以斑马鱼模型进行药物筛选的方法及筛选所得药物的制作方法

以斑马鱼模型进行药物筛选的方法及筛选所得药物的制作方法
【专利摘要】本发明关于一种以斑马鱼筛选治疗及/或预防近视及锥状角膜疾病的候选药物的平台。本发明主要以光蛋白聚糖、数种SLRP之一为基础，其在原纤维生成或影响斑马鱼眼球尺寸的基因的调控上扮演重要角色，另外，亦于临床近视上扮演重要角色。据此，本发明采用所建立的斑马鱼模型，进一步鉴定影响光蛋白聚糖及胶原蛋白原纤维生成的表现的药物、及/或影响眼球尺寸的调控的药物。该等药物是治疗近视及/或锥状角膜疾病的具潜力的候选药物。
【专利说明】以斑马鱼模型进行药物筛选的方法及筛选所得药物

【技术领域】
[0001] 本发明主张公元2012年5月21日申请的美国临时专利申请案US61/649,611的 优先权。
[0002] 本发明关于一种以斑马鱼作为模型的药物筛选的方法。尤其是，本发明关于一种 鉴定可影响光蛋白聚糖（Lumican)的表现及胶原蛋白原纤维生成（fibrillogenesis)并可 用于治疗由光蛋白聚糖的表现及/或胶原蛋白原纤维生成所调控的疾病的候选化合物的 方法，及据此鉴定出的候选化合物。更进一步而言，该方法鉴定出用以治疗及/或预防近视 及/或锥状角膜（keratoconus)疾病的药物。

【背景技术】
[0003] 近视为全球最常见的眼睛疾患。在西方国家，近视盛行率约为16%?27%，而亚 洲国家则可能更高。举例而言，新加坡华人的近视盛行率为82%。当屈光不正（refractive error)等于或小于-6屈光度（D)时，定义为高度近视；由于其潜在并发症（包含白内障、青 光眼、黄斑部病变、及视网膜剥离）可能导致失明，故又称为"病理性近视"。遗传因子及环 境因子均可能造成近视。已有评估显示，约一半或更多人所罹患的近视为轴性近视，由眼球 延视轴拉长所造成。出生时，人类眼球尺寸约为成人眼球的三分之二，于轴向上相对较短； 因此可推论，年幼孩童应倾向远视。对于孩童时期的眼睛成长，会发生角膜及水晶体的视力 特性的补充性精细调整而增加眼球长度。上述全部过程通常会实际上完美无缺的发生，且 眼睛可成为正视（emmetropic)。然而，当此种精细调整过程失败时，通常会产生拉长的眼 球，结果就是较远的景象会具焦在视网膜平面之前，而造成轴性近视。于临床试验中，只有 抗胆碱药物（anti-cholinergicdrugs,例如阿托品（atropine))可用于控制近视的进程。 然而，长期使用阿托品控制近视的进程会导致副作用，如视线模糊、便秘、出汗减少、入睡困 难、昏眩、困倦、口鼻或皮肤干燥、头痛、食欲不振、丧失味觉、噁心、或神经质。因此，发展能 控制、预防及/或治疗近视的替代药物仍有需求。
[0004] 巩膜薄化，特别是在后极（posteriorpole)处，是人类高度近视发展的重要特征。 于灵长类中，巩膜为纤维状胞外基质（ECM)，由胶原蛋白（主要为第I型胶原蛋白）、弹性 蛋白、蛋白聚糖及其它成分所组成，其排列于由巩膜纤维母细胞所产生的瓣膜中（参考文 献：AlexGentleetal.，TheJournalofBiologicalChemistry，2003，Vol. 278,No. 19， pp. 16587-16594)。巩膜重塑关于众多基因产物（例如胶原蛋白、蛋白聚糖、基质金属蛋白 酶（MMPs)、及金属蛋白酶的组织抑制剂（TMPs))的调控作用，包含较小直径胶原蛋白纤丝 (fibrils)、减少的糖胺聚多糖（GAG)成分、减少的核心蛋白聚糖合成、及增加的MMP-2。亦 已发现，对于包含胶原蛋白1、丽?-2^1'1-丽?、1'頂?-3、及16?-3的某些蛋白质在11^隱阶 段的选择性改变，显示了视网膜衍生的信号调控巩膜基因表现以重塑该巩膜组织，并调控 巩膜潜变率（参考文献：JohnT.SiegwartJrandThomasT.Norton,InvestOphthalmol VisSci. 2002July;43 (7) : 2067-2075)。巩膜重塑涵盖于近视进程中，且该等生化改变确 实为巩膜生物机转性能的改变的前驱者，且最终与近视发生有关。成年人类的巩膜包含 三种主要的蛋白聚糖：聚集蛋白聚糖（aggrecan)、双糖聚糖（biglycan)、及核心蛋白聚糖 (decorin)，建构巩膜的结构性能。该等蛋白聚糖的比例随巩膜条件而改变。核心蛋白聚糖 及双糖聚糖属于小型富含白氨酸的蛋白聚糖（SLRPs)类，其亦包含光蛋白聚糖、DSPG-3(硫 酸皮肤素蛋白多糖-3,PG-L骺蛋白聚糖）、纤调蛋白、PRELP(富含脯氨酸-精氨酸及富含 白氨酸重复的蛋白质）、角膜蛋白、软骨蛋白、及骨诱导因子（osteoglycin)。核心蛋白聚 糖、双糖聚糖、光蛋白聚糖、及纤调蛋白结合至第一型胶原蛋白，并影响矩阵（influence matrix)式装配及组织化。动物实验显示该蛋白多糖合成速率显著地影响眼球生长及近视 发生。于绒猴巩膜中，核心蛋白聚糖的合成速率与玻璃体室伸长率呈负相关。双糖聚糖及 光蛋白聚糖于巩膜中的mRNA表现量，会在实验诱导性近视期间降低，并于复原期间增加。 光蛋白聚糖，为小型富含白氨酸的蛋白聚糖家族的一员，其为角膜基质、大动脉、皮肤、骨骼 肌、肺脏、肾脏、骨骼、软骨及椎间盘等之间质胶原蛋白基质中的主要胞外成分之一。
[0005] 于角膜组织中，光蛋白聚糖包含硫酸角质素链，以一蛋白多糖而存在；而于非角 膜组织中，光蛋白聚糖以低或非硫酸化的糖蛋白（50-57kDa)存在。此种广泛分布的光蛋 白聚糖暗示了其具有复数功能，关于组织型态及维持组织动态平衡。于剔除光蛋白聚糖 的小鼠中可观察到多种临床表现而良好地证实此点，该小鼠展现角膜混浊、皮肤及肌腱脆 弱、伤口延迟愈合、及低繁殖力。确实，已显示光蛋白聚糖在角膜透明性上扮演必要角色， 通过调控胶原蛋白原纤维生成；在伤口愈合上则通过调控上皮细胞移动；及在受伤水晶体 的上皮-间叶组织转变。光蛋白聚糖缺陷的小鼠及Lum(-/-)Fmod(-/-)小鼠显示胶原蛋 白纤维直径改变及高度近视的特征，表示该等蛋白聚糖在巩膜的生物机转特性上扮演重要 角色。另外，高度近视的相关研究鉴定出潜在基因座MYP1Xq28)及MYP3(12q21_23)，座落 于接近或包含数个SLRP基因（包含双糖聚糖（Xq27ter)、核心蛋白聚糖（12q21_22)、光蛋 白聚糖（12q21.3-22)及DSPG3(12q21))。MYP3亦为英国的25%家族性自体显性高度近 视负责。因此，找出与近视发生相关的候选基因MYP3,包含核心蛋白聚糖、光蛋白聚糖、及 DSPG3受到极高关注。近来，于SLRP基因中的14个新颖突变已展现与高度近视相关；例如， c. 893-105G>A于LUM基因中可能具有保护作用、或与一保护性对偶基因具有连锁性失衡。
[0006] 斑马鱼为受欢迎的脊椎动物模型，用以研究生物学及发生学的分子遗传学。在实 验室中，易于管理大量斑马鱼（成鱼为3 - 4cm长）。结合胚胎学及遗传方法学能够将斑马 鱼建构成极为有力的研究工具。透明胚胎能够进行基础脊椎动物发展过程，由原肠胚形成 至器官发生。另外，可清楚并容易地观察其胚胎的眼睛、心跳及血液循环。接触、视觉及行 为反应亦可于解剖显微镜下监视。多种特征，如3-4个月的短世代时间，使斑马鱼特别适用 于遗传研究。大多数先前研究，以化学突变剂ENU产生的多种眼睛突变，报导了缩小的眼睛 尺寸、未组织化的视网膜、独眼畸形、缩减的神经节细胞层、及光受器减少。Lung-KunYeh已 单离出并确认该斑马鱼角膜蛋白及光蛋白聚糖基因，并发现于斑马鱼发展时期剔除光蛋白 聚糖后，眼球尺寸增加，其与儿童近视的临床发现可兼容且有关连性。于儿童近视中，具有 孩童眼球轴性延长的类似发现，其在人类光蛋白聚糖基因启动子处具有SNP的改变。斑马 鱼光蛋白聚糖启动子降低的活性被认为与此种SNP相关。曾提出，身为富含白氨酸的小型 胜肽之一的光蛋白聚糖，于调控原纤维生成及眼睛发育上扮演重要角色，其可能影响眼球 尺寸（参考文献：Lung-KunYehetal.，JournalofBiologicalChemistry, 2010,Vol. 2 85,No. 36,pp. 28141-28155)。该文献亦暗示，通过反义zlum吗啉寡聚核苷酸对于zlum表现 的下游调控，证实眼部伸长所致轴性近视肇因于巩膜中的胶原蛋白纤维排列被破坏，导致 巩膜薄化；以及，于斑马鱼幼鱼体内分析显示，投予蕈碱类受体拮抗剂（例如，阿托品及派 伦西平（pirenz印ine))可有效减缓由吗啉寡聚核苷酸造成的眼部拉长。因此，该文献建议 斑马鱼可用作筛选近视治疗化合物的体内分析模型。
[0007] 然而，仍有需要进一步探讨斑马鱼模型于实际近视药物筛选、以及找出用于控制、 预防及/或治疗近视的有效药物的应用。


