抗-mif抗体和糖皮质激素的联合治疗的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种抗-MIF抗体，特别是它们联合糖皮质激素用于对糖皮质激素接受性疾病的治疗。
DSMZ25863
20120412
DSMZ25864
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【专利说明】抗-MIF抗体和糖皮质激素的联合治疗
[0001] 本发明涉及一种抗-MIF抗体，特别是它们联合糖皮质激素用于MIF相关疾病的治 疗。
【背景技术】
[0002] 巨噬细胞移动抑制因子（MIF)是一种细胞因子，起初是基于它能够抑制腹膜渗出 液细胞从对结核菌素高度敏感的豚鼠（包含巨噬细胞）中体外随机迀移的能力而被分离的 (Bloom et al. Science 1966, 153, 80-2 ;David et al. PNAS 1966, 56, 72-7)。今天，已经知 道MIF作为先天性和获得性免疫反应的一个关键的上游调控子，上述免疫反应具有广谱活 性。
[0003] 人类 MIF cDNA 在 1989 年得到克隆（Weiser et al.，PNAS 1989, 86, 7522-6)，其 基因定位于22号染色体。人类MIF基因产品为具有114个氨基酸的蛋白质（N端蛋氨酸裂 解后），其表观分子量大约为12. 5kDa。MIF没有与其他蛋白存在显著的序列同源性。该蛋 白结晶成同一亚单位的三聚体。每个单体包含两个反向平行的α螺旋，所述α螺旋包裹 (pack against)四链β片。该单体还有其他两个β链，该β链和相邻亚单位的β片相 互作用以在单体之间形成界面。三个亚单位排布成一个包含亲溶剂通道的管道，该管道可 以沿着分子三重轴向穿过蛋白质中心（Sun et al. PNAS 1996,93,5191-5196)。
[0004] 据报道，低浓度糖皮质激素可以诱导巨细胞分泌MIF (Calandra et al. Nature 1995, 377, 68-71)。然而，MIF也会反方向调节糖皮质激素的作用，并刺激其他细胞因 子的分泌，例如肿瘤坏死因子TNF-α和白介素 IL-1 β (Baugh et al·，Crit Care Med 2002, 30, S27-35) JIF同样表现出例如展示促血管生成、促增殖和抗凋亡的性质，因此能促 进肿瘤细胞的生长（Mitchell, R. A.，Cellular Signalling, 2004. 16 (1) :ρ· 13-19 ;Lue，H. et al.，Oncogene 2007. 26 (35) :ρ· 5046-59)。此外，例如它和淋巴瘤、黑素瘤和结肠癌的生 长也有直接联系（Nishihira et al. J Interferon Cytokine Res. 2000, 20:751-62) 〇
[0005] MIF是多种病理情况的中介物，因此，与多种疾病都有关联，其包括但不限于炎症 性肠病（IBD)、风湿性关节炎（RA)、急性呼吸窘迫综合征（ARDS)、哮喘、血管球性肾炎、IgA 肾病、心肌梗死（MI)、败血症和癌症。
[0006] 多克隆和单克隆抗-MIF抗体已经用于抵抗重组人类MIF (Shimizu et al.，FEBS Lett. 1996 ;381，199-202 ;Kawaguchi et al, Leukoc. Biol. 1986, 39, 223-232，和Weiser et al.，Cell. Immunol. 1985, 90, 16778)。已经表明抗-MIF 抗体具有治疗用途。Calandra et al.，（J. Inflamm. (1995) ;47, 39-51)报道了使用抗-MIF抗体保护动物免于实验上诱发的 革兰氏阴性和革兰氏阳性感染性休克。这表明抗-MIF抗体可作为一种治疗手段来调控感 染性休克和其他炎症疾病状态中的细胞因子产生。
[0007] US 6, 645, 493公开了一种源自杂交瘤细胞的单克隆抗-MIF抗体，其能够中和MIF 的生物学活性。在动物模型中表明这些源自鼠的抗-MIF抗体在治疗内毒素诱发的休克中 具有有益效果。
[0008] US 2003 10235584公开了一种在动物中制备对MIF具有高亲和性的抗体，所述动 物中的MIF基因已经被纯合（homozygously)敲除。
