液中，制得0.25mg/mL溶壁微球菌液；复性结束后，复性体系在8000rpm下离心2min并经适当稀释后,取0.1OmL稀释液与1.40mL溶壁微球菌液充分混合；在25°C下，测定上述混合液在450nm的吸光度随时间变化，记录0-60s内的吸光值降低速率；通过0-60s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收率。复性体系中添加具有相近电荷密度但不同配基结构的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE及PGMA-PEIL-PEIS辅助溶菌酶复性的活性收率如图7所示。由图可知，在上述实验条件下，复性体系中分别添加具有相近电荷密度但不同配基结构的配基再修饰微球介质辅助溶菌酶复性时，复性收率相近。表明配基再修饰微球介质促进同电荷蛋白质复性的效果与其配基结构无关。
[0079]复性结束后，分别离心收集配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE及PGMA-PEIL-PEIS,并用 1.0mol/L NaCl 溶液平衡 15min ;于5000印111 下离心 IOmin 除去上清，将吸附在微球介质上的杂质洗脱；最后用50mL去离子水在转速5000rpm下分三次离心水洗微球介质，清洗后微球介质保存于20%的乙醇溶液中。
[0080]实施例8:对比一次修饰微球介质PGMA-PEIL及配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE在0、0.05及0.1OmoI/L的NaCl浓度下辅助lmg/mL还原变性溶菌酶的复性。
[0081 ] 所用的电荷密度为287 ±9 ii mol/g的一次修饰微球介质PGMA-PEIL的合成方法见文献(Mono-sized microspheres modified with poly(ethylenimine)facilitate the refolding of like-charged lysozyme.Reactive and FunctionalPolymers, 2012, 72, 889-896)。
[0082]所用的配基再修饰微球介质为实施例1中制备得到的电荷密度为824±28 U mol/g的配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE。
[0083]变性溶菌酶样品:20mg/mL溶菌酶在含有8mol/L尿素、20mmol/L DTT、20mmol/LTris - HCl和lmmol/L EDTA, pH8.5的变性缓冲液中于40°C还原变性3小时。复性实验在1.5mL 的离心管中进行，将 8mol/L 尿素，10mmol /T, GSSG 溶液，20mmol/L GSH 溶液，0.5mol/L NaCl溶液及20mmol/L含lmmol/L EDTA的Tris - HCl缓冲液，按照计算配比进行混合，制备得到组成为一定量的尿素、GSSG、GSH 及 NaCl，20mmol/L Tris - HCl，lmmol/L EDTA,pH8.5的复性缓冲液。对于不添加微球介质的溶菌酶复性，ImL上述复性缓冲液直接置于25°C空气振荡器中预平衡；对于添加微球介质的溶菌酶复性，上述复性缓冲液中加入浓度为100mg/mL的一次修饰微球介质PGMA-PEIL或配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE后置于25°C空气振荡器中振荡混合平衡，制成ImL复性缓冲液。将变性溶菌酶溶液用复性缓冲液稀释，稀释后复性体系中含有lmg/mL溶菌酶、0.6mol/L尿素、2mmol/L GSSG、6mmol/LGSH、0/100mg/mL —次修饰微球介质PGMA-PEIL或配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE、浓度分别为 0mol/L、0.05mol/L 或 0.10mol/L 的 NaCl、20mmol/L Tris - HCl 以及 lmmol/LEDTA, pH为8.5。上述溶菌酶复性体系在25°C和170rpm条件下复性3h后，测定溶菌酶的活性。复性后溶菌酶的活性 是以溶壁微球菌为底物测定的。称取一定量的溶壁微球菌溶于60mmol/L、pH6.2的磷酸缓冲液中，制得0.25mg/mL溶壁微球菌液；复性结束后，复性体系在8000rpm下离心2min并经适当稀释后,取0.1OmL稀释液与1.40mL溶壁微球菌液充分混合；在25°C下，测定上述混合液在450nm的吸光度随时间变化，记录0_60s内的吸光值降低速率；通过0-60s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收率。复性体系中添加不同浓度NaCl后，不添加微球介质、添加一次修饰微球介质PGMA-PEIL以及添加配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE辅助溶菌酶复性的活性收率如图8所示。由图可知，对于不添加微球介质、添加一次修饰微球介质PGMA-PEIL或添加配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE的复性体系，还原变性溶菌酶的活性收率均随着体系中NaCl浓度的增加而降低。在相同的NaCl浓度下，添加一次修饰微球介质或配基再修饰微球介质复性体系的溶菌酶活性收率均高于不添加配基再修饰微球介质复性体系的活性收率，且添加配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE复性体系的溶菌酶活性收率高于添加一次修饰微球介质PGMA-PEIL复性体系的活性收率。表明与一次修饰微球相比，具有更高电荷密度的配基再修饰微球介质在较高盐浓度的复性体系中也能有效地促进蛋白质复性。