【发明内容】

[0008] 本发明提供以具有大眼（bigeye)的斑马鱼鉴定出候选化合物的方法，该候选化 合物可用于影响光蛋白聚糖的表现及/或胶原蛋白原纤维生成，及/或治疗近视及/或锥 状角膜疾病；该方法包括将一待测化合物与该具有大眼的斑马鱼接触，以及，若斑马鱼的大 眼率降低，则可定义该待测化合物为候选化合物。
[0009] 本发明亦提供以光蛋白聚糖基因及/或胶原蛋白原纤维生成相关基因剔除的斑 马鱼鉴定出候选化合物的方法，该候选化合物可用于影响光蛋白聚糖的表现及/或胶原蛋 白原纤维生成，及/或治疗近视及/或锥状角膜疾病；该方法系包括将一待测化合物与光蛋 白聚糖基因及/或胶原蛋白原纤维生成相关基因剔除的斑马鱼接触，测定该斑马鱼的大眼 数量，以及，若斑马鱼的大眼率降低，则可定义该待测化合物为候选化合物。

【专利附图】

【附图说明】
[0010] 本发明包含至少一彩图。
[0011] 图1描述本发明的zLum-基因抑制的鱼于3-7dpf的一系列表型改变。伴随眼睛 发育，zLumKD的鱼逐步形成巩膜拉长。于第5天，可经由显微镜清楚观察到视网膜剥离。
[0012] 图2描述光蛋白聚糖基因抑制对于眼睛尺寸的效果。5a.巩膜宽度的型态测量以 红线表示，而RPE宽度以白线表示。5b.比较光蛋白聚糖吗啉突变体与野生型在RPE宽度/ 巩膜宽度的比例，结果显示，因巩膜扩张的光蛋白聚糖基因抑制导致轴性延长。
[0013] 图3描述zLum-MO基因抑制可诱导角膜基质（CS)、前巩膜（AS)、及后巩膜（PS) 的超微结构改变。（A)于12dpf阶段的野生型斑马鱼的甲苯胺蓝染色。该图指示角膜基质 (CS)、前巩膜（AS)、及后巩膜（PS)。（B)该12dpf龄的野生型WT及zLum-MO-注射型群组， 其角膜基质、前与后巩膜中的胶原蛋白纤维直径的分析。于zLum-MO组中，角膜基质及前 巩膜的胶原蛋白纤维直径为显著增加；而后巩膜的胶原蛋白纤维直径于两组中并无显著区 另IJ。于12dpf阶段，于角膜基质（C-D)、前巩膜组织（E-F)、及后巩膜组织（G-H)与对照组 (C、E、G)及zLum-MO-注射组（D、E、F)间（C-H)胶原蛋白纤维结构的表型比较。（C)TEM显 微照相，显示野生型组中，规则且较小的角膜基质内的胶原蛋白纤维结构。（D)zLum-MO-注 射组的角膜基质，可发现胶原蛋白纤维直径增加且不规则排列。（E)TEM显微照相，显示野 生型组中，前巩膜内的胶原蛋白呈相对规则的纤维结构。（F)zLum-MO-注射组的前巩膜，胶 原蛋白纤丝不规则且纤维直径增加。（G)相邻视网膜的顶部，TEM显微照相显示于野生型 组中，座落于后巩膜的胶原蛋白的纤维结构。（H)相邻视网膜的顶部，TEM显微照相显示于 zLum-M〇-注射组中，后巩膜中不规则的胶原蛋白纤维结构。（C-H)的比例尺为100nm。
[0014] 图4为zLum-MO组的巩膜薄化的超微结构改变。（A)顶部为相邻视网膜；于7dpf 阶段的野生型斑马鱼的后巩膜中，可发现两到三层的巩膜纤维母细胞的细胞，其具有胶原 蛋白纤维形成于层间。（B)，顶部为相邻视网膜；于7dpf阶段的zLum-MO-注射型斑马鱼 的后巩膜中，仅发现仅一至两层的纤维母细胞的细胞。（C)可明显观察到于7dpf阶段的 zLum-MO-注射型斑马鱼的巩膜薄化。于12dpf阶段的zLum-MO-注射型斑马鱼中，该表现型 会更为显著。尤其是，与野生型相较，可观察到zLum-MO-注射型斑马鱼于7及12dpf阶段 的后巩膜的巩膜薄化明显。（A)及（B)中比例尺为1.5um。
[0015] 图5描述受精后2?4日的44个斑马鱼胚胎的zLum表现。以全胚原位杂交法， zLummRNA自3dpf起，系专一'丨生表现于斑马鱼的巩膜中。
[0016] 图6描述西方墨点法及mRNA复原分析。（a)于西方墨点法分析，于光蛋白聚糖吗啉 突变体中的光蛋白聚糖、胶原蛋白lal、TGF-P、及TMP2降低。反之，MMP2表现增加。（b) 以光蛋白聚糖及胶原蛋白lal的mRNA可复原异常大眼。然而，异常大眼亦可由ppih、hsp 47、及rxl的mRNA复原，其分别关于胶原蛋白纤维形成及眼睛发育。
[0017] 图7描述一种斑马鱼药物筛选分析。（A-B)说明并定义斑马鱼中的视网膜色素上 皮层的外缘（RPE(红色））及巩膜直径（D(绿色））。（C)于7dpf阶段的zLum-MO-注射型 斑马鱼的过度轴伸长，于0.5%阿托品（A)及0.25%派伦西平（P)处理后，显著降低；而以 〇.〇1%美索屈明（1)处理后则无明显改变（行1:11\行2以0+0.5%4、行3以0+0.25%卩、 行4通0+0.01%]?、行5通0)。以0.5%阿托品及0.25%派伦西平处理后，于7(^€阶段的 zLum-MO-注射型斑马鱼的巩膜直径显著降低，而以0. 01 %美索屈明处理的zLum-MO-注射 组则无明显改变（行 6 :WT、行 7 :M0+0. 5%A、行 8 :M0+0. 25%P、行 9 :M0+0. 01%M、行 10 : M0)。（D)因zLum蛋白质减少所致的眼部拉长期间，RPE/巩膜的比例（％)明显降低。一 些蕈碱受体拮抗剂（阿托品及派伦西平）可弱化因zLum蛋白质减少所致的该RPE/巩膜 的降低的比例，而美索屈明处理组的RPE/巩膜的降低比例则无明显改变（行1 :WT、行2 : M0+0. 5%A、行 3 :M0+0. 25%P、行 4 :M0+0. 01%M、行 5 :M0)。
[0018] 图8描述（A)于7dpf阶段的野生型斑马鱼的正常表现型、⑶于7dpf阶段的 RS-M0-注射的胚胎的正常表现型、（C)于7dpf阶段的zLum-MO-注射型斑马鱼的明显拉长 的眼球、〇))以0.5%阿托品处理2天后，于7dpf阶段的zLum-MO-注射的幼鱼的眼部拉长 系明显减少、（E)以0. 25%派伦西平处理2天后，于7dpf阶段的zLum-MO-注射的幼鱼的眼 部拉长系明显减少、及（F)以0.01%美索屈明处理后，于7dpf阶段的zLum-MO-注射型斑马 鱼的表现型无明显改变。
[0019] 图9描述阿托品可复原zLum基因抑制吗啉突变体。其可反转光蛋白聚糖、胶原蛋 白lal、TGF-@、MMP2及TIMP2的表现，其于光蛋白聚糖吗啉突变体中表现降低。
[0020] 图10描述以马立马司他（marimastat)、多西环素、卡特普、美诺四环素氯化氢、阿 托品、阿司匹林、异丙酚及N-乙酰半胱氨酸处理的斑马鱼的大眼率。
[0021] 图11描述以四环霉素（第11(a)图）、美诺四环素（图11(b))、多西环素（图 11(c))、马立马司他（图11(d))、及巴马司他（图11(e))处理的斑马鱼的大眼率。

