抗-ErbB2抗体变异体的制作方法

抗-ErbB2抗体变异体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及抗-ErbB2抗体变异体或其抗原结合片段、对这些进行编码的核酸分子及它们的用途。本发明的抗体变异体能够以高的亲和度与ErbB2相结合。因此，上述抗体变异体即使使用少量也能有效地预防或治疗癌。
【专利说明】抗-ErbB2抗体变异体
[0001] 【相关申请的交叉引用】
[0002] 本申请是2013年4月26日提交的国际申请的国家阶段，其要求2012年5月8日 提交的韩国专利申请No. 2012-0048805的优先权，其全部内容通过引用并入本文。 【【技术领域】】
[0003] 本发明涉及抗_ErbB2抗体变异体或其抗原结合片段、对这些进行编码的核酸分 子及它们的用途。 【【背景技术】】
[0004] 众所周知，HER2 (ErbB2)作为 EGFR (ErbBl)、HER3 (ErbB3)及 HER4 (ErbB4)等受 体酪氨酸激酶（receptor tyrosin kinase)的一个种类，存在于细胞膜，并对细胞的生 长、分化及生存起到重要的作用（Jaclyn et al. Clin Breast Cancer. 8:38-49(2008))。 HER2与其他HER家族蛋白不同，不会以依赖性的方式对配体进行活性化，而是始终以活性 化的状态起作用，并且，通常在正常细胞中，在细胞膜中表达约20000个左右，但在癌细胞 中，过度表达约在正常细胞中的表达量的100倍即约20000000个左右（Shepard et al. J Clin Immunol. 11:117-127(1991))。这种 HER2 的过度表达不仅过度诱导 HER2-HER2 同 型二聚体（homodimer)，还过度诱导与作为其他HER家族的HERl或HER3的异源二聚体 (heterodimer)，其结果，引发细胞的增殖及生长，促进变形为癌细胞（Mayumi et al.Clin Cancer Res. 12:7242-7251 (2006))。
[0005] 到目前为止，在乳腺癌（25-30 % )、卵巢癌（15-30% )、胃癌（23% )、肺癌 (11-32%)、肾癌（30-40%)、直肠癌（17-90 %)、胰腺癌（26-45 %)、膀胱癌（44%)、前 列腺癌（12% )及头颈癌（29-39% )等多种癌细胞中报告了 HER2的过度表达（Cancer Tmmunol Immunother 53:166-175 (2004) ;Clin Cancer Res 12:4377s_4383s(2006) ;Br J Cancer 91:1195-1199(2004) ;Cancer 94:2584-2589(2002) ;Cancer 98:66-73(2003); Int J Oncol 27 :681-685(2005) ；Int J Pancreatol 17:15-21(1995) ；Int J Cancer 87:349-359(2000) ;Ann Oncol 12:S15-S19(2001) J Pathol 204:317-325(2004))。并 且，在子宫内膜癌、涎腺癌、结肠癌及甲状腺癌中观察到了 HER2的过度表达（Science 229:974(1985) ；Lancet ： 1:765-767(1986) ；Mol Cell Biol.6:955-958(1986) ；0ncogene Res.3:21-31 (1988) ；0ncogene 4:81-88(1989) ；Cancer Res. 51:1034(1991) ；Gynecol. Oncol,38:364 (1990) ；Cancer Res. 50:421-425 (1990) ；Cancer Res. 50:5184 (1990)； Cancer Res.49:6605 (1989) ；Mol.Carcinog. 3:254-257 (1990) ；Br.J.Cancer 57:358-363(1988) ;Pathobiology59:46-52(1991) ;Cancer 65:88-92(1990))。
[0006] 将HER2作为祀的抗癌治疗剂由美国基因泰克（Genentech)公司研发，且唯一的 是从1998年开始销售的赫赛汀（Hereeptill?,曲妥珠单抗（Trastuzumab)，4D5)，适应 症为将过度表达HER2的转移性乳腺癌或早期乳腺癌与其他抗癌剂一同并用用药（J. Clin. Oncol. 17:2639-2264(1999))。已知赫赛汀作用于HER2的细胞外域IV，并抑制HER2-HER2 之间的同型二聚体的生成，抑制癌细胞的生存和增殖（Ann Oncol 18:977-984(2007))。
[0007] 但据报告，作为HER2靶抗癌治疗剂，虽然赫赛汀已获得成功，但当单独用药时，呈 现出12-34%左右的反应效果，当并用用药时，呈现出38-50%左右的反应效果，并且，当单 独用药时，2-7%呈现出异常的心脏疾病，当并用用药时，11-28%呈现出异常的心脏疾病， 而在10位女性中的一位左右因担心会增加已具有的心脏疾病的危险而无法接受赫赛汀的 药物治疗（N Engl J Med 357:39-51 (2007))。因此，需要研发副作用少于赫赛汀的后续抗 体，当前，美国基因泰克（Genetech)公司所研发的奥密塔克（Omnitarg)在临床第三阶段 (Clin Cancer Res 12:4436s_4440s (2006))。但是，奥密塔克（Omnitarg)与赫赛汀相比， 虽然在副作用方面具有优点，但存在功效下降的缺点。基于这种理由，急需新的HER2抗体 或其改善的形态，例如亲和性或功效等得到增加的4D5抗体变异体。
[0008] 通常，获得对抗原的高亲和度抗体由于露出的抗原的表面受限而变得困难。尤 其，这种现象在从幼稚（naive)噬菌体展示文库执行体外筛选（in vitro selection)时 更容易发生。因此，从幼稚噬菌体展示文库通常所获得的抗体的亲和度仅为IO-IOOnM左右 (Iwai et al. Protein Eng Des Sel. 23:185-193 (2010))〇
[0009] 用于提高抗体的亲和度的方法可分为随机方法（random approach)和靶方法 (targeted approach) (Sheedy et al. Biotechnol Adv. 5 (4) :333-52 (2007))。祀突变诱 发（Targeted mutagenesis)为针对特定CDR或FR,即特定氨基酸给予突变的方法，可利用 革巴聚合酶链式反应（targeted PCR)、Q)R步行（O)R walking)、定点诱变（site-directed mutagenesis)及⑶R祀热点（O)R target hotspot)等方法。随机突变诱发（Random mutagenesis)为针对可变域给予变异的方法，可利用易错聚合酶链式反应（error-prone PCR)、DNA 改组及链改组等方法（Kim et al. Adv Drug Deliv Rev. 58:657-667(2006))。将 利用这种方法制备的多种变异体制成文库，并经由通过在噬菌体的表面展示多种变异体 文库，来进行筛选的过程。此外，也利用酵母展示及核糖体展示（Rader et al. Curr Opin Biotechnol.8:503-508(1997) ;Zahnd et al.J Biol Chem.279 (18):18870-18877(2004))。
