L-谷氨酰胺的精制方法
【专利摘要】本发明属于氨基酸衍生物发酵液的提取及精制【技术领域】，具体涉及一种L-谷氨酰胺提取及精制方法。该方法包括下述的步骤：发酵液的制备：斜面培养、摇瓶菌种、一级种子培养、二级种子培养、继续发酵；发酵产品提取精制：发酵液预处理、离子交换、二次结晶、脱色除杂处理、纳滤膜脱色除杂和浓缩、浓缩结晶、干燥得成品。本发明的有益效果在于，显著降低谷氨酰胺发酵液后续提取、精制液中有机物和无机物杂质含量和色素，提高谷氨酰胺的得率；提高了产品质量，降低了生产成本，很大程度减轻了工人的劳动强度；大大减少了水、酸、碱、活性炭等固液废的排放量，减少了对环境的污染。
【专利说明】L-谷氨酰胺的精制方法
【技术领域】
[0001]本发明属于氨基酸衍生物发酵液的提取及精制【技术领域】，具体涉及一种L-谷氨酰胺提取及精制方法。
【背景技术】
[0002]谷氨酰胺(Glutamin)亦被称作麸酰胺酸，为人体中含量最丰富的非必需氨基酸，
且是唯--种可直 接通过脑血管障壁(BBB)的氨基酸。在人体中储存于骨骼肌或血液中。
当受伤或患病时，谷氨酰胺可能需要借由摄取含Gln的食物来获得足够的量。生物体通过谷氨酰胺合成酶催化谷氨酸和铵盐反应生成谷氨酰胺。
[0003]L-谷氨酰胺，该产品在食品加工中作营养增补剂，调香增补剂。并且L谷氨酰胺是健美运动和健美爱好者的重要营养补剂。它(以下称谷氨酰胺)是肌肉中最丰富的游离氨基酸，约占人体游离氨基酸总量的60%。空腹血浆谷氨酰胺浓度为500 - 750umol/L。谷氨酰胺不是必需氨基酸，它在人体内可由谷氨酸、颉氨酸、异亮氨酸合成。在疾病、营养状态不佳或高强度运动等应激状态下，机体对谷氨酰胺的需求量增加，以致自身合成不能满足需要。
[0004]L-谷氨酰胺在医药、营养保健、食品等领域应用广泛，需求量大，被称之为非必须氨基酸中最重要的品种之一。L-谷氨酰胺是发展新型药物、临床治疗及运动营养保健的重要材料，所有的机体组织都利用L-谷氨酰胺合成细胞浆蛋白和核蛋白。在生理活性方面，除了与胃肠道疾病、动物科学及畜牧兽医业有关外，近年来，又作为人类抗癌武器之一、强化免疫系统而引起关注，有望成为营养疗法的新材料。由于L-谷氨酰胺不仅拥有重要的科学研究、实际生产及应用价值，同时L-谷氨酰胺在生理功能重要性的作用，而且现在国内传统生产方法依旧污染严重、产能产值较低，因此，经国务院和全国人大代表批准，发酵法生产L-谷氨酰胺列入国家“十一五”重点攻关科技项目。
[0005]发酵液一陶瓷膜过滤一絮凝、脱色+陶瓷膜过滤一浓缩结晶一离心一干燥一产
品O
【发明内容】
[0006]为了解决上述的技术问题，本发明利用陶瓷膜、反渗透、纳滤膜和双结晶工序来提取和精制L-谷氨酰胺的方法；采用该方法得到的产品其收率和合格率大大提高。
[0007]本发明的L-谷氨酰胺提取、精制方法是通过下述的技术方案来解决以上的技术问题的:
L-谷氨酰胺的精制方法，该方法包括下述的步骤:
(一)发酵液的制备:
以黄色短杆菌MQG121菌株为发酵菌株；
(1)斜面培养:将安焙管菌种接入无菌斜面培养基28-32°C培养20-24小时；
(2)摇瓶菌种:将培养好的斜面菌种接入无菌摇瓶种子培养基28-32°C培养16-20小
时；(3)—级种子培养:将培养好的摇瓶种液接入无菌一级种子培养基，1:0.5通风条件下，搅拌转速240rpm，28-32°C培养12-16小时；
(4)二级种子培养:将培养好的一级种液接入无菌二级种子培养基，1:0.5通风条件下，搅拌转速220rpm，28-32 °C培养2-6小时；
(5)将培养好的二级种子接种到灭菌的发酵培养基中，1:0.3通风条件下，搅拌转速140rpm,发酵过程用液氨调节pH值至7.0-7.2，经过O —12小时菌体培养，然后调节pH值至5.5-5.7，12—44小时产品合成培养，过程用液氨控制PH，流加糖控制糖含量2.0—0%,得到含谷氨酰胺产品的发酵液；
上述的发酵培养基为:
酵母膏 0.8-1.4%豆柏水解液 1.0-2.0%
甸萄糖 12-16%,玉米衆0.5-3.0%
(NH4) SO4 4-8%,NaCl0.2-0.8%,
NaH2PO4 0.1-0.4%,MgSO40.01-0.08%,