【具体实施方式】
[0022] 本发明描述一种使用斑马鱼的平台，用于筛选治疗及/或预防近视及锥状角膜疾 病的候选药物。本发明发现，光蛋白聚糖（SLRPs的一员）于调控原纤维生成及影响斑马鱼 眼球尺寸的基因上扮演重要角色，另外亦于临床近视上扮演重要角色。因此，本发明使用已 建立的斑马鱼模型进一步鉴定出影响光蛋白聚糖表现及胶原蛋白原纤维生成、及调控眼球 尺寸的药物。该等药物为具有治疗近视及锥状角膜疾病的潜力的候选药物，包括但不限于， 金属蛋白酶（MMP)抑制剂、TGF-0抑制剂、抗胆碱或蕈碱化合物、及COX抑制剂。
[0023] 于本说明书及申请专利范围中，除非另有指示，否则单数形式的冠词"一"、"一种" 及"该"包含其复数型态。例如，术语"一细胞"包含一群细胞，或其混合物。
[0024] 如此处所用，"表现"指一聚核苷酸转录成mRNA的过程，及/或该聚核苷酸转录成 mRNA(亦称为"转录产物"）后接着转译成胜肽、多肽或蛋白质的程序。
[0025] "对照组"为实验中用于比较的一替代主体或样本。
[0026] 术语"待测化合物"及"候选化合物"意指任何化学品、药学品、药物等，其为一候选 药物，用以达成此处所述的用途，例如增加光蛋白聚糖表现及胶原蛋白原纤维生成、及/或 治疗或预防近视及/或锥状角膜疾病。待测化合物包括已知化合物及具有疗效的潜力的化 合物。经由本发明的方法可决定一待测化合物是否具有疗效。
[0027] 术语"大眼（bigeye) "意指眼部的视网膜色素上皮层轴长除以巩膜轴长的值少于 0? 7。
[0028] 术语"治疗"意指延缓疾患发展及/或减轻预期会产生的症状的严重程度。该术 语进一步包含改善已存在的症状或预防症状。
[0029] 术语"治疗有效量"意指一药物或药剂的量，其可以引发一组织系统、动物或人类 的生物性或药学性反应，该反应可被研究者或临床医师察觉，该反应系对至少具统计上显 著性的部分的病患造成有益效果，如改善症状、痊愈、减少疾病负担。
[0030] 术语"对象（subject) "意图包含活的有机体，其对一般所知的条件或疾病、疾病状 态或条件为敏感性，但非限于本说明书所列示。对象的实例包含人类、狗、猫、牛、羊及小鼠。 该术语对象进一步包含转基因体。
[0031] 此处所述的术语"烷基"意指一饱和直链或支链非环状的烃，具有所示的碳原子数 目（如Ci-C^Ci-C^Ci-CpCi-CpCi-C；等）。代表性饱和直链烷基包含-甲基、-乙基、-正 丙基、-正丁基、-正戊基、-正己基、-正庚基、-正辛基、-正壬基及-正癸基；而代表性饱和 支链烧基包含 _异丙基、-第二丁基、-异丁基、-第二丁基、-异戊基、甲基丁基、3-甲基 丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲 基己基、2, 3-二甲基丁基、2, 3-二甲基戊基、2, 4-二甲基戊基、2, 3-二甲基己基、2, 4-二甲 基己基、2, 5-二甲基己基、2, 2-二甲基戊基、2, 2-二甲基己基、3, 3-二甲基戊基、3, 3-二甲 基己基、4, 4-二甲基己基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己 基、2-甲基乙基戊基、2 -甲基乙基戊基、2-甲基乙基戊基、2-甲基乙基己 基、2_甲基-3 _乙基己基、2_甲基-4_乙基己基、2，2~_乙基戊基、3，3-_乙基己基、2，2~_. 乙基己基、3, 3-二乙基己基等。
[0032] 此处所述的术语"烯基"本身或作为其它取代基的部分，意指一不饱和支链、直链、 或环状的烷基，具有至少一个碳-碳双键，由亲代烷的单个碳原子上移除一个氢原子所衍 生。此群依双键型式可为顺式或反式构形。典型烯基包含，但非限于，乙烯基；丙烯基如 1 _丙稀_1_基、1_丙稀_2 -基、2-丙稀基、2-丙稀基、I-环丙稀基、2-环丙 稀_1 _基；丁稀基如1_ 丁稀_1_基、1_ 丁稀_2_基、2_甲基_1_丙稀_1_基、2_ 丁稀_1_基、 2_ 丁稀 _2-基、1，3- 丁二稀基、1，3- 丁二稀基、I-环丁稀-1-基、1-环丁稀 _3-基、 1，3_环丁二烯-1-基等。于较佳实施例中，该烯基为（C2-C6)烯基。
[0033]此处所述的术语"炔基"本身或作为其它取代基的部分，意指一不饱和支链、直链、 或环状的烷基，具有至少一个碳-碳三键，由亲代烷的单个碳原子上移除氢原子所衍生。典 型炔基包含，但非限于，乙炔基；丙炔基如1-丙炔-1-基、2-丙炔-1-基等；丁炔基如1-丁 块-1-基、1-丁块-3-基、3-丁块-1-基等。于一较佳实施例中，该块基为（C2_C6)块基。 [0034]此处所述的术语"芳基"本身或作为其它取代基的部分，意指具有所示的碳原子数 目（即c5-ci5意指5至15个碳原子）的单价芳香烃基，由亲代芳香环系的单个碳原子上移 除氢原子所衍生。典型芳基包含，但非限于，衍生自醋蒽烯、苊、醋菲烯、蒽、奧、苯、二苯并萘 (chrysene)、晕苯、突蒽、莉、稠六苯、己芬、己烯、不对称苯并二讳、对称苯并二讳、二氢讳、 讳、萘、十八烯、八苯（〇(^卩116116)、艾氏剂（0(^16116)、卵苯、戊-2,4-二烯、骈苯、并环戊二 烯、二苯并菲、花、菲那烯、菲、茜、七曜烯、花、批蒽、玉红省（rubicene)、苯并菲、三萘等的基 团，以及其不同的氢异构体。于一较佳实施例中，该芳基为（C5_C15)芳基，且以（C5-C1(l)为更 佳。
[0035] 此处所述的术语"杂芳基"本身或作为其它取代基的部分，意指具有所示数目的环 原子的单价杂芳基（如：5_14元意指5至14个环原子），通过自亲代杂芳环系的单原子移 除一氢原子所衍生。典型的杂芳基包含，但非限于，衍生自吖啶、苯并咪唑、苯并异噁唑、苯 并噁唑、苯并二噁茂、苯并呋喃、苯并呱喃酮、苯并噻二唑、苯并噻唑、苯并三唑、苯并噁嗪、 苯并噁唑、苯并噁唑啉、咔唑、0 -咔啉、色原烷、色原烯、噌啉、呋喃、咪唑、吲唑、吲哚、吲哚 啉、吲嗪、异苯并呋喃、异色原烯、异吲哚、异吲哚啉、异喹啉、异噻唑、异噁唑、萘啶、噁二唑、 噁唑、呸啶、啡啶、菲罗啉、吩嗪、酞嗪、喋啶、嘌呤、呱喃、呱嗪、吡唑、嗒嗪、吡啶、嘧啶、吡咯、 吡咯嗪、喹唑啉、喹啉、喹嗪、喹噁啉、四唑、噻二唑、噻唑、噻吩、三唑、咕吨等的基团，以及其 不同的氢异构体。于一较佳实施例中，该杂芳基为一 5-14兀杂芳基，且以5-10兀杂芳基为 更佳。