[0010] 在本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文 及专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确地说明本发明所属的

【技术领域】的水平及本发明的内容。
[0011] 【发明概述】
[0012] 本发明人为了研发抗原亲和度及癌细胞增殖抑制活性比对ErbB2的人源化抗体 的4D5得到改善的抗体变异体而努力。结果，制备了与母源抗体相比，表达更高的抗原亲和 度和癌细胞增殖抑制活性的抗_ErbB2抗体变异体。
[0013] 因此，本发明的目的在于，提供抗-ErbB2抗体变异体或其抗原结合片段。
[0014] 本发明的再一目的在于，提供对上述抗体变异体或其抗原结合片段的重链可变域 进行编码的核酸分子。
[0015] 本发明的另一目的在于，提供对上述抗体变异体或其抗原结合片段的轻链可变域 进行编码的核酸分子。
[0016] 本发明的还有一目的在于，提供癌的预防或治疗用药剂学组合物。
[0017] 本发明的又一目的在于，提供癌的预防或治疗方法。
[0018]


【发明内容】
、发明要求保护范围及附图使本发明的其他目的及优点更加明确。 【【专利附图】

【附图说明】】
[0019] 图1表示表达用于展示scFv的额外的转录体的载体的一部分。可读框可对OmpA 分泌信号序列、轻链可变域（VJ、连接序列（L)、重链可变域（Vh)、c-myc标签序列及病毒衣 壳蛋白进行编码。
[0020] 图2为用于筛选生产与ErbB2相结合的scFv-ρ?π分子的E. COli克隆的单克隆 ELISA结构的图表。
[0021] 图3对人源化抗体4D5的重链可变域（SEQ ID NO :1)、AH06和A058的重链可变域 (SEQ ID NO :3)、AH16 的重链可变域（SEQ ID NO :4)及 A091 的重链可变域（SEQ ID NO :6) 的氨基酸序列进行比较并示出。
[0022] 图4对人源化抗体4D5、AH06、AH16的轻链可变域（SEQ ID NO :2)、A058的轻链可 变域（SEQ ID NO :5)及A091的轻链可变域（SEQ ID NO :7)的氨基酸序列进行比较并示出。
[0023] 图5表示在动物细胞中生产及纯化的本发明的抗-ErbB2抗体变异体的SDS-PAGE 结果。
[0024] 图6至图8表示对抗-ErbB2抗体变异体的细胞增殖抑制活性的分析结果。图6 : D98W ;图7 :A058和A091 ;图8 :AH06和AH16。在NCI-N87细胞中经6天的时间评价了纯化 的 IgG。
[0025] 【发明详述】
[0026] 根据本发明的一实施方式，本发明提供抗_ErbB2抗体变异体或其抗原结合片段， 上述供抗_ErbB2抗体变异体或其抗原结合片段包含：（a)轻链可变域，以及（b)重链可变 域，具有选自主要由以下氨基酸取代组成的组中的2种以上的氨基酸取代：在SEQ ID NO :1 的氨基酸序列中，基于卡巴特编号系统（Kabat numbering system)的位置41的Pro被Arg 取代，位置96的Gly被Asn取代，位置97的Gly被Ala取代，位置98的Asp被Trp取代， 位置98的Asp被Lys取代，位置100b的Ala被Ser取代，位置100c的Met被Phe取代，位 置101的Asp被Ala取代，位置101的Asp被Val取代，位置102的Tyr被His取代，位置 102的Tyr被Leu取代。
[0027] 本发明人为了研发抗原亲和度及癌细胞增殖抑制活性比对ErbB2的人源化抗体 的4D5得到改善的抗体变异体而努力。结果，制备了与母源抗体相比，表达更高的抗原亲和 度和癌细胞增殖抑制活性的抗_ErbB2抗体变异体。
[0028] 以下，进行详细说明。
[0029] 【I·抗_ErbB2抗体变异体及其抗原结合片段】
[0030] 本发明的抗体变异体对ErbB2具有特异性结合力。
[0031] 在本说明书中所使用的术语"抗体变异体（antibody variant) "是指包含对ErbB2 的人源化抗体4D5的重链可变域和/或轻链可变域中的分别取代2种以上的氨基酸的可变 域的氨基酸取代变异体。即，本发明通过取代母源抗体4D5的重链和/或轻链可变域中的 特定位置的氨基酸，来提供抗原亲和力及癌细胞增殖抑制活性得到改善的抗体变异体。
[0032] 如在以下实施例中所确认，本发明的抗体变异体与作为母源抗体的4D5相比，对 ErbB2的亲和力最大提高8倍（表5)，并且与4D5相比，以优秀约3. 5倍的活性来抑制胃癌 细胞的增殖（图8)。
[0033] 上述4D5抗体的重链可变域包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列，4D5抗体的轻链可 变域包含SEQ ID NO : 2的氨基酸序列。
[0034] 本发明的抗体变异体不仅包含完整的抗体形态，还包含抗体分子的抗体片段。
[0035] 完整的抗体为具有2个整体长度的轻链及2个整体长度的重链的结构，各轻链以 二硫键方式与重链相连接。重链恒定区具有Υ、μ、α、δ及ε类型，作为亚类具有Y 1、 Y 2、Y 3、Y 4、α 1及α 2。轻链的恒定区具有κ及λ类型。
[0036] 抗体分子的抗原结合片段或抗体片段是指保持抗原结合功能的片段，包含Fab、 F(ab'）、F(ab'）2及Fv等。抗体片段中的Fab作为具有轻链及重链的可变域和轻链的恒 定区及重链的第一个恒定区（Chi)的结构，具有1个抗原结合部位。Fab'在重链Cm域的 C-末端包含具有1种以上的半胱氨酸残基的铰链区（hinge region),在这一方面与Fab有 所不同。Fab'的铰链区的半胱氨酸残基形成二硫键，并生成F(ab'）2抗体。Fv为仅具有重 链可变域及轻链可变域的最小的抗体片，用于生成Fv片段的重组技术公开于PCT国际公 开专利申请 W088/10649、W088/106630、W088/07085、W088/07086 及 W088/09344 中。双链 Fv (two-chain Fv)以非共价键方式连接重链可变域与轻链可变域，单链Fv (single-chain Fv) -般通过连接肽将重链的可变域与单链的可变域以共价键方式相连接，或者在C-末端 直接连接，从而可像双链Fv-样形成如同二聚体的结构。这种抗体片段可利用蛋白水解酶 获得（例如，若利用木瓜蛋白酶限制切割整个抗体，则可获得Fab，若利用胃蛋白酶切割，则 可获得F (ab'）2片段），优选地，可通过基因重组技术制备。
[0037] 在本发明中，抗体优选为Fv形态或完整的抗体形态。并且，重链恒定区可选自Y、 μ、α、δ或ε中的一种同型。恒定区优选为Yl(IgGl)、Y3(IgG3)或Y4(IgG4)。轻链 恒定区可以为κ或λ型。
[0038] 在本说明书中所说明的术语"重链"是指包含用于对抗原赋予特异性的具有充分 的可变域序列的氨基酸序列的可变域V h及包含3个恒定域Cm、Ch2及Ch3的整体长度重链及 其片段。并且，在本说明书中所说明的术语"轻链"是指包含用于对抗原赋予特异性的具有 充分的可变域序列的氨基酸序列的可变域 '及恒定域Q的整体长度轻链及其片段。
[0039] 根据本发明的优选实例，上述重链可变域包含以下氨基酸取代：
[0040] (i)在SEQ ID NO: 1的氨基酸序列中，基于卡巴特编号系统的位置98的Asp被Trp 取代，位置100c的Met被Phe取代，位置101的Asp被Ala取代，位置102的Tyr被Leu取 代（SEQ ID NO :3);