[0009] 糖基化抑制因子（GIF)是一种蛋白质，具体描述见Galat et al. (Eur. J. Biochem, 1994, 224, 417-21)。MIF 和 GIF 被认为是相同的。Watarai et al. (PNAS 2000, 97, 13251-6)描述了一种能够结合到不同的GIF表位的多克隆抗体以识别Ts细胞中 的GIF翻译后修饰的生物化学特性。Watarai et al, supra报道称GIF在体外出现在不同 的构象异构体中。该异构体的一个类型通过化学修饰单个半胱氨酸残基而产生。该化学修 饰导致GIF蛋白内部的构象改变。
[0010] 糖皮质激素，有时也被称为糖皮质类固醇，是一类可以与糖皮质激素受体结合的 甾类激素，其存在于几乎所有的脊椎动物。糖皮质激素是免疫系统反馈机制的一部分，其能 够减小免疫活动，即炎症。在医学方面，它们用于治疗因免疫过度引起的疾病，其代表性疾 病的例子是过敏、哮喘、自身免疫病和败血症。它们也干扰癌细胞中的一些异常机制，所以 也可以用于治疗癌症。在与糖皮质激素激素受体结合之后，活化的糖皮质激素受体复合物 可以通过被称为反式激活的过程上调细胞核内抗炎蛋白的表达，并通过减弱基因诱导作用 (通过即-1〇8、4?1、加11-加11同源二聚体等）抑制细胞溶质中促炎蛋白的表达。理论上，糖 皮质激素被定义为皮质类固醇的亚组。此外，已经知道一类具有糖皮质激素活性（SEGRA、 选择性糖皮质激素受体激动剂）的新型化合物。这些化合物只展现了整个兴奋糖皮质激素 的部分作用，即它们不能引起广谱的反式激活、反式抑制和对基因诱导的间接作用（通过 NF-κ B、API、jun-jun同源二聚体等）。通过对选择性雌激素受体调节剂（SERM' s =它莫 西芬、雷洛昔芬、托瑞米芬）用类推的方法，这些化合物也被称为选择性糖皮质激素调节剂 (SERM，s)。SEGRA' s/SEGRM' s 的例子包括 Mapracorate ( = B0L303242X = ZK245186)、化 合物 A、RU24856、RU24782、RU40066、ZK216348。
[0011] 天然糖皮质激素的一个重要例子是皮质醇（或氢化可的松），其为人体所必须并 且调控或支持不同的重要的心血管、新陈代谢、免疫学和稳态功能。也有若干种合成的糖皮 质激素是可以利用的。
[0012] 糖皮质激素在三个主要领域起作用，即免疫学领域、代谢领域和胎儿发育领域。在 免疫领域，它们上调抗炎蛋白的表达并下调促炎蛋白的表达。
[0013] 代谢效应总结如下所示：
[0014] ?刺激糖质新生，特别是肝脏中的糖质新生。该通路导致经由非己糖底物例如氨基 酸合成葡萄糖，以及经由甘油三酸酯裂解合成甘油，该通路在食肉动物和某些食草动物中 特别重要。增强涉及糖质新生的酶的表达可能是糖皮质激素最有名的代谢功能。
[0015] ?氨基酸从肝外组织的调动：这些氨基酸作为糖质新生的底物。
[0016] ?抑制肌肉和脂肪组织对葡萄糖的吸收：脂肪酸通过脂解作用释放并被用于在例 如肌肉等的组织中生产能量，并且释放的甘油为糖质新生提供另一种底物。
[0017] 在胎儿发育中，糖皮质激素促进肺的成熟和表面活性剂的生成，所述表面活性剂 对于子宫外肺功能是必须的。进一步地，它们对于正常脑发育是关键物质。
[0018] 已经研制多种合成的糖皮质激素用于治疗，有些比皮质醇更有效。它们的药代动 力学（吸收、半衰期、分布容量和清除）和药效不同。
[0019] 糖皮质激素效力、疗效时间和覆盖（overlapping)盐皮质激素效力不同。皮质醇 (氢化可的松）是糖皮质激素效力的标准对照。氢化可的松是皮质醇作为药物制剂的名称。 由于相当一部分含量（一些案例中高至50% )可能不能由肠吸收，口服效力可能比肠胃外 (不经肠道的）效力低。
[0020] 例子为：
[0021] 氢化可的松、醋酸可的松、可的松/考的索、氟可龙（Fluorocortolon)、泼尼松、氢 化泼尼松、甲基氢化泼尼松、氟羟氢化泼尼松、地塞米松、倍他米松、帕拉米松。
[0022] 此外，还有一些化合物：它们仅模仿糖皮质激素的一些作用而不是全部作用；这 些化合物被称为SEGRAs (选择性糖皮质激素受体激动剂）。SEGRA' s/SEGRM' s的例子 包括 Mapracorate ( = B0L303242X = ZK245186)、化合物 A、RU24856、RU24782、RU40066、 ZK216348。