[0036] 于此处所用术语"医药上可接受的盐类及前药"意指该等羧酸盐类、酸加成盐类或 碱加成盐类，及本发明的该等化合物的前药，于医学上足够的理由，其为适用于与病患组织 接触，无不适当的毒性、刺激性、过敏反应等，具有合理的有益/风险比例，并对本发明化合 物的预期应用有效。术语"盐类"意指本发明化合物的相对无毒性、无机与有机的酸加成盐 类。可于该化合物最终分离及纯化期间于原位制备该等盐类；或将经纯化的化合物分开反 应，以自由碱型式与一适当的有机或无机酸反应，再将所形成的盐类分离出而得。其可包含 阳离子，以碱金族及碱土族金属为基础者，如钠、锂、钾、钙、镁等；及胺类阳离子，包含但不 限于，铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、乙基胺等（参见例 如BergeS.M.，etal.，"PharmaceuticalSalts, "J.Pharm.Sci.，1977 ;66:1-19,以参考文 献的方式并入本文）。
[0037] -方面，本发明提供以具有大眼的斑马鱼鉴定出候选化合物的方法，该候选化合 物可用于影响光蛋白聚糖的表现及/或胶原蛋白原纤维生成，及/或治疗近视及/或锥状 角膜疾病；该方法包括将一待测化合物与该具有大眼的斑马鱼接触，以及，若斑马鱼的大眼 率降低，则可定义该待测化合物为候选化合物。于一实施例中，若相对于对照组的斑马鱼 (未以该待测化合物处理）的大眼的总数量，该受测斑马鱼的大眼率降低，则可定义该待测 化合物为候选化合物。
[0038] 另一方面，本发明提供以光蛋白聚糖基因及/或胶原蛋白原纤维生成相关基因剔 除的斑马鱼鉴定出候选化合物的方法，该候选化合物可用于影响光蛋白聚糖的表现及/或 胶原蛋白原纤维生成，及/或治疗近视及/或锥状角膜疾病；该方法包括将一待测化合物与 光蛋白聚糖基因及/或胶原蛋白原纤维生成相关基因剔除的斑马鱼接触，测定该斑马鱼的 大眼数量，以及，若斑马鱼的大眼率降低，则可定义该待测化合物为候选化合物。于一实施 例中，若相对于该斑马鱼的眼睛的总数量、或对照组斑马鱼（未以该待测化合物处理）的大 眼的总数量，该受测斑马鱼的大眼率降低，则可定义该待测化合物为候选化合物。
[0039] 于一实施例中，本发明提供一种鉴定候选化合物的方法，该候选化合物影响光蛋 白聚糖的表现及胶原蛋白原纤维生成，及/或眼球尺寸的调控，该方法包括：
[0040] (a)于复数斑马鱼的受精胚胎中，导入该光蛋白聚糖基因及/或胶原蛋白原纤维 生成相关基因的反义mRNA或该反义mRNA的类似物；
[0041] (b)将由步骤（a)所得斑马鱼暴露于一待测化合物下达足够长的时间，接着收集 该斑马鱼；以及
[0042] (c)测定该斑马鱼的大眼数量，以及，若该斑马鱼的大眼率降低，则可定义该待测 化合物为候选化合物。
[0043] 优选地，步骤（a)的反义mRNA为光蛋白聚糖或角膜蛋白反义mRNA。优选佳地，步 骤（b)的该基因抑制（knockdown)的斑马鱼于其视环形成期暴露于该待测化合物下。优选 地，步骤（b)的斑马鱼于其角膜发育阶段被收集。优选地，若相对于该斑马鱼的眼睛总数量 或对照组斑马鱼的大眼总数量，该斑马鱼的大眼率降低，则可将步骤（c)的待测化合物定 义为候选化合物。综上所述，该方法包括下列步骤：
[0044] (a)于复数斑马鱼的受精胚胎中，导入该光蛋白聚糖基因及/或胶原蛋白原纤维 生成相关基因的反义mRNA或该反义mRNA的类似物；
[0045] (b)将由步骤（a)所得斑马鱼暴露于一待测化合物下达足够长的时间，接着收集 该斑马鱼；以及
[0046] (c)测定该斑马鱼的大眼数量，以及，若相对于该斑马鱼的眼睛的总数量、或对照 组斑马鱼（未以该待测化合物处理）的大眼的总数量，该受测斑马鱼的大眼率降低，则可定 义该待测化合物为候选化合物。
[0047] 于另一实施例中，本发明提供一种鉴定治疗及/或预防近视及/或锥状角膜疾病 的候选化合物的方法，包括：
[0048] (a)于复数斑马鱼的受精胚胎中，导入该光蛋白聚糖基因及/或胶原蛋白原纤维 生成相关基因的反义mRNA或该反义mRNA的类似物；
[0049] (b)将由步骤（a)所得斑马鱼暴露于一待测化合物下达足够长的时间，接着收集 该斑马鱼；以及
[0050] (C)测定该斑马鱼的大眼数量，以及，若该受测斑马鱼的大眼率降低，则可定义该 待测化合物为候选化合物。
[0051] 优选地，步骤（a)的反义mRNA为光蛋白聚糖或角膜蛋白的反义mRNA。优选地，步 骤（b)的该基因抑制的斑马鱼于其视环形成期暴露于该待测化合物下。优选地，该步骤（b) 所得斑马鱼于其角膜发育阶段进行收集。优选地，若相对于该斑马鱼的眼睛的总数量、或对 照组斑马鱼的大眼的总数量，该受测斑马鱼的大眼率降低，则可定义步骤（C)的该待测化 合物为候选化合物。如上述，该方法包括下列步骤：
[0052] (a)于复数斑马鱼的受精胚胎中，导入该光蛋白聚糖基因及/或胶原蛋白原纤维 生成相关基因的反义mRNA或该反义mRNA的类似物；
[0053] (b)将由步骤（a)所得斑马鱼暴露于一待测化合物下达足够长的时间，接着收集 该斑马鱼；以及
[0054] (c)测定该斑马鱼的大眼数量，以及，若相对于该斑马鱼的眼睛的总数量、或对照 组斑马鱼（未以该待测化合物处理）的大眼的总数量，该受测斑马鱼的大眼率降低，则可定 义该待测化合物为候选化合物。
[0055] 此处所述的筛选分析提供鉴定可影响光蛋白聚糖的表现、及胶原蛋白原纤维生 成、及调控眼球尺寸、及治疗及/或预防近视及锥状角膜疾病的化合物的方法，利用降低光 蛋白聚糖基因抑制的斑马鱼的拉长的眼球的比例作为可影响光蛋白聚糖的表现、及胶原蛋 白原纤维生成、及治疗及/或预防近视及锥状角膜疾病的化合物的指示。
[0056] 于此处所述分析法鉴定出的化合物，为候选化合物，其可用于（i)影响光蛋白聚 糖的表现、及胶原蛋白原纤维生成、及调控眼球尺寸，及/或（ii)作为先导化合物，以建构 可用于治疗及/或预防近视及锥状角膜疾病的相关化合物。
[0057] 斑马鱼的角膜蛋白及光蛋白聚糖基因
[0058] 光蛋白聚糖为数种SLRP之一，于斑马鱼中调控原纤维生成或影响眼球尺寸的基 因上扮演重要角色，另外，于临床近视上亦扮演重要角色。类似于人类及小鼠的角膜蛋白及 光蛋白聚糖基因，斑马鱼的角膜蛋白及光蛋白聚糖基因具有SLRP的所有结构特征，S卩，一 富含白氨酸重复片段的中心域（domain)，两侧为具有保留性半光氨酸的N端域及C端域。 斑马鱼的角膜蛋白及光蛋白聚糖聚糖基因的尺寸及结构，与哺乳类的角膜蛋白及光蛋白聚 糖聚糖基因相似。有趣的是，斑马鱼的光蛋白聚糖及角膜蛋白基因两者可定位至相同基因 组。另外，相似于哺乳类的角膜蛋白及光蛋白聚糖聚糖基因，该斑马鱼的角膜蛋白及光蛋白 聚糖聚糖基因为少-TATA基因。又，于斑马鱼及哺乳类之间，于角膜表现的角膜蛋白及光蛋 白聚糖聚糖的最显著差异为，于前者主要表现于角膜上皮层，而非基质层（角膜细胞）。其 亦为研究发育生物学的具潜力领域。