[0041] (ii)在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中，基于卡巴特编号系统的位置96的Gly被 Asn取代，位置97的Gly被Ala取代，位置98的Asp被Lys取代，位置100b的Ala被Ser 取代，位置100c的Met被Phe取代，位置101的Asp被Val取代，位置102的Tyr被His取 代（SEQ ID NO :4);或
[0042] (iii)在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中，基于卡巴特编号系统的位置41的Pro被 Arg取代，位置98的Asp被Trp取代，位置100c的Met被Phe取代，位置101的Asp被Ala 取代，位置102的Tyr被Leu取代（SEQ ID NO :6)。
[0043] 在本说明书中，在说明上述重链可变域的氨基酸取代的过程中所提及的基于卡巴 特编号系统的位置41是指SEQ ID NO: 1的第41位氨基酸，即Pro,位置96是指SEQ ID NO: 1的第100位氨基酸，即Gly，位置97是指SEQ ID NO : 1的第101位氨基酸，即Gly，位置98 是指SEQ ID NO :1的第102位氨基酸，即Asp，位置IOOb是指SEQ ID NO :1的第106位氨 基酸，即Ala，位置IOOc是指SEQ ID NO: 1的第107位氨基酸，即Met，位置101是指SEQ ID NO :1的第108位氨基酸，即Asp，位置102是指SEQ ID NO :1的第109位氨基酸，即Tyr。
[0044] 根据本发明的优选实例，上述轻链可变域包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列或包含 以下氨基酸取代：2种以上的氨基酸取代选自主要由以下取代组成的组中，在SEQ ID NO :2 的氨基酸序列中，基于卡巴特编号系统的位置50的Ser被Thr取代，位置51的Ala被Thr 取代，位置52的Ser被Thr取代，位置53的Phe被Trp取代，位置54的Leu被Pro取代， 位置72的Thr被Ser取代，位置91的His被Tyr取代，位置93的Thr被Gln取代，位置93 的Thr被Asn取代，位置96的Pro被Ala取代，位置96的Pro被Val取代，位置97的Thr 被Ser取代。
[0045] 根据本发明的更优选实例，上述轻链可变域包含以下氨基酸取代：
[0046] (i)在SEQ ID NO :2的氨基酸序列中，基于卡巴特编号系统的位置93的Thr被Gln 取代，位置96的Pro被Ala取代，位置97的Thr被Ser取代（SEQ ID NO :5);或
[0047] (ii)在SEQ ID NO :2的氨基酸序列中，基于卡巴特编号系统的位置50的Ser被 Thr取代，位置51的Ala被Thr取代，位置52的Ser被Thr取代，位置53的Phe被Trp取 代，位置54的Leu被Pro取代，位置72的Thr被Ser取代，位置91的His被Tyr取代，位 置93的Thr被Asn取代，位置96的Pro被Val取代（SEQ ID NO : 7)。
[0048] 在本说明书中，在说明上述轻链可变域的氨基酸取代的过程中所提及的基于卡巴 特编号系统的位置50是指SEQ ID NO :2的第50位氨基酸，S卩Ser，位置51是指SEQ ID NO: 2的第51位氨基酸，即Ala，位置52是指SEQ ID NO :2的第52位氨基酸，即Ser，位置53是 指SEQ ID NO : 2的第53位氨基酸，即Phe，位置54是指SEQ ID NO : 2的第54位氨基酸，即 Leu，位置72是指SEQ ID NO :2的第72位氨基酸，即Thr，位置91是指SEQ ID NO :2的第 91位氨基酸，即His，位置93是指SEQ ID NO :2的第93位氨基酸，即Thr，位置96是指SEQ ID NO :2的第96位氨基酸，即Pro,位置97是指SEQ ID NO :2的第97位氨基酸，即Thr。
[0049] 根据本发明的优选实例，本发明的抗体变异体或其抗原结合片段包含：(a)重链 可变域，选自主要由SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4及SEQ ID NO :6组成的组中；以及（b)轻 链可变域，选自主要由SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :5及SEQ ID NO :7组成的组中。
[0050] 根据本发明的更优选实例，本发明的抗体变异体或其抗原结合片段包含以下轻链 可变域及重链可变域：
[0051] ⑴SEQ ID NO : 2的轻链可变域及SEQ ID NO : 3的重链可变域；
[0052] (ii) SEQ ID NO :2的轻链可变域及SEQ ID NO :4的重链可变域；
[0053] (iii) SEQ ID NO :5的轻链可变域及SEQ ID NO :3的重链可变域；或
[0054] (iv) SEQ ID NO :7的轻链可变域及SEQ ID NO :6的重链可变域。
[0055] 本发明的抗体包含单一克隆抗体、多特异性抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗 体、单链Fvs(scFV)、单链抗体、Fab片段、F(ab'）片段、二硫键Fvs(sdFV)及抗-独特型 (抗-Id)抗体和上述抗体的表位结合片段等，但并不局限于此。
[0056] 根据本发明的优选实例，本发明的抗体为人源化抗体（humanized antibody)。
[0057] 本发明的抗体变异体或抗体片段在可特异性地识别HER2的范围内，包含在本说 明书中所记载的本发明的抗_ErbB2抗体变异体序列，还包含其生物学等同物。例如，为了 更加改善抗体的结合亲和度和/或其他生物学特性，可使抗体的氨基酸序列发生追加的变 化。这种变形包含例如抗体的氨基酸序列残基的缺失、插入和/或取代。这种氨基酸变异可 基于氨基酸侧链取代体的相对类似性，例如，疏水性、亲水性、电荷、大小等实现。根据氨基 酸侧链取代体的大小、形状及种类的分析，可知精氨酸、赖氨酸和组氨酸全部为带有阳电荷 的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的大小类似；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸的形状类似。因 此，基于这种考虑事项，可将精氨酸、赖氨酸和组氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸、苯丙氨酸、 色氨酸和酪氨酸视为生物学功能等同物。
[0058] 在导入变异的过程中，可考虑氨基酸的疏水性指数（hydropathic index)。各氨 基酸根据疏水性和电荷赋予疏水性指数：异亮氨酸（+4. 5)、缬氨酸（+4. 2)、亮氨酸（+3. 8)、 苯丙氨酸（+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸（+2. 5)、蛋氨酸（+1.9)、丙氨酸（+1.8)、甘氨酸 (_〇. 4)、苏氨酸（-0. 7);丝氨酸（-0. 8)、色氨酸（-0. 9)、酪氨酸（-1. 3)、脯氨酸（-1. 6)、组 氨酸（-3. 2)、谷氨酸（-3. 5)、谷氨酰胺（-3. 5)、天冬氨酸（-3. 5)、天冬酰胺（-3. 5)、赖氨酸 (-3. 9)及精氨酸（-4. 5)。
[0059] 在赋予蛋白质的相互的生物学功能（interactive biological function)的过程 中，疏水性氨基酸指数非常重要。只有利用具有类似的疏水性指数的氨基酸取代，才能保持 类似的生物学活性，这是公知的事实。在参照疏水性指数导入变异的情况下，在呈现优选为 〒2以内，更优选为〒1以内，尤其优选为〒0. 5以内的疏水性指数差异的氨基酸之间进行 取代。