[0023] 主要用于局部施用（例如，喷雾-肺部、栓剂-结肠、乳霜-皮肤）的类固醇：氢化 可的松、倍氯米松、布地奈德、氟替卡松、氟尼缩松、莫美他松、环索奈德、氯倍他索。
[0024] 令人惊异是，在啮齿动物中发现糖皮质激素可以诱导而非抑制巨噬细胞 和 T 细胞 MIF 的产生（Calandra T，Bernhagen J，Metz CN et al·，（1995)MIF as a glucocorticoid-induced modulator of cytokine production. Nature 377:68-71; 和 Bacher Mj Metz CN，Calandra T，et al·，（1996)An essential regulatory role for macrophage migration inhibitory factor in T-cell activation.PNAS 93:7849-7854)。
[0025] 因为已知MIF具有促炎作用，这些结果起初看来是相互矛盾并难以调解的。然而 随后发现MIF甚至撤销了糖皮质激素的抗炎免疫抑制作用。
[0026] 虽然已经表明糖皮质激素对于治疗一些不同疾病和紊乱（如下所示）是有用的而 且成功的，但是取决于用药类型，施用时可能导致一系列的副作用。大多数副作用包括如下 所示：
[0027] ?免疫抑制
[0028] ?糖质新生的提尚导致的尚血糖症；膜岛素耐受性；和受损的匍萄糖耐受性（"类 固醇糖尿病"）
[0029] ?皮肤脆性增加；易挫伤
[0030] ?因肠钙吸收降低导致的钙负平衡
[0031] ?类固醇诱导的骨质疏松症；降低骨密度（骨质疏松症、骨坏死、高骨裂风险、骨裂 愈合放缓）
[0032] ?内脏和躯干脂肪沉积引起的体重增加（内向性肥胖）和食欲刺激
[0033] ?肾上腺功能不全（使用较长时间后突然停止，而不是逐渐减少用量）
[0034] ?肌肉分解（蛋白质水解）、虚弱；肌肉质量和修复功能下降
[0035] ?颧骨脂肪垫扩张和皮肤中的小血管扩张
[0036] ?停止排卵、月经周期不规律
[0037] ?生长障碍、青春期延迟
[0038] ?血浆氨基酸升高、尿素形成增加；氮负平衡
[0039] ?中枢神经系统的兴奋作用（欣快、精神错乱）
[0040] ?颅压升高引起的青光眼
[0041] ?白内障
[0042] 因长久使用、过度使用合成的或内源性糖皮质激素引起的临床问题的组合被称之 为库兴氏综合征（Cushing's syndrome)。
[0043] 除了上面列出的作用，由于外源性糖皮质激素抑制下丘脑的促肾上腺皮质激素释 放激素（CRH)和垂体的促肾上腺皮质激素（ACTH)，高剂量的类固醇用药超过一周后开始抑 制病人肾上腺功能。随着抑制的延长，在停止外源性糖皮质激素给药后，肾上腺萎缩（生理 收缩）需要数月才能完全恢复功能。
[0044] 在恢复期间，该病人在受到压力时例如生病时，容易出现肾上腺功能不全。
[0045] 最后（但并非最不重要），随着时间的延长，接受糖皮质激素的病人也会形成糖皮 质激素耐受。在这些病人中，即使使用高剂量的糖皮质激素也不足以引发足够的抗炎反应 (Barnes PJ, Adcock IM. Glucocorticoid resistance in inflammatory diseases. Lancet 2009May 30 ；373 (9678):1905-1917)〇
[0046] 如果所述糖皮质激素药物的给药剂量增加，上述副作用还会更加严重。降低给药 剂量通常也会降低或减轻副作用。因此，本领域迫切需要提供一种对MIF相关疾病和紊乱 的治疗，该治疗可以减少给定糖皮质激素的给药剂量。
【发明内容】
[0047] 通过本发明已经解决了该目标。
[0048] 特别地，结果显示抗-MIF抗体和给定糖皮质激素联合治疗，可以检测到协同效 应，其使得可以采用较低剂量的糖皮质激素治疗MIF相关疾病，和/或与单独使用糖皮质激 素治疗该疾病相比，相似剂量可以取得更强的效应。
