一种柠檬苦素苷的提取分离技术与生产工艺的制作方法
【专利摘要】本发明是关于从桔核中提取柠檬苦素苷单体的方法及其生产工艺。柠檬苦素类物质是一种存在于芸香科和楝科植物中的三萜类成分，具有抗炎镇痛、抑制多种癌细胞的作用，主要被应用于食品添加剂和化妆品中。但是柠檬苦素类物质味极苦，且溶解性较差，从而限制了它的广泛应用。柠檬苦素苷是柠檬苦素的糖基化产物，具有无异味、溶解性好和溶液稳定等优点，未来将具有极为广阔的市场前景。柠檬苦素苷的提取过程如下：粉碎过筛→回流提取和浓缩→醇沉除杂→树脂分离→脱色→柱层析→检测。柠檬苦素苷的天然含量为0.02％左右，通过本申请提及的方法，可有效富集目标产物，最终获得60％、90％和98％等不同规格的产品，方法简便易行，适合工业化。
【专利说明】一种柠檬苦素苷的提取分离技术与生产工艺
【技术领域】
[0001]本发明涉及柠檬苦素苷领域，特别是指一种柠檬苦素苷的提取分离技术与生产工艺。
【背景技术】
[0002]柠檬苦素类是一种高度氧化的三萜类化合物，主要存在于芸香科和楝科植物中，主要代表是柠檬苦素类和诺米林类成分。这两类成分最早在1989年首次报道，Lam和Hasegawa曾报道过诺米林类成分具有抑制苯并(α)芘诱导的小鼠前胃瘤的作用；Miller曾报道过柠檬苦素类和诺米林类成分均具有减少7，12-二甲基苯并(α)蒽诱导的雌性叙利亚仓鼠颊袋表皮样癌的作用，且这两类成分在抗癌、抗病毒、抗焦虑和杀虫等方面均具有很强的生物活性，但它们并没有得到广泛的商业化生产，其原因在于这两类成分的味道极苦，水溶性较差。柠檬苦素苷类成分是柠檬苦素类成分糖基化的产物，糖基化的过程破坏了产生苦味的内酯环，同时增强了该物质的水溶性，因此为该类成分的大规模商业化应用带来了希望。
[0003]Hasegawa曾报道了柠檬苦素苷类物质的分离方法，该方法是将葡萄柚种子用己烷、丙酮和甲醇提取，之后丙酮部分用XAD-2型离子交换树脂分离，之后将色谱柱水洗，糖苷类用丙酮洗提。将甲醇提取部分上XAD-2型色谱柱，并在10-55%直接设置四个浓度梯度进行洗脱，每个浓度梯度再用递增浓度的乙腈水溶液洗脱，得到了四个柠檬苦素苷类化合物。Ozaki等用果胶酶在pH4.0条件下提取20小时，再用XAD-2型离子交换树脂分离，也得到了一种柠檬苦素类化合物。但以上分离方法存在一些缺陷，首先，这些分离方法中都用到了树脂XAD-2，该种树脂的价格极其昂贵，根本无法实现工业化生产；其次，这些方法中通常需要4-5次柱层析才能完成，操作较为繁琐，工业化时会带来巨大的能源和原料损耗；再次，由于操作次数较多，带来了产品产率大幅下降的弊端；最后，这些方法的最后纯化阶段均采用了制备高效液相的纯化方·法，否则其产品纯度不能满足商业化需求，而高效液相色谱法的制备量极为有限，因此需要进行技术革新。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对柠檬苦素类物质味极苦且溶解度差的弊端，希望通过制备柠檬苦素苷，达到深度开发该类活性物质的目的。
[0005]本发明的方案和步骤如下:(1)粉碎过筛:将原料粉碎后过10-16目筛，以提高目标产物提取率，加快有效物质溶出，使提取更加完全；(2)回流提取和浓缩:用5倍量10%乙醇浸泡2小时，连续提取1.5小时连续提取两次，合并滤液后浓缩至1/3 ; (3)醇沉:加入4倍量乙醇，搅拌条件下加热30分钟，冷凝后醇沉24小时，取上层澄清液，减压过滤沉淀物，合并上清液和滤液，合并液减压收干；(4)树脂分离:预先处理离子交换树脂，干膏以5倍量水分散，上样，并进行静态吸附2-4小时，而后分别以5倍柱床体积的水+1%盐酸、15%乙醇+1%盐酸和纯乙醇+1%盐酸溶液洗脱，浓缩后取15%洗脱部分准备脱色；(5)脱色:样品与硅胶(80-120目)比例1: 1拌样，取二倍量硅胶湿法上柱，流动相取丙酮--乙醇6: 1-2: 1进行洗脱，6: 1洗脱2个保留体积，2: 1洗脱10个保留体积。