MnSO48-12mg/L,CuSO40.5_2mg/L
维生素 B1 0.5-2mg/ L ；
上述的黄色短杆菌菌株于2013年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8468 ；
(二)发酵广品提取精制:
陶瓷膜过滤:将常温状态下的发酵液送入陶瓷膜循环过滤得到发酵清液，循环过程中使用循环水为陶瓷膜循环料液降温，使循环发酵液的温度保持在70°C以下，陶滤浓缩液加入反渗透水清洗出残留的产品；通过陶瓷膜过滤除去发酵液中的菌体和大分子杂质，制得陶滤清液。
[0008]一次结晶:将浓缩后的料液在50°C、80rpm条件下真空浓缩，浓缩液产品含量为60%，真空度为-0.098Mpa，用循环水以10—15°C /h的降温速度降温至15°C，再养晶4小时，养晶搅拌转速为20rpm,经1200rpm转速的离心机离心得到湿品结晶；
粗品回溶:先把反渗透水升温至70°C，搅拌转速为40rpm，将湿品结晶溶解，按产品含量为10%的量投入粗品，用试剂盐酸调至pH3.5，将结晶完全溶解；制得粗品溶解液。
[0009]离子交换:将含量为10%、pH为3.5、温度为45°C的料液以I倍树脂体积/小时的流速通过732阳离子交换柱，通过阳离子交换柱的料液以相同的速度流入330阴离子交换柱，通过离子交换树脂除去料液中的有机、无机杂质，制得离交液；
纳滤:将经过阳阴离子交换柱除杂后的料液常温状态下进入纳滤设备循环过滤；循环过程中使用循环水为纳滤循环料液降温，使循环料液的温度保持在50°C以下，纳滤浓缩液加入反渗透水清洗出残留的产品；通过纳滤除去料液中的有机小分子杂质，制得到纳滤透析料液。
[0010]脱色除杂处理:用活性炭对纳滤透析料液进行脱色除杂处理，将料液升温至700C，加入0.3%药用767活性炭，保温30分钟，搅拌转速为60rpm，待透过率达到95%以上后通过芬特过滤器循环过滤除去料液中的活性炭，制得脱色液。
[0011]反渗透浓缩:将脱色后的料液降温至40°c，进入反渗透浓缩器循环浓缩至含量达到15% ;循环过程中使用循环水为循环液降温，保持料液温度< 50°C，制得反渗透浓缩液。用H型732阳离子交换树脂调节料液PH至6.0—6.5。
[0012]二次结晶:将反渗透浓缩液打入单效浓缩结晶罐，保持浓缩温度为< 50°C，真空度为-0.098Mpa,搅拌转速保持60rpm，当浓缩液产品含量为60%以上，保持搅拌转速20rpm,用循环水已15—15°C /h的降温速度降至15°C,养晶4小时,经离心机离心得到湿品结晶;
干燥:将湿品结晶产品经双锥干燥器干燥，其条件是:真空度-0.098Mpa，使用温度为80°C的热水循环保持干燥温度< 50°C，干燥6h，待产品温度< 40°C包装，包装环境条件为:温度181:—251:，湿度≤70%。
[0013]优选的，上述的发酵液的制备过程中:
以黄色短杆菌MQG121菌株为发酵菌株；
(1)斜面培养:将安焙管菌种接入无菌斜面培养基28-32°C培养20-24小时；
(2)摇瓶菌种:将培养好的斜面菌种接入无菌摇瓶种子培养基28-32°C培养16-20小
时；
(3)—级种子培养:将培养好的摇瓶种液接入无菌一级种子培养基，1:0.5通风条件下，搅拌转速240rpm，28-32°C培养12-16小时；
(4)二级种子培养:将培养好的一级种液接入无菌二级种子培养基，1:0.5通风条件下，搅拌转速220rpm，28-32 °C培养2-6小时；
(5)将培养好的二级种子接种到灭菌的发酵培养基中，1:0.3通风条件下，搅拌转速140rpm,发酵过程用液氨调节pH值至7.0-7.2，经过O —12小时菌体培养，然后调节pH值至5.5-5.7，12—44小时产品合成培养，过程用液氨控制PH，流加糖控制糖含量2.0—0%,得到含谷氨酰胺产品的发酵液；
更优选的，上述的发酵培养基为:
酵母膏 1.0%豆柏水解液 1.5%
葡萄糖 14%玉米浆2%
(NH4) SO4 6%,NaCl0.6%,
NaH2PO4 0.3%,MgSO40.05%,
MnSO4 10mg/L,CuSO4lmg/L
维生素B1 lmg/L。
