一种制备hEGF粗制品的方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备hEGF制品的方法。该方法为收集吸附尿蛋白后的吸附剂,将洗脱下来的尿蛋白溶液上已经平衡好的金属螯合层析柱,hEGF结合到该金属螯合层析柱上,收集hEGF组分洗脱峰,经过硫酸铵沉淀,制备hEGF粗制品。该方法是一种从男性尿液中制备hEGF粗制品的方法,该粗制品可用于hEGF的后续纯化,纯化出的hEGF不含使人体产生过敏反应的异源蛋白,该方法操作简便,便于工业化生产,为规模化制备人来源的hEGF提供了基础。
【专利说明】—种制备hEGF粗制品的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种尿蛋白的提取方法,尤其涉及一种hEGF粗制品的制备方法。
【背景技术】
[0002]人尿中含有三百多种蛋白质,尿激酶、人尿胰蛋白酶抑制剂、人尿激肽原酶等都已经从人尿中分离出来,并在疾病治疗等领域发挥了重要的作用。
[0003]人表皮生长因子(HumanEpidernal Growth Factor,又叫 Urogastrone,尿抑胃素,以下简称为hEGF),于70年代首次从人尿中分离。hEGF是人生长因子中的一种,是由53个氨基酸组成的相对分子量为604?a,等电点为4.6左右的小分子多肽。hEGF含有三对分子内二硫键,因此对酸、碱、热等理化因素均较稳定。目前,hEGF已被开发成治疗抑制胃酸分泌的注射剂和烧烫伤、溃疡、各类创伤以及角膜损伤的外用药物和美容护肤品。
[0004]中国人尿资源非常丰富,依赖于这一有利条件,尿蛋白产业从上世纪七十年代末就已经开始发展起来,至今已有三十多年。在尿蛋白粗制品的规模化生产方式主要有两种,方法一:收集尿液,运输到加工点,用吸附剂吸附尿蛋白,由于尿液来源分散,收集成本高,加上城市卫生改造,收集已经越来越困难;方法二:直接将吸附尿蛋白的树脂放置在厕所进行连续在线吸附,然后收集吸附后的树脂运回加工点进行分离纯化。这种方法对环境无污染,可以在大中城市进行收集,尿源集中,运输成本较低,极大地扩大了尿蛋白的收集区域。
[0005]尿蛋白产品目前主要的生产过程是:首先,在各地经过尿蛋白的吸附、洗脱、沉淀等步骤制备尿蛋白粗制品;其次,尿蛋白粗制品经过下游的分离纯化和精制,制备尿蛋白原料药;最后灌装成品制剂,用于临床。
[0006]目前,hEGF来源有两种。第一,hEGF主要通过基因工程制备,名称为重组hEGF(Recombind Human Epiderma`l Growth Factor,以下简称 rhEGF)。主要的制备途径有原核表达、哺乳动物细胞表达、酵母表达等,通过收集发酵液,进行分离纯化得到rhEGF。第二,从人尿中分离提取hEGF。目前,主要是从孕妇尿液中经过复杂的纯化过程得到hEGF。
[0007]通过基因工程制备的rhEGF虽然易纯化、产量高,但由于其中存在微量的异源蛋白,rhEGF容易引起过敏反应,因此,目前只作为外用药物使用。从尿液中制备的hEGF,结构和性质和人体完全相同,不存在异源蛋白,可作为注射剂进入临床。目前国外已经有进行临床研究的案例。但是hEGF目前多数从孕妇尿中分离得到,孕妇尿难于收集且产量低,限制了 hEGF的应用。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是针对现有技术存在的不足,提供一种从男性尿液中制备hEGF粗制品的方法,该粗制品可用于hEGF的后续纯化,纯化出的hEGF不含使人体产生过敏反应的异源蛋白,该方法操作简便便于工业化生产出hEGF粗制品,为从自然来源中提取hEGF提供基础。[0009]为实现上述目的,本发明制备hEGF粗制品的方法的技术方案是:
一种制备hEGF粗制品的方法,收集吸附尿蛋白后的吸附剂,集中洗脱,将洗脱出的尿蛋白溶液上样已平衡好的金属螯合层析柱,收集含有hEGF组分的洗脱峰,经过硫酸铵沉淀,制备hEGF粗制品。
[0010]所述的制备hEGF粗制品的方法,包括如下步骤:
1)将阴离子交换树脂作为吸附剂放置在公共厕所的尿池或尿斗中,吸附流经尿液或稀释尿液中的尿蛋白;
2)收集已吸附尿蛋白的树脂,进行清洗、解吸处理;
3)超滤浓缩;
4)超滤浓缩液调节pH和电导,上样已平衡好的金属螯合层析柱,再用平衡液冲洗;
5)用洗脱溶液洗脱,收集含有hEGF组分的洗脱峰;
6)在收集的洗脱峰中加入硫酸铵粉末至饱和,静置2— 10小时后,收集沉淀,得到hEGF粗制品。
[0011]所述的金属螯合层析柱螯合的金属离子是Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+中的任意一种。优选 Cu2+。
[0012]金属螯合层析柱平衡液为0.01 - 0.2M磷酸盐缓冲液,NaCl浓度为0.2 — 2.0M,ρΗ6.0-8.0。优选0.02Μ磷酸盐缓冲液,NaCl浓度为0.5Μ。
[0013]所述的金属螯合层析柱洗脱溶液为0.05-0.2Μ磷酸盐缓冲液,NH4Cl浓度为
.0.5-1.0Μ, ρΗ6.0-8.0。优选 0.1M 磷酸盐缓冲液,0.8Μ 的 NH4Cl, ρΗ7.5。
[0014]步骤4中超滤浓缩液调节ρΗ6 - 8,电导0.5 — 10mS/cm。优选pH8.0,电导2.2mS/cm。
[0015]在步骤4和步骤5之间,增加一个冲洗步骤,使用pH3 - 6,NaCl浓度≤0.2M来冲洗金属螯合层析柱,所述的冲洗液缓冲介质为0.01 — 0.2M磷酸盐或醋酸盐。优选PH5.0的0.1M醋酸盐缓冲液,氯化钠浓度为0.1M。
[0016]本发明与现有技术相比,具有以下优点:首次实现了从男性尿液中富集及分离hEGF,并使得从人来源中提取hEGF的方法可以工业化实施;首次引入了金属螯合层析工艺,有效分离hEGF,大大降低了 hEGF后续纯化的难度,纯化出的hEGF不含使人体产生过敏反应的异源蛋白;采用高效离子交换吸附剂,放置尿斗或尿池中,进行尿蛋白的在线富集,避免了尿液的大规模运输,降低了成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为制备hEGF粗制品的方法的流程图。
【具体实施方式】
[0018]下面结合【具体实施方式】,进一步阐明本发明,应理解这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围,在阅读了本发明之后,本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
[0019]一种制备hEGF粗制品的方法,包括如下步骤:
1)将离子交换树脂作为吸附剂放置在公共厕所的尿池或尿斗中,吸附流经尿液或稀释尿液中的尿蛋白;
2)收集已吸附尿蛋白的树脂,进行清洗、解吸处理;
3)超滤浓缩;
4)超滤浓缩液调节pH6— 8,电导0.5 — 10mS/cm,优选ρΗ8.0,电导2.2mS/cm,上已平衡好的金属螯合层析柱,再用平衡液冲洗,平衡液为0.01 - 0.2M磷酸盐缓冲液,NaCl浓度为0.2 — 2.0M, pH6.0-8.0,优选0.02M磷酸盐缓冲液,NaCl浓度为0.5M,螯合金属离子是Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+ 中的任意一种,优选 Cu2+ ;
5)用洗脱液洗脱,收集洗脱峰。所述的洗脱溶液为0.05-0.2M磷酸盐缓冲液,NH4Cl浓度为 0.5-1.0M, ρΗ6.0-8.0,优选 0.1M 磷酸盐缓冲液,pH7.5,0.8MNH4C1 ;