[0049] 特别地，如上所述以及本发明实施例所列举的，抗-oxMIF抗体和给定糖皮质激素 的联合治疗与协同效应是相关的。很多疾病尤其是在炎性疾病或癌症开始之后，就可以检 测到评估的（evaluated) MIF水平，即MIF -般水平。然而，健康个体也存在MIF循环，这使 得难以清楚地区分。相反地，oxMIF不存在于健康个体中。oxMIF在疾病状态下增加，并在 病人样品例如血液、血清和尿液中可以检测的到。
[0050] 在深入研宄MIF和其抗体后发现，抗体RAB9、RAB4和RABO能够和oxMIF特异性结 合（而不能和redMIF结合）。抗体RAM9、RAM4和RAMO也可以观察到这种结合。
[0051] 在发明人的早期试验中，可以看到氧化过程例如胱氨酸介导的氧化、GSSG(〇X.谷 胱甘肽）介导的氧化或MIF与Proclin300或蛋白质交联剂（例如BMOE)温育后可以使得 MIF与上述抗体结合。
[0052] 本发明人取得了下述令人惊异的结论：
[0053] ?重组MIF(人类、小鼠、大鼠、CHO和猴子）的氧化还原调制（胱氨酸/GSSG介导 的轻度氧化）或用Proclin300或蛋白质交联剂处理重组MIF可以导致重组MIF与Baxter 抗-MIF抗体RAB9、RAB4和RABO结合。
[0054] · oxMIF的还原导致抗体（Ab)结合的丧失。
[0055] · oxMIF亚型在体内与生物学Ab的效力相关的特异性。
[0056] · oxMIF水平和疾病状态相关。
[0057] 关于（Ox)MIF的其他知识可以用作本申请发明人进一步研宄的基础。
[0058] 本发明优选的实施例为：
[0059] 1.抗-MIF抗体联合糖皮质激素用于糖皮质激素接受性疾病的治疗。
[0060] 2.如项目1所述的抗-MIF抗体联合糖皮质激素，其中所述糖皮质激素接受性疾病 对采用糖皮质激素的治疗有反应。
[0061] 3.如项目1或2所述的抗-MIF抗体联合糖皮质激素，用于炎症、过敏、癌症或哮喘 的治疗。
[0062] 4.如项目1、2或3所述的抗-MIF抗体联合糖皮质激素，其中所述抗体是抗-oxMIF 抗体。
[0063] 5.如项目1至4任一项中所述的联合，其中，所述抗-MIF抗体选自下组：抗-MIF 抗体 RAB9、RAB4、RABO、RAM9、RAM4 和 / 或 RAMOo
[0064] 6.如项目1至5任一项中所述的联合，其中，所述糖皮质激素选自由糖皮质激素受 体激动剂构成的组，例如甲基氢化泼尼松、氢化泼尼松、氟羟氢化泼尼松、地塞米松、帕拉米 松、氟可龙（Fluorocortolone)、布地奈德、氟替卡松、氟尼缩松、环索奈德、莫美他松、氯倍 他松、可的松和氢化可的松，和抗炎SEGRA' s/SEGRM's (例如，Mapracorate ( = B0L303242X =ZK245186)、化合物 A、RU24856、RU24782、RU40066、ZK 216348)。
[0065] 7.如项目1至6任一项中所述的联合，其中，所述抗-MIF抗体是抗体RAB9、RAB4 或RABO或RAM9、RAM4或RAMO中的任意一种，优选抗体RAM9,所述糖皮质激素选自下组：全 身给药时为（甲基）氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，所述MIF相关疾病是 炎症，尤其是肾炎、更优选狼疮肾炎、肾小球性肾炎、IgA或IgM肾病、系统性血管炎（例如 结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿、Henoch-Sch6nlein紫癜）、抗-GBM肾炎和/或急进性肾小 球肾炎（类型I、II、III或IV)，例如ANCA(抗中性粒细胞胞质抗体）肾炎）。
[0066] 8.如项目1至6任一项中所述的联合，其中，所述抗-MIF抗体是抗体RAB9、RAB4 或RABO，或RAM9、RAM4或RAMO中的任意一种，优选抗体RAM9，所述糖皮质激素选自下组：全 身给药时为（甲基）氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，并且所述MIF相关疾 病是狼疮肾炎。
[0067] 9.如项目1至6任一项中所述的联合，其中，所述抗-MIF抗体是抗体RAB9、RAB4 或RABO、或RAM9、RAM4或RAMO中的任意一种，优选RAM9，所述糖皮质激素选自下组：全身给 药时为（甲基）氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，并且所述MIF相关疾病是 全身性红斑狼疮。