[0014]本发明所采用的黄色短杆菌菌株于2013年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8468 ；保藏地址是:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编:100101。
[0015]本发明的有益效果在于:
(I)在L-谷氨酰胺的精制过程中，利用陶瓷膜设备除去发酵液中的生产菌和大分子蛋白，代替传统的板框除菌技术，减少了占地面积和劳动强度；采用陶瓷膜进行谷氨酰胺发酵液的除菌，不仅可以回收蛋白，由于过滤液质量的提高，还可以显著减少离子树脂的用量(由树脂对产品的交换量原来的100kg/m3提高到150kg/m3)，双结晶工序可以显著降低谷氨酰胺后续提取精制液中菌体、有机物和无机物杂质含量，提高谷氨酰胺的得率；
(3)采用超滤膜和钠滤膜过滤技术除去料液中的有机色素和小分子有机物，使得料液中有机杂质大大降低，提高了料液的透光率，降低了活性炭的用量；(4)采用反渗透进行浓缩预处理，减少了高温浓缩对产品的破坏，减少了蒸汽的使用，降低了能耗，减少了污水排放，保证了进离子交换柱料液的质量，加大了离子交换柱对产品的吸附能力，减少了树脂的用量；离子交换解析液谷氨酰胺含量由传统的5.5%提高到8%，离交液纯度得到大大提高，提高了产品质量，降低了生产成本，大大减轻了工人的劳动强度。
[0016](5)在产品浓缩阶段采用国际上通用的膜浓缩分离工艺代替传统的减压浓缩工艺，即减少了对产品的破坏，又降低了生产成本。而且采用了钠滤膜生产工艺，提高了产品的质量，还减少了过去发酵法传统工艺的树脂用量，大大减少了水、酸、碱、活性炭等固液废的排放量，减少了对环境的污染。
[0017]通过上述处理方法，成品对于发酵液来说总收率能达到85%以上(相对于除去菌体的净L-谷氨酰胺含量计算)，成品一次合格率达到100%，而传统工艺只能达到50%的总收率，一次合格率只有98%。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为本发明的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0019]下面结合附图和【具体实施方式】来对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。
[0020]提取生产工艺
L-谷氨酰胺的提取及精制方法，该方法包括下述的步骤:
(一)发酵液的制备:
以黄色短杆菌MQG121菌株为发酵菌株；
(1)斜面培养:将安焙管菌种接入无菌斜面培养基28-32°C培养20-24小时；
(2)摇瓶菌种:将培养好的斜面菌种接入无菌摇瓶种子培养基28-32°C培养16-20小
时；
(3)—级种子培养:将培养好的摇瓶种液接入无菌一级种子培养基，1:0.5通风条件下，搅拌转速240rpm，28-32°C培养12-16小时；
(4)二级种子培养:将培养好的一级种液接入无菌二级种子培养基，1:0.5通风条件下，搅拌转速220rpm，28-32 °C培养2-6小时；
(5)将培养好的二级种子接种到灭菌的发酵培养基中，1:0.3通风条件下，搅拌转速140rpm,发酵过程用液氨调节pH值至7.0-7.2，经过O —12小时菌体培养，然后调节pH值至5.5-5.7，12—44小时产品合成培养，过程用液氨控制PH，流加糖控制糖含量2.0—0%,得到含谷氨酰胺产品的发酵液；
上述的发酵培养基为:
酵母膏 1.0%豆柏水解液 1.5%
葡萄糖 14%玉米浆2%
(NH4) SO4 6%,NaCl0.6%,
NaH2PO4 0.3%,MgSO40.05%,MnSO4 lOmg/L,CuSO4lmg/L
维生素B1 lmg/L
上述的黄色短杆菌菌株/7ara?)于2013年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8468 ；
(二)发酵广品提取精制:
陶瓷膜过滤:将常温状态下的发酵液送入陶瓷膜循环过滤得到发酵清液，循环过程中使用循环水为陶瓷膜循环料液降温，使循环发酵液的温度保持在70°C以下，陶滤浓缩液加入反渗透水清洗出残留的产品；通过陶瓷膜过滤除去发酵液中的菌体和大分子杂质，制得陶滤清液。
