抗传染性造血器官坏死病毒的单克隆抗体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗传染性造血器官坏死病毒的单克隆抗体及其应用。该抗传染性造血器官坏死病毒的单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC?No.8556的小鼠杂交瘤细胞株分泌产生的。该抗传染性造血器官坏死病毒的单克隆抗体可用于检测传染性造血器官坏死病毒。本发明还公开了一种检测传染性造血器官坏死病毒的ELISA试剂盒。
【专利说明】抗传染性造血器官坏死病毒的单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫学领域，具体涉及一种抗传染性造血器官坏死病毒的单克隆抗体，杂交瘤细胞株及其建立一种检测传染性造血器官坏死病毒的夹心ELISA方法试剂盒。
【背景技术】
[0002]传染性造血器官坏死病毒(Infectioushaematopoietic necrosis virus, IHNV)在分类上属于弹状病毒科(Rhabdoviridae),粒外弹状病毒属(Novirhabdovirus)。主要感染虹鳟、硬头鳟等冷水鱼类，急性感染时累计死亡率在90-95%以上，并可垂直传播给子代。最早流行于北美和欧洲一些国家，随着水产品贸易的发展不断传播开来，目前已经蔓延至我国东北、河北、山东、北京、甘肃、青海等主要冷水鱼养殖地区，并在局部地区暴发流行，造成较大经济损失。IHN被国际兽疫局(OIE)列为必须申报的疾病，是鱼类口岸第I类检疫对象，被我国列为二类动物疫病。
[0003]该病目前尚无治疗方法，防控IHN的最现实有效措施是对跨区域运输的鱼苗和亲鱼隔离并进行连续有效的监测，发现病毒尽快找到源头，控制并消除病原，控制病毒的传播。目前OIE推荐的几种IHNV的诊断方法包括细胞培养分离方法、免疫学方法(中和试验法、间接荧光抗体法和ELISA法)和分子生物学方法(PCR法、PCR探针和序列测定法)。其中细胞培养分离技术准确度较高，但检测周期较长，至少需要15日才能得到最终的结果，不能满足快速检测的需要；分子生物学方法基于细胞分离方法的基础上，用于检测细胞培养后的病毒，或是对显性 感染鱼携带的病毒做进一步的确认；基于单克隆抗体技术的免疫学检测技术，是满足基层实验室快速大批量检测IHNV的有效途径，已有报道，或是没有好的抗原和抗血清，或是需要较为昂贵的精密仪器，不适合基层实验室，一直没能大规模的应用到疾病的监测工作中。因此，获得具有较强特异性的抗传染性造血器官坏死病毒的单克隆抗体，不仅具有快速、灵敏的特点，而且操作简单，对仪器设备要求低，简便快捷，适用于该病的大规模监测。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种抗传染性造血器官坏死病毒的单克隆抗体及其应用。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案:
[0006]本发明经筛选得到了能稳定分泌抗传染性造血器官坏死病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株IHNV-1B10，该杂交瘤细胞株的分类命名为传染性造血器官坏死病毒的杂交瘤细胞株，其已于2013年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为 CGMCC N0.8556。
[0007]由上述杂交瘤细胞株分泌的抗传染性造血器官坏死病毒的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。[0008]本发明还提供了一种检测传染性造血器官坏死病毒的ELISA试剂盒，该试剂盒包括本发明所述的单克隆抗体。进一步地，该试剂盒中还包括已包被抗传染性造血器官坏死病毒的多克隆抗体的固相载体，辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体。
[0009]进一步地，为了便于检测，本发明试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，以及ELISA反应所需的酶联免疫检测试剂。其中，所述阳性对照为传染性造血器官坏死病毒溶液，阴性对照为鱼类细胞悬液或者是正常鱼类组织匀浆液。所述酶联免疫检测试剂，均为常规的酶联免疫检测试剂，包括但不限于，酶的底物反应液、洗涤液和酶反应终止液。
[0010]本发明还提供了一种检测传染性造血器官坏死病毒的方法，该方法包括以下步骤:
[0011](I)将待测样品加样于包被有抗传染性造血器官坏死病毒的多克隆抗体的固相载体； [0012](2)将权利要求1所述的单克隆抗体加样于(I)获得的固相载体；
[0013](3)将辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体加样于(2)获得的固相载体；
[0014](4)加入酶的底物反应液；
[0015](5)加入酶反应终止液；
[0016](6)结果判定。
[0017]本发明还要求保护上述单克隆抗体在制备检测传染性造血器官坏死病毒试剂盒中的应用。以及该单克隆抗体或试剂盒在检测传染性造血器官坏死病毒中的应用。
[0018]本发明具有以下优点和效果