[0060] 另一方面，众所周知，具有类似的亲水性值（hydrophilicity value)的氨基酸 之间的取代引起具有等同的生物学活性的蛋白质。如美国专利第4554101号所公开，将 以下亲水性值赋予各氨基酸残基：精氨酸（+3. 0)、赖氨酸（+3. 0)、天冬氨酸（+3. 0〒1)、 谷氨酸（+3. 0〒1)、丝氨酸（+0. 3)、天冬酰胺（+0. 2)、谷氨酰胺（+0. 2)、甘氨酸（0)、苏氨 酸（-0.4)、脯氨酸（-0.5〒1)、丙氨酸（-0.5)、组氨酸（-0.5)、半胱氨酸（-1.0)、蛋氨酸 (-1. 3)、缬氨酸（-1. 5)、亮氨酸（-1. 8)、异亮氨酸（-1. 8)、酪氨酸（-2. 3)、苯丙氨酸（-2. 5) 及色氨酸（-3. 4)。
[0061] 使分子的活性在整体上不会发生变更的蛋白质中的氨基酸交换已公知于该领域 中（!1.他11四1:11，1?.1^!1;[11，1116?1'0七6；[118，六0&(16111；^?代88，他￥￥0^，1979)。最普遍发生的 交换为氛基酸残基 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/ Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 及 Asp/Gly 之间的交换。
[0062] 若考虑如上所述的具有生物学等同活性的变异，则本发明的抗体或对这些进行 编码的核酸分子被解释为包含记载于序列表的序列和呈现实质上的等同性（substantial identity)的序列。上述的实质上的等同性进行比对，使得如上所述的本发明的序列尽 可能与任意的其他序列相对应，在利用该领域中通常所使用的算法来分析比对的序列 的情况下，是指呈现最小61 %的同源性，更优选为70 %的同源性，尤其优选为80 %的同 源性，最优选为90%的同源性的序列。用于比较序列的比对方法公知在该领域中。对 于比对的多种方法及算法公开在 Smith and Waterman，Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and ffunsch, J. Mol. Bio. 48:443 (1970) ；Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24 :307-31(1988) ；Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988) ；Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989) ；Corpet et al. , Nuc.Acids Res. 16:10881-90 (1988)； Huang et al. , Comp. AppI. BioSci.8:155-65 (1992)及 Pearson et al. , Meth.Mol. Biol.24:307-31(1994). NCBI BasicLocal Alignment Search Tool (BLAST)(Altschul et al.，J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))可在 NBCI 等中访问，可在互联网上以与 blastp、 blastn、blastx、tblastn及tblastx之类的序列分析程序联动的方式利用。BLSAT可在www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/中访问。利用该程序的序列同源性比较方法可在www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/blast_help. html 中石角认。
[0063] 根据本发明，本发明的抗体变异体或抗体片段可以为与功能性分子相结合的免疫 接合体。HER2为在癌细胞的表面表达的分子，因而本发明的免疫接合体，即抗体变异体-功 能性分子可利用于过度表达HER2的癌的预防、治疗及诊断。上述功能性分子包含化学物 质、放射性核素、免疫治疗剂、细胞因子、趋化因子、毒素、生物作用剂及酶抑制物质等。
[0064]用于与本发明的抗体变异体或其片段耦合的优选的功能性分子为化学物质、细 胞因子或趋化因子，更优选为化学物质。上述化学物质为抗癌剂，例如，阿雪维菌素、阿柔 比星、阿考达唑、山油柑碱、阿多来新、阿拉诺新、阿地白介素、别嘌醇钠、六甲蜜胺、氨鲁米 特、氨萘非特、聚肌胞、安吖啶、雄激素、蛇形菌素、阿非迪霉素甘氨酸、亮氨酸溶肉瘤素、天 冬酰胺酶、5-阿扎胞苷、硫唑嘌呤、卡介苗（BCG)、贝克叶酸拮抗剂、β -2-硫代鸟嘌呤脱氧 核式、盐酸比生群、硫酸博莱霉素、白消安、丁硫氨酸亚砜胺、BWA773U82、BW 502U83/HC1、 BW 7U85甲磺酸、脑酰胺酶（ceracemide)、卡贝替姆、卡钼、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、氯喹喔 啉磺酰胺、氯脲霉素、色霉素 A3、顺钼、克拉屈滨、皮质类固醇、短小棒状杆菌、CPT-11、克立 那托、环胞苷、环磷酰胺、阿糖胞苷、色他巴、道比什马来酸酯、达卡巴嗪、更生霉素、盐酸柔 红霉素、地西他滨、右丙亚胺、卫康醇、地吖醌、二溴卫矛醇、膜海鞘素 B、二乙基二硫代氨基 甲酸酯、肌苷二醛、二氢-5-氮杂胞苷、阿霉素、棘霉素、依达曲沙、依地福新、依氟鸟氨酸、 埃利奥特氏溶液、依沙芦星、表柔比星、依索比星、磷酸雌二醇氮芥、雌激素、依他硝唑、氨磷 汀、依托泊苷、法倔唑、法扎拉滨、芬维A胺、非格司亭、非那雄胺、黄酮醋酸、氟尿苷、磷酸氟 达拉滨、5-氟尿嘧啶滨、全氟碳》$111 〇8〇1?)、氟他胺、硝酸镓、吉西他滨、醋酸戈舍瑞林、 七磺酰胺（hepsulfam)、六亚甲基二乙酰胺、高三尖杉酯碱、硫酸肼、4-羟雄留烯二酮、羟基 脲、盐酸伊达比星、异环磷酰胺、干扰素 α、干扰素 β、干扰素 Y、白细胞介素-La和β、白 细胞介素-3、白细胞介素_4、白细胞介素_6、4_甘薯苦醇、异丙钼、异维甲酸、亚叶酸钙、醋 酸亮丙瑞林、左旋咪唑、柔红霉素脂质体、脂质体荚膜的阿霉素、洛莫司汀、氯尼达明、美登 素、盐酸氮芥、美法仑、美诺立尔、美巴龙、6-巯基嘌呤、美司钠、卡介苗的甲醇提取残渣、氨 甲喋呤、N-甲基甲酰胺、米非司酮、米托胍腙、丝裂霉素-C、米托坦、盐酸米托蒽醌、单核细 胞/巨噬细胞菌落-刺激因子、大麻隆、萘福昔定、新制癌菌素、醋酸奥曲肽、奥马钼、奥沙 利钼、紫杉醇、铲形跗、喷司他丁、哌嗪双酮、哌泊溴烷、吡柔比星、吡曲克辛、盐酸吡罗蒽醌、 ΡΙΧΥ-321、普卡霉素、吓吩姆钠、泼尼莫司汀、甲基苄肼、孕酮、吡唑呋喃菌素、雷佐生、沙格 司亭、司莫司汀、锗螺胺、螺莫司汀、链黑菌素、链佐星、磺氯苯脲、苏拉明钠、他莫昔芬、替加 氟、替尼泊苷、对苯二甲酸脒（terephthalamidine)、替罗昔隆、硫鸟噪呤、噻替派、胸腺啼陡 核苷注射液、噻唑呋林、拓扑替康、托瑞米芬、维甲酸、盐酸三氟拉嗪、曲氟尿苷、三甲曲沙、 肿瘤坏死因子、乌拉莫司汀、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、长春利定、吉 雄864(Yoshi864)、佐柔比星、阿糖胞苷、依托泊苷、美法仑、泰索帝、紫杉醇及它们的混合 物，但并不局限于此。
[0065] 【II·核酸分子及重组载体】