[0059] 基因抑制的斑马鱼
[0060] 令人惊讶地，眼球尺寸增加（即，大眼）与斑马鱼发育期间的斑马鱼光蛋白聚糖、 角膜蛋白及/或胶原蛋白原纤维生成相关基因的基因抑制有关，其临床表现近似于孩童近 视的临床发现。于孩童近视的患者中，孩童的眼球轴性拉长系与人类光蛋白聚糖基因启动 子的SNP改变相关。通过反义股或其类似物达成的基因抑制，以降低斑马鱼的光蛋白聚糖、 角膜蛋白及/或胶原蛋白原纤维生成相关基因的表现量，可模拟造成于患者中观察所得此 SNP所致的轴性拉长的分子机制。依据本发明，将光蛋白聚糖的反义mRNA导入斑马鱼的受 精胚胎中，以获得一光蛋白聚糖基因抑制的斑马鱼。于一实施例中，该光蛋白聚糖反义股为 吗啉寡聚核苷酸（morpholino)。优选地，该吗啉寡聚核苷酸具有下列序列：5'-GATCCCAGAG CAAACATGGCTGCAC-3,。
[0061] 将基因抑制的斑马鱼暴露于待测化合物下并收集所得斑马鱼
[0062] 胚胎发育期间的外部发育及视觉清晰度使得早期发育程序的观察分析为可行，且 高产率及世代时间短亦有利于基因分析。斑马鱼成鱼的眼睛为正视，且可传送可见光波长 及紫外线波长，此由成鱼对紫外线波长的反应可证实。斑马鱼眼睛发育类似于其它鱼类及 哺乳类的眼睛发育。于受精后（postfertilization，缩写hpf)约12小时由眼原基开始。 至约24hpf时眼杯发育良好，及至约30hpf时，于腹侧鼻部（ventronasal)视网膜的小区域 中发现神经节细胞。至约50hpf时，该视网膜层成为该视网膜的明显穿越部分。斑马鱼幼鱼 为远视并于72hpf成为正视，此时亦为眼球外肌呈现成鱼化及光动反应明显的相同时期。 [0063] 依据本发明，该基因抑制的斑马鱼于其视环形成阶段时，暴露于一待测化合物下。 通常在受精后约24小时，斑马鱼的视环形成。该基因抑制的斑马鱼可于其视环形成阶段 时，暴露于该待测化合物下。该基因抑制的斑马鱼与该待测化合物接触之后，待测化合物若 为潜在候选化合物，则可开始活化光蛋白聚糖的表现及胶原蛋白原纤维生成，从而降低眼 球拉长现象，并可治疗及/或预防近视及/或锥状角膜疾病。视网膜水晶体约于受精后48 小时发育，而巩膜及角膜约于受精后72小时发育。于巩膜及角膜发育阶段收集该斑马鱼。 [0064] 测定大眼斑马鱼及鉴定候选化合物
[0065] 斑马鱼大眼为近视的指标。如此处所采，"大眼"意指眼球轴长拉长的眼睛，及表示 视网膜色素上皮层轴长除以巩膜轴长的值少于〇. 7。视网膜色素上皮层轴长及巩膜轴长可 由本领域已知任何方式测量，如解剖显微镜。
[0066] 若相对于该斑马鱼的眼睛总数量或对照组斑马鱼（未以该待测化合物处理）的大 眼总数量而言，大眼率降低，则该待测化合物可被定义为影响光蛋白聚糖的表现及/或胶 原蛋白原纤维生成及/或调控眼球尺寸，及/或治疗及/或预防近视及/或锥状角膜疾病。 优选地，若相对于该斑马鱼的眼睛总数量或对照组斑马鱼（未以该待测化合物处理）的大 眼总数量而言，大眼数量的比例低于30 %，则该待测化合物可被定义为候选化合物。优选 地，该比例低于15 %。更优选地，该比例降低至约0 %至约30 %、约0 %至约25 %、约0 %至 约20%、约0%至约15%、约0%至约10%、约1 %至约30%、约1 %至约25%、约1 %至约 20%、约 1% 至约 15%。
[0067] 再一方面，待测化合物的筛选通过鉴定出该待测化合物的群组中可降低斑马鱼大 眼率至低于30%而完成。可降低该大眼率的待测化合物于此处亦称为"候选化合物"。 [0068] 本发明的筛选方法亦可用于鉴定可降低该光蛋白聚糖基因抑制的斑马鱼的大眼 率的化合物，例如：有机或无机小分子（分子量低于l，〇〇〇Da)、寡胜肽、寡核苷酸、或碳水化 合物。如此处所采，一"待测化合物"可为任何化学化合物，例如：大分子（如胜肽、蛋白质复 合物、糖蛋白、或核酸）或小分子（如氨基酸、核苷酸、有机或无机化合物）。待测化合物可 具有每摩尔低于约1〇, 〇〇〇克的化学式量、低于5, 000克每摩尔、低于1，000克每摩尔、或低 于500克每摩尔。该待测化合物可为天然发生（如药草或天然产物）、合成者、或可包含天 然及合成成分两者。待测化合物的实例包含金属蛋白酶抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂、TGF-3 途径活化剂、TGF- 0抑制剂及Cox抑制剂。
[0069] 金属蛋白酶抑制剂应用于影响该光蛋白聚糖的表现及/或胶原蛋白原纤维生成， 及/或治疗近视及/或锥状角膜疾病的方法
[0070] 于一实施例中，本发明提供一种治疗由光蛋白聚糖的表现及/或胶原蛋白原纤维 生成所调控的疾病、及/或治疗近视及/或锥状角膜疾病的方法，包括向患者提供治疗有效 量的MMP抑制剂。
[0071] 金属蛋白酶（MMPs)亦被认为于例如细胞增殖、移动（贴附/分散）、分化、血管 生成、凋亡及宿主防御的细胞行为上扮演主要角色。金属蛋白酶的抑制剂为已知。实例包 含天然生化物质，如金属蛋白酶的组织抑制剂（TMPs)、a2-巨球蛋白、及其类似物或衍生 物。已报导过许多类胜肽较小化合物可抑制金属蛋白酶。含硫基的酰胺或以肽基酰胺为基 础的金属蛋白酶（MMP)抑制剂为已知，如下述参考文献所示，例如W095/12389、W096/11209 及US4, 595, 700。含异羟肟酸盐基的MMP抑制剂亦揭露于许多已公开的专利申请案中， 如TO95/29892、W0 97/24117、W0 97/49679 及EP0 780 386,其揭露碳骨架化合物，以及 WO90/05719、W093/20047、W0 95/09841、及W0 96/06074,其揭露具有肽基骨架或拟肽物骨 架的异羟肟酸盐。另外，亦已报导其它以嘧啶为基础的MMP抑制剂、以羟基吡喃酮为基础 的MMP抑制剂、以磷为基础的MMP抑制剂、及以四环霉素为基础的MMP抑制剂（参考文献： CancerMetastasisRev. , 2006, 25:115-136)〇
[0072] 依据本发明的一实施例，该MMP抑制剂为一拟肽物异羟肟酸盐MMP抑制剂，具有下 式（I)或其医药上可接受的盐类、前药、溶剂化物、立体异构体或镜像异构体：