[0021]一次结晶:将浓缩后的料液在50°C、80rpm条件下真空浓缩，浓缩液产品含量为60%，真空度为-0.098Mpa，用循环水以10—15°C /h的降温速度降温至15°C，再养晶4小时，养晶搅拌转速为20rpm,经1200rpm转速的离心机离心得到湿品结晶；
粗品回溶:先把反渗透水升温至70°C，搅拌转速为40rpm，将湿品结晶溶解，按产品含量为10%的量投入粗品，用试剂盐酸调至pH3.5，将结晶完全溶解；制得粗品溶解液。
[0022]离子交换:将含量为10%、pH为3.5、温度为45°C的料液以I倍树脂体积/小时的流速通过732阳离子交换柱，通过阳离子交换柱的料液以相同的速度流入330阴离子交换柱，通过离子交换树脂除去料液中的有机、无机杂质，制得离交液；
纳滤:将经过阳阴离子交换柱除杂后的料液常温状态下进入纳滤设备循环过滤；循环过程中使用循环水为纳滤循环料液降温，使循环料液的温度保持在50°C以下，纳滤浓缩液加入反渗透水清洗出残留的产品；通过纳滤除去料液中的有机小分子杂质，制得到纳滤透析料液。
[0023]脱色除杂处理:用活性炭对纳滤透析料液进行脱色除杂处理，将料液升温至700C，加入0.3%药用767活性炭，保温30分钟，搅拌转速为60rpm，待透过率达到95%以上后通过芬特过滤器循环过滤除去料液中的活性炭，制得脱色液。
[0024]反渗透浓缩:将脱色后的料液降温至40°C，进入反渗透浓缩器循环浓缩至含量达到15% ;循环过程中使用循环水为循环液降温，保持料液温度< 50°C，制得反渗透浓缩液。用H型732阳离子交换树脂调节料液PH至6.0—6.5。
[0025]二次结晶:将反渗透浓缩液打入单效浓缩结晶罐，保持浓缩温度为< 50°C，真空度为-0.098Mpa,搅拌转速保持60rpm，当浓缩液产品含量为60%以上，保持搅拌转速20rpm,用循环水已15—15°C /h的降温速度降至15°C,养晶4小时,经离心机离心得到湿品
结晶;
干燥:将湿品结晶产品经双锥干燥器干燥，其条件是:真空度-0.098Mpa，使用温度为80°C的热水循环保持干燥温度< 50°C，干燥6h，待产品温度< 40°C包装，包装环境条件为:温度18°C—25°C，湿度≤70%。
[0026](2) L-谷氨酰胺在50m3发酵罐生产中提取、精制结果统计 生产统计结果如下
【权利要求】
1.L-谷氨酰胺的精制方法，其特征在于，该方法包括下述的步骤: (一)发酵液的制备: 以黄色短杆菌MQG121菌株为发酵菌株； (1)斜面培养:将安焙管菌种接入无菌斜面培养基28-32°C培养20-24小时； (2)摇瓶菌种:将培养好的斜面菌种接入无菌摇瓶种子培养基28-32°C培养16-20小时； (3)—级种子培养:将培养好的摇瓶种液接入无菌一级种子培养基，1:0.5通风条件下，搅拌转速240rpm，28-32°C培养12-16小时； (4)二级种子培养:将培养好的一级种液接入无菌二级种子培养基，1:0.5通风条件下，搅拌转速220rpm，28-32 °C培养2-6小时； (5)将培养好的二级种子接种到灭菌的发酵培养基中，1:0.3通风条件下，搅拌转速140rpm,发酵过程用液氨调节pH值至7.0-7.2，经过O —12小时菌体培养，然后调节pH值至5.5-5.7，12—44小时产品合成培养，过程用液氨控制PH，流加糖控制糖含量2.0—0%,得到含谷氨酰胺产品的发酵液； 上述的发酵培养基为: 酵母膏 0.8-1.4%豆柏水解液 1.0-2.0% 甸萄糖 12-16%,玉米衆0.5-3.0% (NH4) SO4 4-8%,NaCl0.2-0.8%, NaH2PO4 0.1-0.4%,MgSO40.01-0.08%, MnSO48-12mg/L,CuSO40.5_2mg/L 维生素 B1 0.5-2mg/L ； 上述的黄色短杆菌菌株于2013年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8468 ； (二)发酵广品提取精制: 