[0066] 根据本发明的再一实施方式，本发明提供对本发明的抗体变异体或其抗原结合片 段的重链可变域进行编码的核酸分子。
[0067] 根据本发明的另一实施方式，本发明提供对本发明的抗体变异体或其抗原结合片 段的轻链可变域进行编码的核酸分子。
[0068] 在本说明书中所说明的术语"核酸分子"具有包含DNA(gDNA及cDNA)及RNA分 子的含义，在核酸分子中，作为基本组成单位的核苷酸不仅包含天然的核苷酸，还包含糖或 喊基部位发生变形的类似物（analogue) (Scheit，Nucleotide Analogs，John Wiley，New York(1980) ;Uhlman 及 Peyman，Chemical Reviews，90:543-584 (1990))。本发明的对重链 及轻链可变域进行编码的核酸分子的序列可发生变形。上述变形包括核苷酸的添加、缺失 或非保守取代或保守取代。
[0069] 根据本发明的一实例，对上述重链可变域进行编码的核酸分子为对由SEQ ID NO : 3、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6的氨基酸序列组成的重链可变域进行编码的核酸分子，对 上述轻链可变域进行编码的核酸分子为对由SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :7 的氨基酸序列组成的轻链可变域进行编码的核酸分子。
[0070] 根据本发明的一实例，本发明的核酸分子可以为包含于对整个重链区域进行编码 的核酸分子或对整个轻链区域进行编码的核酸分子内的形态。
[0071] 本发明的核酸分子解释为还包含对如上所述的核苷酸序列呈现出实质上的等同 性的核苷酸序列。上述的实质上的等同性以使上述的本发明的核苷酸序列尽可能与任意其 他序列相对应的方式进行比对，利用该领域中通常所使用的算法来分析所比对的序列的情 况下，是指呈现出最小80%的同源性，更优选为最小90%的同源性，最优选为最小95%的 同源性的核苷酸序列。
[0072] 根据本发明的还有一实施方式，本发明提供重组载体，上述重组载体包含（a)对 本发明的重链可变域进行编码的核酸分子以及（b)对本发明的轻链可变域进行编码的核 酸分子。
[0073] 在本说明书中所说明的术语"载体"作为在宿主细胞中用于表达靶基因的方式，包 含质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体及腺相关病毒载体之类 的病毒载体等，优选为质粒载体。
[0074] 根据本发明的优选实例，在本发明的载体中，对轻链可变域进行编码的核酸分子 及对重链可变域进行编码的核酸分子与启动子有效地结合（operatively linked)。
[0075] 在本说明书中所说明的术语"有效地结合"是指核酸表达调节序列（例如，启动 子、信号序列或转录调节因子结合位置的阵列）和其他核酸序列之间的功能性结合，由此， 上述调节序列调节其他上述核酸序列的转录和/或翻译。
[0076] 根据本发明的优选实例，本发明的重组载体包含（a)对选自主要由SEQ ID NO :3、 SEQ ID NO :4及SEQ ID NO :6组成的组中的重链可变域进行编码的核酸分子以及（b)对选 自主要由SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :5及SEQ ID NO :7组成的组中的轻链可变域进行编码 的核酸分子。
[0077] 根据本发明的更优选实例，本发明的重组载体包含以下核酸分子：
[0078] (i)对SEQ ID NO :3的重链可变域进行编码的核酸分子以及对SEQ ID NO :2的轻 链可变域进行编码的核酸分子；
[0079] (ii)对SEQ ID NO :4的重链可变域进行编码的核酸分子以及对SEQ ID NO :2的 轻链可变域进行编码的核酸分子；
[0080] (iii)对SEQ ID NO :3的重链可变域进行编码的核酸分子以及对SEQ ID NO :5的 轻链可变域进行编码的核酸分子；或
[0081] (iv)对SEQ ID NO :6的重链可变域进行编码的核酸分子以及对SEQ ID NO :7的 轻链可变域进行编码的核酸分子。
[0082] 本发明的重组载体系统可通过该领域中公知的多种方法构建，与其相关的具体 方法公开于 Sambrook et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)，该文献作为参照插入于本说明书中。
[0083] 典型地，本发明的载体可由用于克隆的载体或用于表达的载体构建。并且，本发 明的载体可将原核细胞或真核细胞作为宿主来构建。例如，在本发明的载体为表达载体， 且将原核细胞作为宿主的情况下，通常包含可使转录进行的强力的启动子（例如，tac启动 子、Iac启动子、lacUV5启动子、Ipp启动子、pLX启动子、pRX启动子、rac5启动子、amp 启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子及T7启动子等）、用于开始翻译的核糖体结 合位置及转录/翻译结束序列。在利用E. coli(例如，HB101、BL21、DH5a等）作为宿主 细胞的情况下，可以利用E. coli色氨酸生物合成途径的启动子及操纵子部位（Yanofsky， C.，J. Bacteriol.，（1984) 158:1018-1024)和噬菌体 λ 的向左启动子（pL λ 启动子、 Herskowitz，I. and Hagen，D. , Ann. Rev. Genet. , (1980) 14:399-445)作为调节部位。在利 用芽孢杆菌作为宿主细胞的情况下，可以利用能够在苏云金杆菌的毒素蛋白基因的启动子 (Appl. Environ. Microbiol. (1998)64:3932-3938 ；Mol.Gen.Genet. (1996)250:734-741) 或芽孢杆菌中表达的任何启动子作为调节部位。
[0084] 另一方面，本发明的重组载体能够以操作该领域中常使用的质粒（例如，pCL、 pSClOl、pGVl 106、pACYC177、ColEl、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、 pIJ61、pLAFRl、pHV14、pGEX 系列、pET 系列及 pUC19 等）、噬菌体（例如，λ gt4. λ B、 λ -Charon、λ Λ ζ?及Μ13等）或病毒（例如，SV40等）的方式制成。
[0085] 根据本发明的优选实例，本发明的重组载体能够以操作pCL表达载体，优选地，操 作PCLS05 (韩国申请号第10-2011-0056685号）表达载体的方式制成。
[0086] 另一方面，本发明的载体为表达载体，且在将真核细胞作为宿主的情况下，可利用 来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子（例如：金属硫蛋白启动子、肌动蛋白启动子、 人血红蛋白启动子及人肌酸启动子）或来源于哺乳动物病毒的启动子（例如：腺病毒后期 启动子、牛痘病毒7. 5Κ启动子、SV40启动子、巨细胞病毒（CMV)启动子、HSV的tk启动子、 小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV)启动子、HIV的LTR启动子、莫洛尼病毒的启动子、EB病毒（EBV) 的启动子及劳斯肉瘤病毒（RSV)的启动子），且通常具有多聚腺苷酸化序列作为转录结束 序列。在一实例中，本发明的重组载体包含CMV启动子。