[0019]1、获得抗传染性造血器官坏死病的单克隆抗体及分泌该单克隆抗体杂交瘤细胞株。该杂交瘤细胞增殖后可制备大量所需的特异抗体；杂交瘤细胞注射小鼠后，产生的腹水单抗ELISA效价为1:2.5 X IO5 ;杂交瘤细胞株活性高，液氮中冻存8_10个月后，仍能快速复苏并保持良好活性。在所述的单克隆抗体的制备中，细胞融合率为96.2%，阳性率为93.4%。
[0020]2、在抗原提纯方式上，国内外学者获得抗传染性造血器官坏死病毒抗原主要是通过梯度蔗糖离心，SDS-PAGE电泳后再切胶目的条带，处理后免疫小鼠，该类方法病毒纯度高，但是操作复杂，病毒消耗量较大且病毒稳定性难以保证。本发明免疫小鼠的抗原采取差速离心的粗提方式，较大程度的保护了抗原蛋白的原始构象，为筛选出特异性单克隆抗体提供了保障；在免疫程序上利用免疫耐受的原理，使免疫小鼠对免疫抗原中细胞成分产生免疫耐受，从而提高免疫中病毒的纯度，进而加强病毒抗原对小鼠脾细胞的刺激强度，取得了较好的效果。
[0021]3、本发明研制的传染性造血器官坏死病毒单克隆抗体的特异性好、效价高，可特异性的识别10个传染性造血器官坏死病毒株，具有较好的广谱性，应用于传染性造血器官坏死病毒免疫学诊断试剂中，特异性好，避免了交叉反应。
[0022]4、建立的检测传染性造血器官坏死病毒的夹心ELISA方法，能够快速、准确的检测出细胞悬液中及组织中病毒存在与否，为基层实验室大批量监测病毒传播提供了有利条件。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明；[0024]图1为纯化后重组蛋白Western blotting检测:M:蛋白分子量标准1、IHNV的SDS-PAGE。
【具体实施方式】
[0025]为更好地理解本发明，下面将通过具体的实施例进一步说明本发明的方案，本发明的保护范围应包括权利要求的全部内容，但不限于此。
[0026]实施例1抗传染性造血器官坏死病毒的单克隆抗体的制备
[0027]1.抗原提纯
[0028]所用抗原为IHNV-UK (传染性造血器官坏死病毒英国株)由英国Weymouth的OIE参考实验室保藏。接种入指数生长期的EPC (鲤鱼上皮瘤细胞)，用M199 (含Earle’s平衡盐溶液、10%胎牛血清和200U/mL青霉素-链霉素，pH7.2-7.6)置于17.5°C增值。收集病毒，经 8000r/min 离心 30min,再 24000r/min 离心 2h。沉淀用 0.5mL0.01M PBS 重悬。
[0029]2.动物免疫
[0030]免疫用小鼠为SPF级5周龄雌性BALB/c小鼠。每只小鼠以纯化后的病毒作为抗原进行腹腔注射基础免疫，病毒与弗氏完全佐剂1:1混合，腹腔注射；2周后加强免疫，病毒与弗氏不完全佐剂1:1混合，腹腔注射；之后每隔I周加强免疫I次，腹腔注射，病毒注射4mg/只；第4次免疫后第3天，将小鼠脱颈椎处死，无菌取脾脏用于细胞融合。
[0031]3.细胞融合和克隆化
[0032]取免疫小鼠的脾脏和SP2/0细胞进行融合，用梯度离心纯化的传染性造血器官坏死病毒作为抗原进行间接ELISA检测，筛选出的阳性孔以有限稀释法进行克隆化，直到得到能稳定分泌传染性抗造血器官坏死病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1:160，命名为传染性造血器官坏死病毒杂交瘤细胞株1B10，该细胞株已于2013年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏编号为CGMCC N0.8556。
[0033]4.单克隆抗体的制备
[0034]预处理正常5周龄雌性BALB/c小鼠，即腹腔注射无菌石蜡油0.5mL/只。7d后腹腔接种指数生长期的杂交瘤细胞IX IO6~2 X IO6/只，密切观察小鼠的健康状况与腹水征象，约7d~12d后，处死小鼠，抽提腹水，低速离心收集上清，分装后置_80°C保存备用。
[0035]实施例2:抗传染性造血器官坏死病毒单克隆抗体的生物学特性测定
[0036]1.效价的测定
[0037]方法:用纯化的传染性造血器官坏死病毒15μ g/mL的浓度包被酶标板，采用间接ELISA法对单克隆抗体的腹水效价进行鉴定。
[0038]结果:本发明所述的单克隆抗体腹水效价为1:2.5X105，表明杂交瘤细胞株具有分泌高滴度抗体的能力。
[0039]2.单克隆抗体的亚型鉴定 [0040]方法:应用美国的SouthernBiotech 的分型试剂盒(SBA Clonotyping? System/HRP)，依照其说明书对本发明所述单克隆抗体的Ig亚型进行鉴定。
[0041]结果:本发明所述单克隆抗体的亚型为IgGl型k链。
[0042]3.单克隆抗体的特异性分析[0043]以纯化传染性造血器官坏死病毒和浓缩的EPC细胞裂解液进行免疫印迹实验，经SDS-PAGE和Western blot分析,本发明制备的单克隆抗体针对的抗原决定簇定位于Mt42000的蛋白条带上，该蛋白带已证实是传染性造血器官坏死病毒的核蛋白(见图1)。
[0044]4.单克隆抗体的交叉反应
[0045]方法:采用间接ELISA方法，检测单克隆抗体分别与传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus, SVCV)、病毒性出血败血症病毒(Viral haemorrhagic septicaemia virus, VHSV)以及8种鱼类细胞和正常鱼组织有无交叉反应。
[0046]结果:单克隆抗体特异性好，仅与传染性造血器官坏死病毒发生反应，与其他病毒株以及细胞均不发生反应。