如果样品颜色较深，可以用活性炭再脱色一次；(6)柱层析:取2: 1梯度部分样品与等量硅胶拌样，并以10倍硅胶量湿法上柱，流动相取丙酮:乙醇6: 1-3: 1-2: 1进行洗脱，6: 1洗脱2个保留体积，3: 1洗脱10个保留体积，2: 1洗脱2个保留体积，将3: 1部分浓缩，以乙醇和水为溶剂进行重结晶，即可得到纯品；(7)、检测:运用改良方法紫外分光光度法和高效液相色谱法进行复合检测。
[0006]在本发明中，采用了 ZSA-550型树脂进行分离，ZSA-550预先用乙醇浸泡处理，上样后进行静态吸附、循环吸附和动态吸附，以10%乙醇冲洗富集样品备用，树脂再以纯乙醇冲洗以备下次使用。
[0007]本发明采用少量硅胶和活性炭复合脱色的方法，目的在于:①层析前脱色是为了在分离高纯品的过程中保证层析的分离度；②采用脱色后层析是为了满足客户对产品规格的不同需求，经过树脂吸附即可得到65%左右的产品，再经过第一次脱色和层析即可保证产品纯度达到90%要求，经过重结晶即可使产品纯度达到98%要求，这样会大大节约分离溶剂、硅胶等用量，降低分离成本。③采用分步制备可降低硅胶使用量，节约成本。
[0008]本发明的优点在于，提取得到了柠檬苦素苷类活性物质，且方法适合于工业化生产，提取率达80 %，纯度达60 %、90 %、98 %，进入市场后将有很大的竞争优势。
【具体实施方式】
[0009]下面将结合本发 明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描
[0010]述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下结合具体实验步骤对本发明进行描述，但并不限制本发明。
[0011]本发明提取柠檬苦素苷的工艺流程为:
[0012]粉碎/过筛一回流提取/浓缩一醇沉一树脂分离一脱邑一层析一重结晶一成品
[0013]实施例1
[0014](1)粉碎过筛:取桔核60公斤粉碎后过10-16目筛。
[0015](2)提取:5倍量10%乙醇浸泡两小时，提取1.5小时，提取2次。
[0016](3)减压浓缩:提取后过滤，减压浓缩虑液，后以离心机2000转离心30分钟，抽取中层澄清液约35升。加入4倍量甲醇，搅拌条件下加热30分钟，冷凝后醇沉24小时，抽取上层澄清液，减压过滤沉淀物，合并上清液和滤液，合并液减压条件下收干，得干膏约2公斤。
[0017](4)树脂吸附:本发明考察了包括XAD系列、LX系列、HB系列、ZSA系列等10种树脂，发现ZSA-550树脂的效果最好，可使柠檬苦素苷的吸附率和解析率分别为93.5%和96.5%。预先处理LSA-600树脂100升，2公斤干膏以五倍量水分散，上样，并进行静态吸附两小时，而后分别以5倍柱床体积的水+1 %盐酸、15%乙醇+1 %盐酸和纯乙醇+1 %盐酸溶液洗脱，浓缩后取15%洗脱部分准备脱色。
[0018](5)减压回收15%乙醇5BV至干(记录样品重量)，用甲醇分散，调节相对密度至1.05-1.10 (20-30 °C )。
[0019](6)取样品量干重16倍量硅胶(200-300目)装柱，以丙酮充实，上样，先以流动相8: 1冲洗5BV，再收集流动相4: 1洗脱部分，4: 1洗脱15BV，而后减压浓缩4: 1部分至相对密度1.01-1.03 (50-60°C )，加热至沸20分钟，迅速冷却结晶，以乙醇和水为溶剂反