[0087] 本发明的重组载体为了使从其表达的抗体的纯化变得容易，也可与其他序列相融 合。融合的序列例如有谷胱甘肽-S-转移酶（美国法玛西亚公司（Pharmacia, USA))、麦芽 糖结合蛋白（美国NEB公司（NEB，USA))、FLAG(美国IBI公司（IBI，USA))及6x His(六 聚组氨酸（hexahistidine);美国Quiagen公司（Quiagen，USA))等。并且，由于借助本发 明的载体所表达的蛋白质为抗体，因而即使没有用于纯化的追加的序列，所表达的抗体也 可通过蛋白A柱等容易纯化。
[0088] 另一方面，本发明的重组载体包含该领域中通常所利用的抗生素抗性基因作为选 择标记，例如，具有对于氨苄西林、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传 霉素、新霉素及四环素的抗性基因。
[0089] 表达本发明的抗体变异体的载体可使用使轻链和重链在一个载体一同表达的载 体系统或使轻链和重链分别在单独的载体中表达的系统。在后者的情况下，两个载体通过 共转化（co-transfomation)及祀转化（targeted transformation)向宿主细胞导入。共转 化为向宿主细胞一同导入对轻链及重链进行编码的各载体DNA之后，筛选对轻链和重链都 进行表达的细胞的方法。靶转化为对转化为包含轻链（或重链）的载体的细胞进行筛选， 并再次将表达轻链的所筛选的细胞转化为包含重链（或轻链）的载体，从而最终筛选对轻 链及重链都进行表达的细胞的方法。在以下实施例中，利用在一个载体中一同表达轻链和 重链的载体系统，来制备了抗体。
[0090]【III·转化体】
[0091] 根据本发明的又一实施方式，本发明提供转化为本发明的重组载体的宿主细胞。
[0092] 能够稳定且连续地克隆及表达本发明的载体的宿主细胞公知于该领域中，从而 可利用任何宿主细胞，例如，包含大肠杆菌（Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌及苏云金 杆菌之类的芽孢杆菌属菌株、链霉菌（Streptomyces)、假单胞菌（Pseudomonas)(例如，恶 臭假单胞菌（Pseudomonas putida))、奇异变形杆菌（Proteus mirabiIis)或葡萄球菌 (Staphylococcus)(例如，肉葡萄球菌（Staphylocus carnosus))之类的原核宿主细胞，但 并不局限于此。
[0093] 上述载体的适合的真核细胞宿主细胞可利用曲霉菌（Aspergillus species)之类 的真菌、毕赤酵母（Pichia pastoris)、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母 (Schizosaccharomyces)及粗糙脉孢菌（Neurospora crassa)之类的酵母、其余低等真核 细胞、来源于昆虫的细胞之类的高等真核生物的细胞和来源于植物或哺乳动物的细胞。优 选地，宿主细胞可以为猴肾细胞7 (C0S7:monkey kidney cells)、NSO细胞、SP2/0、中国仓 鼠卵巢（CH0 :Chinese hamster ovary)细胞、W138、幼仓鼠肾（BHK :baby hamster kidney) 细胞、MDCK、骨髓瘤细胞系、HuT 78细胞或293细胞，更优选为中国仓鼠卵巢细胞。
[0094] 在利用E. coli等微生物的情况下，生产率与动物细胞等相比相对高，但由于糖基 化（glycosylation)问题而在完整（intact)的Ig形态的抗体生产中并不优选,但可使用 于Fab及Fv等的生产。
[0095] 在本说明书中，作为宿主细胞的"转化"和/或"转染"包括向有机体、细胞、组织 或器官导入核算的任何方法，能够选择如该领域中所公知的适合不同宿主细胞的标准技术 来执行。作为这种方法，包括电穿孔（electroporation)、原生质体融合、磷酸|丐（CaPO 4)沉 淀、氯化钙（CaCl2)沉淀、利用碳化硅纤维的搅拌、农杆菌介导的转化、PEG、硫酸葡聚糖、月旨 质体及干燥/抑制介导的转化方法等，但并不局限于此。
[0096] 【IV·抗_ErbB2抗体变异体或其抗原结合片段的制备方法】
[0097] 根据本发明的又一实施方式，本发明提供抗_ErbB2抗体变异体或其抗原结合片 段的制备方法，上述抗_ErbB2抗体变异体或其抗原结合片段的制备方法包括：步骤（a)，培 养转化为本发明的重组载体的宿主细胞，以及步骤（b)，在上述宿主细胞中表达抗-ErbB2 抗体变异体或其抗原结合片段。
[0098] 制备在上述抗体的过程中得到转化的宿主细胞的培养可根据该领域中公知的适 当的培养基和培养条件来实现。有关这种培养过程，只要是本发明所属【技术领域】的普通 技术人员，就能根据所选择的菌株容易地调整并使用。这种多样的培养方法公开于多个 文献（例如，James M. Lee, Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions，138-176)中。细胞培养根据细胞的生长方式区分为悬浮培养和附着培养，并根据 培养方法区分为分批式、补料分批式及连续培养式的方法。使用于培养的培养基需适当地 满足特定的菌株的要求条件。
[0099] 就动物细胞培养而言，上述培养基包含多种碳源、氮源及微量元素成分。可使用的 碳源的例包含葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉及纤维素之类的碳水化合物、大豆油、 葵花籽油、蓖麻油及椰子油之类的脂肪、棕榈酸、硬脂酸及亚油酸之类的脂肪酸、甘油及乙 醇之类的酒精和乙酸之类的有机酸。这些碳源可单独或组合使用。可使用的氮源的例包含 蛋白胨、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浸渍液（CSL)及大豆小麦之类的有机氮源及尿素、 硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵及硝酸铵之类的无机氮源。这些氮源可单独或组合使用。上 述培养基可包含KH 2P04、K2HPO4及对应的含钠盐作为磷源。并且，可包含硫酸镁或硫酸铁之 类的金属盐。此外，可包含氨基酸、维生素及适当的前体等。
[0100] 在培养的过程中，能够以适当的方式向培养液添加氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸 及硫酸之类的化合物，从而调整培养液的pH。并且，在培养的过程中，可使用聚乙二醇酯 (polyglycol ester)之类的消泡剂，来抑制气泡的生成。并且，为了维持培养液的有氧状 态，向培养液内注入氧或含氧气体（例如，空气）。培养液的温度通常在20°C至45°C范围 内，优选在25°C至40°C范围内。
[0101] 通过培养转化的宿主细胞来获得的抗体能够以未纯化的状态使用，并且还能利用 多种通常的方法，例如透析、盐沉淀及色谱法等，来纯化为高纯度并使用。其中，最常使用利 用色谱法的方法，柱的种类和顺序可根据抗体的特性、培养方法等，选自离子交换色谱法、 尺寸排阻色谱、亲和性色谱法等。
[0102] 【V.癌的预防或治疗用药剂学组合物】
[0103] 根据本发明的又一实施方式，本发明提供癌的预防或治疗用药剂学组合物，上述 癌的预防或治疗用药剂学组合物包含：(a)药剂学有效量的本发明的抗-ErbB2抗体变异体 或其抗原结合片段，以及（b)药剂学上接受的载体。
[0104] 根据本发明的又一实施方式，本发明提供癌的预防或治疗方法，上述癌的预防或 治疗方法包括将治疗学有效量的上述药剂学组合物给个体用药的步骤。