【权利要求】
1. 一种治疗由光蛋白聚糖的表现及/或胶原蛋白原纤维生成所调控的疾病、及/或治 疗近视及/或锥状角膜疾病的方法，包括向患者提供治疗有效量的MMP抑制剂。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，该MMP抑制剂为一具有下列式（I)的拟肽物 异羟肟酸盐MMP抑制剂，或其医药上可接受的盐类、其前药、其溶剂化物、其立体异构体或 其镜像异构体： 其中，Q为不存在、或
X为Cpici亚烷基、C2_1(l亚烯基或C2_ 1(l亚炔基，未经取代或经一个或多个OH取代，C1,直 链或支链烷基、C2_1(l直链或支链烯基、CVltl烷基C5_ 15芳基、Cpltl烯基C5_15芳基、Cwtl炔基C 5_15 芳基、(Vici烷基巯基c5_15芳基、C1M烷基磺酰基c 5_15芳基、CVltl烷基亚磺酰基c5_15芳基、C 1M 烧氧基或C5_15芳基； Y为C1^亚烷基、C2_1(l亚烯基或C2_ 1(l亚炔基、未经取代或经一个或多个OH取代、C1,直 链或支链烷基、c2_1(l直链或支链烯基、CVltl烷基C5_ 15芳基、C1M烯基C5_15芳基、Cwtl炔基c 5_15 芳基、(Vici烷基巯基c5_15芳基、C1M烷基磺酰基c 5_15芳基、CVltl烷基亚磺酰基c5_15芳基、C 1M 烷氧基、C5_15芳基、C1,烷基C5_ 15芳基、C5_14杂芳基、C1,烷基C5_ 14杂芳基、或C1,烷基巯基 c5_14杂芳基；须满足，当Q不存在时，Y为C5_14杂芳基，其中该杂芳基任选经取代且具有1至 3个独立选自N、0及S的杂原子；以及 R1 为 Η、0Η、(^_1(ι 烧基、C2_1(l 烯基、C2_1(l 块基、C5_15 芳基、Cpltl 烧基 C5_15 芳基、C5_14 杂芳基、 或C1^烷基(：5_14杂芳基。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，当 Q为
时， X 为 -CH2-, -CH (CH2CH2 (CH3) 2)-> 或-CH2CH2-、-CH (CH2CH2 (CH3) 2) CH (CH3)-、-CH (CH2CH2 (CH3) 2) CH (CH2-S-苯基)-CH (CH2CH2 (CH3) 2) CH (OCH3) -、-CH (CH2CH2 (CH3) 2)-、或-CH2CH2-' -CH (CH2CH2 (CH3) 2) CH (CH3) -、-CH (CH2CH2 (CH3) 2) CH2-、-CH (CH2CH2 (CH3) 2) CH (OH)-、或-CH (CH2CH2 (CH3) 2) CH (CH2-S-噻吩基）-; Y 为-CH (CH2-苯基）-、-CH (C (CH3) 3)-或-CH (CH2-吲哚基）-;及
R1为CH3或苯基。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，当Q不存在时，Y为 优选地，当Q 不存在时，Y为
?且R1为（：5_ 15杂芳基；更优选地，当Q不存在时，Y为
且 R1为
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该式（I)选自由下列所成的组：