复重结晶得产物。[0020](7)检测:高效液相色谱法:用Agilentl260色谱仪，选取250X4.6mm柱子，设定检测波长210nm。以A (3mM磷酸)，B (乙腈)为流动相，流速lmL/min。设置梯度为0_7min，85-79% A ；7-8min,79% A ；8-16min, 79-70 % A ；16-25min, 70-65% A。取柠檬苦素苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.lmg的溶液作为对照品。取本品5mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取5ml，置25ml量瓶中，加甲醇
[0021]稀释至刻度作为供试品。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10微升，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0022]实施例2
[0023](1)粉碎过筛:取桔核120公斤，粉碎后过10-16目筛。
[0024](2)提取:20%乙醇500公斤，浸泡两小时，连续提取1.5小时。
[0025](3)减压浓缩:减压浓缩虑液，浓缩至80公斤，后以离心机2000转离心30分钟，抽取中层澄清液约60升。加入4倍量甲醇，搅拌条件下加热30分钟，冷凝后醇沉24小时，抽取上层澄清液，减压过滤沉淀物，合并上清液和滤液，合并液减压条件下收干，得干膏约4公斤。
[0026](4)树脂吸附:本发明考察了包括XAD系列、LX系列、HB系列、ZSA系列等10种树脂，发现ZSA-550树脂的效果最好，可使柠檬苦素苷的吸附率和解析率分别为93.5%和96.5%。预先处理LSA-600树脂200升，4公斤干膏以五倍量水分散，上样，并进行静态吸附两小时，而后分别以5倍柱床体积的水+1%盐酸、15%乙醇+1%盐酸和纯乙醇+1%盐酸溶液洗脱，浓缩后取15%洗脱部分准备脱色。
[0027](5)减压回收15%乙醇5BV至干(记录样品重量)，用甲醇分散，调节相对密度至
1.05-1.10 (20-30 °C )。
[0028](6)取样品量干重8倍量硅胶(200-300目)装柱，以丙酮充实，上样，先以流动相8: 1冲洗5BV，再收集流动相4: 1洗脱部分，4: 1洗脱12BV，而后减压浓缩4: 1部分至相对密度1.01-1.03 (50-60 °C )，加热至沸20分钟，迅速冷却结晶，以乙醇和水为溶剂反
复重结晶得产物。
[0029](7)检测:改良紫外分光光度法。溶剂:甲醇、浓硫酸、香草醛、石油醚(均为分析纯)。反应液:5g香草醒溶解于100mL浓硫酸中。
[0030]标准曲线的制作:将柠檬苦素苷标准品用甲醇配成130μ g/mL的标准工作溶液，在6支试管中分别加入0，0.5,0.8，1.2，1.5,2.0mL标准溶液，分别加甲醇至2.0mL，再分别加入反应液0.5mL,摇匀，静置30min，500nm波长下测定吸光值。以空白溶液为参比溶液，根据所得结果采用直线回归方法计算出标准曲线的回归方程，并以标准品的加入量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
[0031]样品的制备:准确称取0.200g供试样品(精确到0.00lg)于10mL玻璃试管中，加2mL石油醚，超声提取3min,于4000r/min条件下离心，吸走石油醚萃取物，再加入适量石油醚重复以上操作，至提取液无色。试管中的剩余物中加入2mL甲醇，超声提取lOmin，4000r/min下离心，收集上清液，再加入甲醇重复以上操作数次，至提取液无色。甲醇萃取物浓缩后定容至10mL，待测。
[0032]柠檬苦素类物质总量的测定:精密吸取一定量样品制备液，以甲醇稀释至2.0mL,然后按照标准曲线的方法测定样品制备液的吸光度，由吸光度从标准曲线上查出样品制备液的柠檬苦素苷类物质浓度，按下列公式计算出原料中柠檬苦素苷类物质的含量。