[0105] 在本说明书中所使用的术语"预防"使用为包括完全或部分抑制或延迟疾病的进 行且延迟转换为更严重的疾病的情况的最广的含义，术语"治疗"包括癌细胞的部分或整体 破坏，还包括癌生长的部分或完全的抑制。
[0106] 根据本发明的一实例，上述癌为过度表达HER2的癌。在一特定例中，上述癌选自 主要由乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、肾癌、直肠癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、头颈癌、子宫 内膜癌、涎腺癌、大肠癌及甲状腺癌组成的组中。在其他实例中，上述癌为乳腺癌或胃癌。在 本说明书中所说明的术语"过度表达HER2的癌"为与相同组织类型的非-癌性细胞相比， 在癌细胞的表面具有显著且更高水平的HER2的癌。这种过度表达可根据基因扩增或转录 或翻译的增加而发生。
[0107] 包含于本发明的药剂学组合物的药剂学上接受的载体作为在进行制剂时，通常所 利用的载体，包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、 明胶、娃酸I丐、微晶纤维素、聚乙烯批咯烧酮（polyvinylpyrrolidone)、纤维素、水、糖楽、甲 基纤维素 （methyl cellulose)、轻苯甲醋（methyl hydroxybenzoate)、轻苯丙醋（propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并不局限于此。本发明的药剂学组合 物除了上述成分之外还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂 等。药剂学上接受的适合的载体及制剂已在Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed.，1995)中进行了详细的记载。
[0108] 本发明的药剂学组合物能够以口服或非口服方式进行用药，非口服用药的情况 下，能够以静脉内注入、皮下注入、肌肉注入、腹腔注入、内皮用药、局部用药、脾内用药、肺 内用药及直肠内用药等方式进行用药。当口服用药时，由于蛋白质或肽被消化，因而口服用 组合物需涂敷活性药剂或以从胃的分解中得到保护的方式进行剂型化。并且，药剂学组合 物可借助能够使活性物质向靶细胞移动的任意装置进行用药。
[0109] 本发明的药剂学组合物的适当的用药量可根据制剂化方法、用药方式、患者的年 龄、体重、性别、病态、饮食、用药时间、用药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而不 同，通常，熟练的医生可针对所需的治疗或预防容易地决定或处方有效的用药量。根据本发 明的优选实例，本发明的药剂学组合物的一天的用药量为0. 〇〇l-l〇〇mg/kg (体重）。在本说 明书中，术语"药剂学有效量"是指针对预防或治疗癌充分的量。
[0110] 本发明的药剂学组合物可根据本发明所属【技术领域】的普通技术人员能够容易地 实施的方法，利用药剂学上接受的载体和/或赋形剂，来进行制剂化，从而制备为单位容量 形态，或者装入大容量容器内而制备。此时，剂型也可以为油性或水性介质中的溶液、悬浮 液或乳化液形态，浸膏剂、散剂、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，还可包含分散剂或稳定 剂。
[0111] 本发明的组合物可作为个别治疗剂进行用药，或者以与其他治疗剂并用的方式进 行用药，且能够与现有的治疗剂依次或一同进行用药。
[0112] 抗体变异体能够以抗体变异体-治疗剂（功能性分子）结合体形态向生物体内投 入，从而利用于癌的治疗，而相关说明见上述内容。向特异性靶部位进行药剂的靶向化时适 当且优选的多种条件已在例如文献Trouet et al. ,Plenum Press，New York and London， (1982) 19-30中进行了报告。
[0113] 归纳本发明的特征及优点如下。
[0114] (a)本发明的抗体变异体以高的亲和度与ErbB2相结合。尤其，本发明的抗体变异 体对ErbB2的亲和度与现有的市场上所销售的抗体治疗剂，即4D5相比，改善了最多8倍。
[0115] (b)本发明的抗体变异体呈现优秀的癌细胞增殖抑制活性。尤其，本发明的抗体变 异体的胃癌细胞株增殖抑制活性与4D5相比，优秀约3. 5倍。
[0116] (c)因此，本发明的抗体变异体即使使用少量，也能有效地预防或治疗癌。
[0117] 以下，将通过实施例对本发明进行更为详细的说明。这些实施例仅用于更加具体 地说明本发明，根据本发明的要点，本发明的范围并不局限于这些实施例，而这对于本发明 所属【技术领域】的普通技术人员来说是显而易见的。 【实施例】
[0118] 【实施例1 :具有多种⑶R残基的噬菌体-展示的SCFv文库制作】
[0119] 使用以scFv与pill相结合的形态生成展示的噬菌粒载体，制作了噬菌体-展示 的scFv文库。将上述载体的大致结构图示在了图1中。上述载体包含在IPTG-诱导性Plac 启动子的控制下的抗体的可变域，连接序列为GGGGSGGGSGGSS(SEQ ID N0:8)。成为母源 抗体的抗_ErbB2抗体（4D5)的制备方法及可变域序列公知在美国专利第5821337号及第 6054297 号中。
[0120] 使用scFv展示载体的唯一的"停止模板"版本来生成了文库。在本实施例中，使用 了 TGA终止密码子插入于轻链的卡巴特残基48的模板pCMTG噬菌粒载体（韩国IG治疗公 司（Therapy Co.))。重链⑶R3中未导入终止密码子。在实现多样化的位置，使用具有NNK 密码子的引发突变的寡核苷酸（oligonucleotide)来导入⑶R多样性，并去除了终止密码 子。由此，生成了对与同种二聚物化c-myc及pill相融合的scFv文库成员进行编码的可 读框。
[0121] 使重链⑶R3及轻链⑶R3区优先发生变化。为了使重链⑶R3区发生变化，使用 HF(序列号19)和LN01_R引物（序列号9)、HF(序列号19)和LN02_R引物（序列号10) 来执行了聚合酶链式反应。使用C1000热循环仪（Thermal cycler)(美国伯乐（Bio-Rad) 公司），根据制造商的说明，利用Ex taq (日本塔卡拉（Takara)公司）进行扩增过程如下： 循环实施了 27次的在95°C温度下变性20秒钟，在57°C温度下引物结合30秒钟，并在72°C 温度下延伸45秒钟的扩增过程。并且，为了改变轻链⑶R3区，利用LN03_F(序列号11)和 LR引物（序列号17)、LN04_F(序列号12)和LR引物对，实施聚合酶链式反应如下：循环实 施了 27次的在95 °C温度下变性20秒钟，在57 °C温度下引物结合30秒钟，并在72 °C温度下 延伸45秒钟的扩增过程。
[0122] 为了制作将重链⑶R3和轻链⑶R3变异体中筛选的抗体作为模板，将轻链⑶R2作 为靶，并使用NNK密码子来随机诱导突变的文库，执行了两次聚合酶链式反应过程。聚合酶 链式反应循环实施了 27次的在95°C温度下变性20秒钟，在57°C温度下引物结合30秒钟， 并在72°C温度下延伸45秒钟的扩增过程。使用LF(序列号18)作为正向引物，使用以1:1 的比率混合LN05_R(序列号13)和LN06_R(序列号14)的引物作为反向引物，来获得A片 段，并使用LN0506_F(序列号15)和HR引物（序列号20)来获得了 B片段。将A片段和B 片段作为模板，利用LF (序列号18)和HR引物（序列号20)对执行了聚合酶链式反应。此 夕卜，将在重链⑶R3和两个轻链（⑶RL2、⑶RL3)变异体中筛选的抗体作为模板，使用LF (序 列号18)和LN07_R引物（序列号16)追加制作了文库。