6)在收集的洗脱峰中加入硫酸铵粉末至饱和,静置2- 10小时后,收集沉淀,得到hEGF粗制品。
[0020]在步骤4和步骤5之间,增加一个冲洗步骤,使用pH3 - 6,NaCl浓度≤0.2M来冲洗金属螯合层析柱,所述的冲洗液缓冲介质为0.01 - 0.2M磷酸盐或醋酸盐,优选PH5.0的0.1M醋酸盐缓冲液,氯化钠浓度为0.1M。
[0021]实例一
1.大孔型离子交换树脂100公斤作为吸附剂,经过再生处理后,水冲至中性,装入孔径为50目的滤布袋中,将装好树脂的滤布袋放置在人流量较多的厕所的便斗或便池中,使尿液或被水稀释后的尿液流过树脂,24小时后,收集吸附尿蛋白的树脂,将吸附后树脂用饮用水冲洗干净、装柱;用IM的NaCl进行洗脱,收集洗脱峰。
[0022]2.用截留分子量IOK的超滤膜进行超滤浓缩,调节pH7.0,电导0.5mS/cm,上已平衡好的金属离子为Cu2+的金属螯合层析柱(Chelating sepharose FF);再用平衡液(0.2M磷酸盐缓冲,0.2MNaCl, pH7.0)冲洗金属螯合层析柱;用0.1M的醋酸盐缓冲液(pH5.0)冲洗金属螯合层析柱;用0.05M磷酸盐缓冲液,1.0M的NH4Cl,pH8.0,洗脱层析柱,收集洗脱峰(E 液)。
[0023]3.将收集的E液,加入硫酸铵粉末至饱和,边加边搅拌,静置10小时,E液加入硅藻土 20g离心收集和吹干沉淀,得到hEGF粗制品32g。
[0024]通过检测hEGF的收率约93%,活性集中在hEGF粗制品中。hEGF含量如表1所示: 表 I ___
【权利要求】
1.一种制备hEGF粗制品的方法,其特征在于:收集吸附尿蛋白后的吸附剂,集中洗脱,将洗脱出的尿蛋白溶液上样已平衡好的金属螯合层析柱,收集含有hEGF组分的洗脱峰,经过硫Ife按沉淀,制备hEGF粗制品。
2.根据权利要求1所述的制备hEGF粗制品的方法,其特征在于,包括如下步骤: 将阴离子交换树脂作为吸附剂放置在公共厕所的尿池或尿斗中,吸附流经尿液或稀释尿液中的尿蛋白; 收集已吸附尿蛋白的树脂,进行清洗、解吸处理; 超滤浓缩; 超滤浓缩液调节PH和电导,上样已平衡好的金属螯合层析柱,再用平衡液冲洗; 用洗脱溶液洗脱,收集含有hEGF组分的洗脱峰; 在收集的洗脱峰中加入硫酸铵粉末至饱和,静置2 - 10小时后,收集沉淀,得 到hEGF粗制品。
3.根据权利要求1或2所述的制备hEGF粗制品的方法,其特征在于:所述的金属螯合层析柱螯合的金属离子是Cu2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+中的任意一种。
4.根据权利要求1或2所述的制备hEGF粗制品的方法,其特征在于,金属螯合层析柱平衡液为0.01 — 0.2M磷酸盐缓冲液,NaCl浓度为0.2 — 2.0M, ρΗ6.0-8.0。
5.根据权利要求1或2所述的制备hEGF粗制品的方法,其特征在于:所述的金属螯合层析柱洗脱溶液为0.05-0.2M磷酸盐缓冲液,NH4C1浓度为0.5-1.0M, pH6.0-8.0。
6.根据权利要求2所述的制备hEGF粗制品的方法,其特征在于,步骤4中超滤浓缩液调节 pH6 — 8,电导 0.5 — 10mS/cm。
7.根据权利要求2所述的制备hEGF粗制品的方法,其特征在于,在步骤4和步骤5之间,增加一个冲洗步骤,使用PH3 - 6,NaCl浓度< 0.2M来冲洗金属螯合层析柱,所述的冲洗液缓冲介质为0.01 — 0.2M磷酸盐或醋酸盐。
【文档编号】C07K1/34GK103694334SQ201310715778
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】苗丕渠, 苏古方, 吴蓉蓉, 侯晓彦 申请人:扬州艾迪生物科技有限公司