[0033]原料中柠檬苦素苷类类似物含量(％) = (10C/LXM) X100(C为检测值山为样品加入体积；10为样品制备定容体积；M为样品质量)。
[0034]本发明所使用的设备均为化工制药行业的通用设备，如:浸罐、三效节能浓缩罐、单效浓缩罐、层析柱、高效液相色谱仪、紫外分光光度计等。
[0035]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种柠檬苦素苷的提取分离技术与生产工艺，其特征在于，包括以下工艺步骤:(1)粉碎过筛；(2)回流提取和浓缩:用5倍量10%乙醇浸泡2小时，连续提取1.5小时，连续提取两次，合并滤液后收膏至1/3体积；(3)醇沉:加入4倍量乙醇，搅拌条件下加热30分钟，自然冷凝醇沉24小时，取上层澄清液，减压过滤沉淀物，合并上清液和沉淀物滤液，合并收干；(4)树脂分离:预先处理离子交换树脂，干膏以5倍量水分散，缓慢上样，而后进行静态吸附2-4小时，而后分别以5倍柱床体积的水+1 %盐酸、15%乙醇+1 %盐酸和纯乙醇+1 %盐酸溶液洗脱，浓缩后取15%洗脱部分准备脱色；(5)脱色:样品与硅胶比例1: 1拌样，取二倍量硅胶湿法上柱，流动相为丙酮:乙醇6: 1-2: 1进行洗脱，6: 1洗脱2个保留体积，2: 1洗脱10个保留体积，如果样品颜色较深，可以用活性炭再脱色一次；(6)层析:取样品与等量硅胶拌样，并以十倍硅胶量湿法上柱，流动相取丙酮:乙醇(6: 1-3: 1-2: 1)进行 洗脱，6: 1洗脱2个保留体积；3: 1洗脱10个保留体积，2: 1洗脱2个保留体积，而后将3: 1部分浓缩，再以乙醇和水为溶剂进行重结晶一次，即可得到纯品；(7)检测:高效液相色谱法和改良型紫外分光光度法。
2.根据权利要求1所述的柠檬苦素苷的提取分离技术与生产工艺，其特征在于，还包括:提取柠檬苦素苷的原料为桔核，经过对葡萄柚、砂糖橘、广柑、芦柑、赣南脐橙、进口脐橙、香橼、三峡金桔、砂糖柚、重庆产柚子、陈皮、香片和桔核等几十种原料的正交分析考察，最终确定最佳原料为桔核。
3.根据权利要求1-2所述的柠檬苦素苷的提取分离技术与生产工艺，其特征在于，还包括:采用了离子交换树脂ZSA-550富集产物。
4.根据权利要求1-3所述的柠檬苦素苷的提取分离技术与生产工艺，其特征在于，还包括:柱层析流动相为丙酮:乙醇，以及其溶剂梯度设置6: 1-3: 1-2: 1，该混合溶剂配比经反复实验证明为最佳洗脱溶剂。
5.根据权利要求1-4所述的柠檬苦素苷的提取分离技术与生产工艺，其特征在于，还包括:本发明所用的检查方法是利用柠檬苦素苷在酸性溶液中易水解脱掉葡萄糖基，葡萄糖与葸酮试剂反应生成稳定的绿色溶液的特性，在波长625nm处有最大吸收峰的特性，进行紫外分光光度法检测。
6.根据权利要求1-4所述的柠檬苦素苷的提取分离技术与生产工艺，其特征在于，还包括:本发明所用另外一种检查方法是利用柠檬苦素苷在香草醛浓硫酸作用下显粉红，其显色后的物质在波长575nm处有最大吸收峰的特性，进行紫外分光光度法检测。
7.根据权利要求1-4所述的柠檬苦素苷的提取分离技术与生产工艺，其特征在于，还包括:本发明所用的液相是以磷酸水溶液A (3mM)和乙腈B为流动相，设定流速lmL/min，洗脱梯度为 0-7min, 85-79% A ；7-8min,79% A ；8-16min, 79-70% A ；16-25min, 70-65% A，检测波长210nm，安捷伦反相C18柱，填料粒度5 μ m，柱子规格4.6mmX 250mm,进样量10 μ 1，保留时间为12.55min。`
【文档编号】C07H15/26GK103665070SQ201310694615
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】张起辉, 孙宗良, 石徐, 程孟霞, 杜浩, 张忠山 申请人:重庆大学