其医药上可接受的盐类、其前药、 其溶剂化物、其立体异构体、其镜像异构体、或其组合。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，该化合物为CL-82198、马立马司他、或巴马 司他。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，该MMP抑制剂为一种具有下列式（II)的四 环系的MMP抑制剂，或其互变异构体、或其医药上可接受的盐类、前药或溶剂化物：
其中， R1及R6各自独立为H、C1,烷基C5_ 14杂芳基、或ChqNR7R8 ; R2为氢或OH ; R3及R4各自独立为H、OH、NH2、NO、CN、C1^烷基、Cp ltl烯基或CVltl炔基； R5 为氢、卤素、NH2、OH、NO、CN、C1,烷基、NHCVltl 烷基、N((Vici 烷基）2、C5_15 芳基或 C5_14 杂芳基；以及 R7及R8各自独立为HXpltl烷基、CVltl烷基NH 2COOH或以该氮原子而各自接附以共同形 成3至8元杂芳基； 其中，该杂芳基具有1至3个独立选自N、0及S的杂原子。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，R1为H ;R6为H、-CH2_吡咯基、-CH2-NH-CH2-C H 2-CH2-CH2-CH (NH2) -COOH ; R2 为 H 或氧基；R3 为 H 或 OH ;R4 为 H 或 OH ;且 R5 为 NH2、N (CH3) 2 或1?'素。
9. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，该式（II)的化合物选自由下列所成的组：