[0123] 为了将从上述文库筛选的重链⑶R3、轻链⑶R3、轻链⑶R2变异抗体作为模板，将 CDR和构架区全部作为靶，来随机诱导突变而执行易错聚合酶链式反应，为了通过执行易错 聚合酶链式反应来制作抗体文库，分两次执行了如下的聚合酶链式反应过程：第一个聚合 酶链式反应使用GeneMorpII随机突变试剂盒（Random mutagenesis kit，美国斯特拉塔根 (Stratagene)公司），来循环执行了 32次的在95°C温度下变性20秒钟，在57°C温度下引 物结合30秒钟，并在72 °C温度下延伸45秒钟的扩增过程，第二个聚合酶链式反应使用Ex taq(日本塔卡拉（Takara)公司），来循环执行了 20次的在95°C温度下变性20秒钟，在 58°C温度下引物结合30秒钟，并在72°C温度下延伸45秒钟的扩增过程；首先，使用LF (序 列号18)和LR(序列号17)，利用包含轻链的片段和HF(序列号19)和HR引物（序列号20) 对，通过聚合酶链式反应分别扩增了包含重链的片段。将轻链和重链两个片段利用LF(序 列号18)和HR引物（序列号20)对实施聚合酶链式反应，从而获得scFv形态的片段并制 作了文库。将用于聚合酶链式反应的引物的序列表示在表1中。
[0124] 【表1】
[0125]

【权利要求】
1. 一种抗_ErbB2抗体变异体或其抗原结合片段，其特征在于， 包含： (a) 轻链可变域，以及 (b) 重链可变域，具有选自主要由以下氨基酸取代组成的组中的2种以上的氨基酸取 代： 在SEQ ID NO: 1的氨基酸序列中，基于卡巴特编号系统的 位置41的Pro被Arg取代， 位置96的Gly被Asn取代， 位置97的Gly被Ala取代， 位置98的Asp被Trp取代， 位置98的Asp被Lys取代， 位置100b的Ala被Ser取代， 位置100c的Met被Phe取代， 位置101的Asp被Ala取代， 位置101的Asp被Val取代， 位置102的Tyr被His取代，及 位置102的Tyr被Leu取代。
2. 根据权利要求1所述的抗_ErbB2抗体变异体或其抗原结合片段，其特征在于，上述 重链可变域包含在SEQ ID NO: 1的氨基酸序列中，基于卡巴特编号系统的 位置98的Asp被Trp取代， 位置100c的Met被Phe取代， 位置101的Asp被Ala取代，及 位置102的Tyr被Leu取代。
3. 根据权利要求1所述的抗_ErbB2抗体变异体或其抗原结合片段，其特征在于，上述 重链可变域包含在SEQ ID NO: 1的氨基酸序列中，基于卡巴特编号系统的 位置96的Gly被Asn取代， 位置97的Gly被Ala取代， 位置98的Asp被Lys取代， 位置100b的Ala被Ser取代， 位置100c的Met被Phe取代， 位置101的Asp被Val取代，及 位置102的Tyr被His取代。
4. 根据权利要求1所述的抗_ErbB2抗体变异体或其抗原结合片段，其特征在于，上述 重链可变域包含在SEQ ID NO: 1的氨基酸序列中，基于卡巴特编号系统的 位置41的Pro被Arg取代， 位置98的Asp被Trp取代， 位置100c的Met被Phe取代， 位置101的Asp被Ala取代，及 位置102的Tyr被Leu取代。
5. 根据权利要求1所述的抗_ErbB2抗体变异体或其抗原结合片段，其特征在于，上述 轻链可变域具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列或选自主要由以下氨基酸取代组成的组中的2 种以上的氨基酸取代： 在SEQ ID NO :2的氨基酸序列中，基于卡巴特编号系统的 位置50的Ser被Thr取代， 位置51的Ala被Thr取代， 位置52的Ser被Thr取代， 位置53的Phe被Trp取代， 位置54的Leu被Pro取代， 位置72的Thr被Ser取代， 位置91的His被Tyr取代， 位置93的Thr被Gin取代， 位置93的Thr被Asn取代， 位置96的Pro被Ala取代， 位置96的Pro被Val取代，及 位置97的Thr被Ser取代。
6. 根据权利要求5所述的抗-ErbB2抗体变异体或其抗原结合片段，其特征在于，上述 轻链可变域包含在SEQ ID NO :2的氨基酸序列中，基于卡巴特编号系统的 位置93的Thr被Gin取代， 位置96的Pro被Ala取代，及 位置97的Thr被Ser取代。
7. 根据权利要求5所述的抗-ErbB2抗体变异体或其抗原结合片段，其特征在于，上述 轻链可变域包含在SEQ ID NO :2的氨基酸序列中，基于卡巴特编号系统的 位置50的Ser被Thr取代， 位置51的Ala被Thr取代， 位置52的Ser被Thr取代， 位置53的Phe被Trp取代， 位置54的Leu被Pro取代， 位置72的Thr被Ser取代， 位置91的His被Tyr取代， 位置93的Thr被Asn取代，及 位置96的Pro被Val取代。
8. 根据权利要求1所述的抗_ErbB2抗体变异体或其抗原结合片段，其特征在于，包含 以下轻链可变域及重链可变域： (i) 由SEQ ID N0:2的氨基酸序列组成的轻链可变域及由SEQ ID N0:3的氨基酸序列 组成的重链可变域； (ii) 由SEQ ID NO :2的氨基酸序列组成的轻链可变域及SEQ ID NO :4的氨基酸序列 组成的重链可变域； (iii) 由SEQ ID N0:5的氨基酸序列组成的轻链可变域及由SEQ ID N0:3的氨基酸序 列组成的重链可变域；以及 (iv)由SEQ ID NO :7的氨基酸序列组成的轻链可变域及由SEQ ID NO :6的氨基酸序 列组成的重链可变域。
9. 根据权利要求1所述的抗_ErbB2抗体变异体或其抗原结合片段，其特征在于，上述 抗体为人源化抗体。
10. -种核酸分子，其特征在于，对权利要求1至9中任一项所述的抗-ErbB2抗体变异 体或其抗原结合片段的重链可变域进行编码。
11. 一种核酸分子，其特征在于，对权利要求1至9中任一项所述的抗-ErbB2抗体变异 体或其抗原结合片段的轻链可变域进行编码。
12. -种癌的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，包含： (a) 药剂学有效量的权利要求1至9中任一项所述的抗-ErbB2抗体变异体或其抗原结 合片段；以及 (b) 药剂学上接受的载体。
13. 根据权利要求12所述的癌的预防或治疗用药剂学组合物，其特征在于，上述癌为 选自主要由乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、肾癌、直肠癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、头颈癌、 子宫内膜癌、涎腺癌、大肠癌及甲状腺癌组成的组中的癌。
14. 一种癌的预防或治疗方法，其特征在于， 包括将药剂学组合物按治疗学有效量给个体用药的步骤； 上述药剂学组合物包含： (a) 权利要求1至9中任一项所述的抗-ErbB2抗体变异体或其抗原结合片段，以及 (b) 药剂学上接受的载体。
【文档编号】C07K16/30GK104271603SQ201380024055
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2013年4月26日 优先权日:2012年5月8日
【发明者】文昇基, 朴昭罗, 安基荣 申请人:株式会社钟根堂