[0047]实施例3传染性造血器官坏死病毒双夹心ELISA检测试剂盒
[0048]1、传染性造血器官坏死病毒双夹心ELISA检测试剂盒的组成
[0049]传染性造血器官坏死病毒双夹心ELISA检测试剂盒的组成为:1)已包抗传染性造血器官坏死病毒多克隆抗体的固相载体；2)实施例1制备的单克隆抗体；3)辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体(购自sigma公司)；4)酶的底物反应液；5)阳性对照和阴性对照；6)洗涤液；7)酶反应终止液。
[0050]I)已包抗传染性造血器官坏死病毒多克隆抗体的固相载体的制备:以梯度离心纯化的传染性造血器官坏死病毒(ATCC VR-714)为抗原，免疫山羊。制备血清用先EPC细胞碎片吸附，再用饱和硫酸铵法方法纯化。用包被缓冲液将纯化的羊多克隆抗体稀释至蛋白含量2.5 μ g/ml，包被96孔ELISA酶标板(美国Corning公司)，100 μ I/孔，4°C过夜。取出后用洗涤液洗3次，每次5min，甩干，干燥后用真空袋_80°C保存。
[0051]2)酶的底物反应液:10%硫酸盐(TMB，sigma，用二甲基甲酰胺配置):150 μ 1，H202:4 μ 1，ρΗ5.0柠檬酸-磷酸缓冲液:10ml。现用现配。
[0052]3 )阳性对照和阴性对照
[0053]阳性对照:传染性造血器官坏死病毒溶液，阴性对照为鱼类细胞悬液或者是正常组织匀浆液。
[0054]4)洗涤液:NaC180g，Na2HP04.12H2029g，KH2P042g，KC12g，吐温 _205ml，蒸馏水 1L，4°C保存。蒸馏水1:10稀释，现用现配。
[0055]5)酶反应终止液=H2SO4 (96%) 22.2mL,蒸馏水177.8mL,室温放置。
[0056]2、传染性造血器官坏死病毒双夹心ELISA检测试剂盒的使用方法
[0057]I)向包被有羊抗IHNV的IgG的ELISA酶标板加入样品，阳性对照及阴性对照，37°C 作用 Ih。
[0058]2)洗涤液洗板3次，每次3min。
[0059]3)将第二抗体，即实施例1制备的抗传染性造血器官坏死病毒的单克隆抗体，稀释1600倍，加入到酶标板上，37°C作用lh。
[0060]4)洗涤液洗板3次，每次3min。
[0061]5)将辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体按商品说明进行稀释，然后加入到酶标板上，37。。作用 1.5h。
[0062]6)洗涤液洗板3次，每次3min。[0063]7)加入酶的底物反应液，100 μ L/孔，避光。
[0064]6)加入终止液终止反应，150 μ L/孔。
[0065]7)读取450nm光吸收值。
[0066]8)结果判定
[0067]实施例4传染性造血器官坏死病毒双夹心ELISA检测试剂盒的应用
[0068]特异性测定
[0069]为了验证本发明的传染性造血器官坏死病毒双夹心ELISA试剂盒的特异性，使用实施例3的试剂盒对10株传染性造血器官坏死病毒(细胞培养液)进行检测，同时设鲤春病毒血症病毒(SVCV)、病毒性出血败血症病毒(VHSV)做交叉反应验证。
[0070]表1试剂盒特异性测定
[0071]
【权利要求】
1.抗传染性造血器官坏死病毒的单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCCN0.8556的杂交瘤细胞株分泌产生。
2.分泌产生抗传染性造血器官坏死病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC N0.8556。
3.—种检测传染性造血器官坏死病毒的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1所述的单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括已包被抗传染性造血器官坏死病毒的多克隆抗体的固相载体，辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为传染性造血器官坏死病毒溶液，阴性对照为鱼类细胞悬液或者是正常鱼类组织匀浆液。
7.—种检测传染性造血器官坏死病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将待测样品加样于包被有抗传染性造血器官坏死病毒的多克隆抗体的固相载体； (2)将权利要求1所述的单克隆抗体加样于(I)获得的固相载体； (3)将辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体加样于(2)获得的固相载体； (4)加入酶的底物反应液； (5)加入酶反应终止液；` (6)结果判定。
8.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测传染性造血器官坏死病毒试剂盒中的应用。
9.权利要求1所述的单克隆抗体在检测传染性造血器官坏死病毒中的应用。
【文档编号】C07K16/10GK103739708SQ201310700633
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】曹欢, 徐立蒲, 景宏丽, 王静波, 王姝, 王小亮 申请人:北京市水产技术推广站