[0084]复性结束后，分别离心收集一次修饰微球介质PGMA-PEIL及配基再修饰微球介质PGMA-PEIL-DEAE,并用 1.0mol/L NaCl 溶液平衡 15min ;于5000rpm 下离心 10min 除去上清，将吸附在微球介质上的杂质洗脱；最后用50mL去离子水在转速5000rpm下分三次离心水洗微球介质，清洗后微球介质保存于20%的乙醇溶液中。
[0085]本发明提出的配基再修饰提高微球介质电荷密度促进蛋白质复性的方法，并将其应用于变性蛋白质样品的复性，已通过现场较佳的实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
【权利要求】
1.配基再修饰提高微球介质电荷密度促进蛋白质复性的方法，其特征在于配基为DEAE或PEIS配基，步骤如下: I)合成无孔单分散微球介质PGMA，并在PGMA微球介质表面修饰平均分子量为60000的聚乙烯亚胺PEIL，制备得到一次修饰微球介质PGMA-PEIL ； 2 )通过亲核反应配基修饰于PGMA-PEIL微球介质表面的PEIL配基上，制备得到配基再修饰微球介质 PGMA-PEIL-DEAE 或 PGMA-PEIL-PEIS ； 3)将上述步骤2)中的配基再修饰微球介质加入同电荷蛋白质的复性缓冲液中，然后加入变性蛋白液复性； 4)复性完成后，离心收集上清液，获得复性蛋白质溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤3)复性缓冲液为:20~IOOmmol/L三轻甲基氨基甲烧、1~3mmol/L乙二胺四乙酸二钠、0~0.lmol/L NaCl及0~2mol/L尿素的混合物；pH值为7.5~9.0。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤3)同电荷蛋白质为与配基再修饰微球介质带有相同电荷的蛋白质。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤2)中，PGMA-PEIL-DEAE的制备方法是:称取1.0~5.0g PGMA-PEIL微球介质于锥形瓶中，加入5~25mL浓度为0.1~1.5mol/L的2-二乙胺基氯乙烷盐酸盐溶液以及等体积的浓度为3.5moI/L的NaOH溶液，使PGMA-PEIL微球介质在反应体系中的浓度为50~100g/L ;上述体系置于50~60°C、50~170rpm条件下反应I~2h ;冷却后,将微球介质用去离子水,在转速为5000~8000rpm的条件下反复离心水洗，直至将游离的DEAE和NaOH清洗干净。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤2)中，PGMA-PEIL-PEIS的制备方法是:称取1.0~5.0g PGMA-PEIL微球介质于锥形瓶中，加入10~50mL戊二醛体积分数为10%的50mmol/L、pH9.0的硼酸/硼酸钠缓冲液，使PGMA-PEIL微球介质在反应体系中的浓度为50~100g/L，于25~30°C、50~170rpm的条件下反应4~6h ;反应结束后，将微球介质用去离子水，在转速为5000~8000rpm条件下反复离心水洗，直至将游离的戊二醛清洗干净；随后，将微球介质移入10~50mL含有50~200g/L PEIS的50mmol/L、pH9.0的硼酸/硼酸钠缓冲液中，使微球介质在反应体系中的浓度为50~100g/L，于25~30°C、50~170rpm条件下反应48~60h ;反应结束后,将微球介质用去离子水,在转速为5000~8000rpm条件下反复离心水洗,去除未反应的PEIS ;接着,将微球介质移入10~50mL浓度为0.5mol/L的NaBH4溶液中，使微球介质在反应体系中的浓度为50~100g/L，于25~30°C >50~170rpm的条件下反应4~6h,以还原未反应醒基；最后用去离子水,在转速为5000~8000rpm条件下反复离心水洗,去除NaBH4。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤4)方法是:将配基再修饰微球介质加入到由 20 ~100mmol/L Tris - HC1、I ~3mmol/L EDTA、0 ~0.lmol/L NaCl 及 0 ~2mol/L尿素组成，且pH值为7.5~9.0的复性缓冲液中，使最终复性体系中配基再修饰微球介质的浓度为20~150mg/mL ;上述混合物置于温度为20~37°C的空气振荡器中振荡预平衡直至温度恒定；加入待复性的变性蛋白液，使复性体系中蛋白质浓度为I~4mg/mL ;混合均匀后，置于空气振荡器中，在转速为50~170rpm条件下复性，复性温度与此前复性缓冲液预平衡的温度相同。
7.权利要求1~6任意一项所述的方法，应用于复性过程中易发生聚集的蛋白质复性，所述的蛋白质包括含有一硫键蛋白质和不含一硫键的蛋白质。
【文档编号】C07K1/14GK103601791SQ201310608786
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月25日 优先权日:2013年11月25日
【发明者】孙彦, 杨春燕, 史清洪, 董晓燕 申请人:天津大学