陶瓷膜过滤:将常温状态下的发酵液送入陶瓷膜循环过滤得到发酵清液，循环过程中使用循环水为陶瓷膜循环料液降温，使循环发酵液的温度保持在70°C以下，陶滤浓缩液加入反渗透水清洗出残留的产品；通过陶瓷膜过滤除去发酵液中的菌体和大分子杂质，制得陶滤清液； 一次结晶:将浓缩后的料液在50°C、80rpm条件下真空浓缩，浓缩液产品含量为60%，真空度为-0.098Mpa，用循环水以10—15°C /h的降温速度降温至15°C，再养晶4小时，养晶搅拌转速为20rpm,经1200rpm转速的离心机离心得到湿品结晶； 粗品回溶:先把反渗透水升温至70°C，搅拌转速为40rpm，将湿品结晶溶解，按产品含量为10%的量投入粗品，用试剂盐酸调至pH3.5，将结晶完全溶解；制得粗品溶解液； 离子交换:将含量为10%、pH为3.5、温度为45°C的料液以I倍树脂体积/小时的流速通过732阳离子交换柱，通过阳离子交换柱的料液以相同的速度流入330阴离子交换柱，通过离子交换树脂除去料液中的有机、无机杂质，制得离交液； 纳滤:将经过阳阴离子交换柱除杂后的料液常温状态下进入纳滤设备循环过滤；循环过程中使用循环水为纳滤循环料液降温，使循环料液的温度保持在50°C以下，纳滤浓缩液加入反渗透水清洗出残留的产品；通过纳滤除去料液中的有机小分子杂质，制得到纳滤透析料液； 脱色除杂处理:用活性炭对纳滤透析料液进行脱色除杂处理，将料液升温至70°C，加入0.3%药用767活性炭，保温30分钟，搅拌转速为60rpm，待透过率达到95%以上后通过芬特过滤器循环过滤除去料液中的活性炭，制得脱色液； 反渗透浓缩:将脱色后的料液降温至40°C，进入反渗透浓缩器循环浓缩至含量达到15% ;循环过程中使用循环水为循环液降温，保持料液温度< 50°C，制得反渗透浓缩液；用H型732阳离子交换树脂调节料液PH至6.0—6.5 ； 二次结晶:将反渗透浓缩液打入单效浓缩结晶罐，保持浓缩温度为< 50°C，真空度为-0.098Mpa，搅拌转速保持60rpm，当浓缩液产品含量为60%以上，保持搅拌转速20rpm，用循环水已15 — 15°C /h的降温速度降至15°C，养晶4小时，经离心机离心得到湿品结晶；干燥:将湿品结晶产品经双锥干燥器干燥，其条件是:真空度-0.098Mpa，使用温度为80°C的热水循环保持干燥温度< 50°C，干燥6h，待产品温度< 40°C包装，包装环境条件为:温度18°C—25°C，湿度≤70%。
2.如权利要求1所述的一种L-谷氨酰胺的精制方法，其特征在于，所述发酵液的精制过程中: 以黄色短杆菌MQG121菌株为发酵菌株； (1)斜面培养:将安焙管菌种接入无菌斜面培养基28-32°C培养20-24小时； (2)摇瓶菌种:将培养好的斜面菌种接入无菌摇瓶种子培养基28-32°C培养16-20小时； (3)—级种子培养:将培养好的摇瓶种液接入无菌一级种子培养基，1:0.5通风条件下，搅拌转速240rpm，28-32°C培养12-16小时； (4)二级种子培养:将培养好的一级种液接入无菌二级种子培养基，1:0.5通风条件下，搅拌转速220rpm，28-32 °C培养2-6小时； (5)将培养好的二级种子接种到灭菌的发酵培养基中，1:0.3通风条件下，搅拌转速140rpm，发酵过程用液氨调节pH值至7.0-7.2，经过O —12小时菌体培养，然后调节pH值至5.5-5.7，12—44小时产品合成培养，过程用液氨控制PH，流加糖控制糖含量2.0—0%,得到含谷氨酰胺产品的发酵液。
3.如权利要求1所述的一种L-谷氨酰胺的精制方法，其特征在于，所述的发酵培养基为: 酵母膏 1.0%豆柏水解液 1.5% 葡萄糖 14%玉米浆2% (NH4) SO4 6%,NaCl0.6%, NaH2PO4 0.3%,MgSO40.05%, MnSO4 10mg/L,CuSO4lmg/L 维生素B1 lmg/L。
【文档编号】C07C231/24GK103695491SQ201310721043
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月24日 优先权日:2013年12月24日
【发明者】高树营, 胡安红 申请人:山东民强生物科技股份有限公司