其互变异构体、医药上可接受的盐类、前药、溶剂化物、立体异构体、镜像异构体、或其 组合。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，该化合物为美诺四环素、四环霉素或多西 环素。
11. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，该MMP抑制剂为一种具有下列式（III)的 二芳基醚异羟肟酸盐或其医药上可接受的盐类、前药、溶剂化物、立体异构体或镜像异构 体：
其中， R1为卤素、〇H、NH2、OCVici烷基（其为未取代或经1-3个齒素取代）、或NH 2 ; Q不存在或〇 ; X 为 0 或 S(O)2 ; Y 为 CH2 或 NH ; Z为C5_14杂芳基，具有1至3个独立选自N、0及S的杂原子、或 且

f R2、R3及R4各自独立为HXwtl烷基. 或未经取代或经取代 的具有1至3个独立选自N、0及S的杂原子的C5_14杂芳基；或R2及R 4以碳原子而各自接 附以共同形成一 5元饱和杂环，其为未经取代或经CN或Cpltl烷基、Cpltl烷基C5_ 15芳基取代。
12. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，当Q不存在时，R1为OC(卤素）3、X为0、

Y为CH2、Z为 且R2、R3及R4各自独立为H、 或R 2及R4以 f \ 碳原子或氮原子而共同形讨
13. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，当Q为0时，R1为卤素或OC (卤素）3、X为 S (O)2、及 Z 为
14. 如权利要求11所述的方法，其特征在于，当Q为0时，R1为卤素或OC (卤 素）3、X为S(0)2、Y为NH ;Z为
且R2、R3及R 4各自独立为H、C1,烷基、
15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，该式（III)的化合物选自由下列所成的 组：

其医药上可接受的盐类、前药、溶剂化物、立体异 构体、镜像异构体、及其组合。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该MMP抑制剂为具有下式的化合物：
或其医药上可接受的盐类、前药、溶剂化 物、立体异构体、或镜像异构体。
17. -种治疗由光蛋白聚糖的表现及/或胶原蛋白原纤维生成所调控的疾病、及/或治 疗近视及/或锥状角膜疾病的方法，包括向患者提供治疗有效量的TGF-β抑制剂。
18. 如权利要求17所述的方法，其特征在于，该TGF-β抑制剂选自由下列所成的组：

其医药上可接受的盐类、前药、溶剂化物、立体异构体、镜像异构体、及其组合。
19. 如权利要求18所述的方法，其特征在于，该TGF-β抑制剂为氯沙坦钾、N-乙酰半 胱氨酸、异丙酚、及卡特普。
20. -种治疗由光蛋白聚糖的表现及/或胶原蛋白原纤维生成所调控的疾病、及/或治 疗近视及/或锥状角膜疾病的方法，包括向患者提供治疗有效量的COX/LOX抑制剂。
21. 如权利要求20所述的方法，其特征在于，该COX/LOX抑制剂选自由下列所成的组：
或其医药上可接受的盐类、前药、溶剂化物、立体异构体或镜像异构体。
22. 如权利要求1，17或20任一項所述的方法，其特征在于，该方法用以治疗近视。
23. 如权利要求1，17或20任一項所述的方法，其特征在于，该MMP抑制剂、该TGF-β 抑制剂或该COX/LOX抑制剂与一医药上可接受的载体组合以形成眼药水、眼药凝胶、眼药 膏或眼药乳剂。
【文档编号】C07C259/04GK104394856SQ201380026631
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2013年5月21日 优先权日:2012年5月21日
【发明者】王一中 申请人:Dcb美国公司, 台湾大学