[0068] 10.如项目1至6任一项中所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体是抗体RAB9、 RAB4或RAB0、或RAM9、RAM4或RAMO中的任意一种，优选RAM9,所述糖皮质激素选自下组： 全身给药时为（甲基）氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，并且所述MIF相关 疾病是皮肤炎症。
[0069] 11.如项目1至6任一项中所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体是抗体RAB9、 RAB4或RAB0、或RAM9、RAM4或RAMO中的任意一种，优选RAM9,所述糖皮质激素选自下组： 全身给药时为（甲基）氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，并且所述MIF相关 疾病是T细胞介导的免疫反应。
[0070] 12.如项目10或11所述的联合治疗，其中，所述T细胞介导的免疫反应是皮肤炎 症，例如银肩病或接触性超敏反应。
[0071] 13.如项目10至12任一项所述的联合治疗，其中，所述糖皮质激素是布地奈德，并 且布地奈德配制为局部施用。
[0072] 14.如项目1至5任一项中所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体是抗体RAB9、 RAB4或RABO、或RAM9、RAM4或RAMO中的任意一种，优选RAM9，所述糖皮质激素是布地奈德， 所述MIF相关疾病是炎症性肠病（IBD)，其中所述IBD选自溃疡性结肠炎和克罗恩病。
[0073] 15.如项目1至6任一项中所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体是抗体RAB9、 RAB4或RAB0、或RAM9、RAM4或RAMO中的任意一种，优选RAM9,所述糖皮质激素选自下组： 全身给药时为（甲基）氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，并且所述MIF相关 疾病是多发性硬化。
[0074] 16. -种试剂盒，其包含如上述项目1至15任一项中所述的联合以及使用说明。
[0075] 17.如上述项目1至15任一项中所述的联合，或如项目16所述的试剂盒用于糖皮 质激素接受性疾病的治疗，特别是用于炎症、过敏、哮喘或癌症的治疗。
[0076] 上述抗体通过它们的序列以及保存在大肠杆菌（E. coli) (TG1菌株）中的质粒中 进行表征和支持，所述质粒分别包含上述抗体RABO、RAB4和RAB9,以及RAMO、RAM4和RAM9 的各自轻链或重链中的一种。
[0077] 上述质粒用它们的DSM编号表征，DSM是根据布达佩斯条约在德国的微生物保藏 和细胞培养（DSMZ)(位于德国，布伦瑞克，Mascheroder Weg Ib)保存时得到的官方号码。 这些质粒分别保存在大肠杆菌（E. coli)菌株中。
[0078] 编号为DSM25110的质粒包含抗-MIF抗体RAB4的轻链序列。
[0079] 编号为DSM25112的质粒包含抗-MIF抗体RAB4的重链（IgG4)序列。
[0080] 质粒DSM25110和DSM25112在适宜宿主细胞中的共同表达可引起优选的抗-MIF 抗体RAB4的生成。
[0081] 编号为DSM25111的质粒包含抗-MIF抗体RAB9的轻链序列。
[0082] 编号为DSM25113的质粒包含抗-MIF抗体RAB9的重链（IgG4)序列。
[0083] 质粒DSM25111和DSM25113在适宜宿主细胞中的共同表达可引起优选的抗-MIF 抗体RAB9的生成。
[0084] 编号为DSM25114的质粒包含抗-MIF抗体RABO的轻链序列。
[0085] 编号为DSM25115的质粒包含抗-MIF抗体RABO的重链（IgG4)序列。
[0086] 质粒DSM25114和DSM25115在适宜宿主细胞中的共同表达可引起优选的抗-MIF 抗体RABO的生成。
[0087] 同样地，分别包含RAM0、RAM9和RAM4的轻链和重链序列的其他质粒已经根据布达 佩斯条约于2012年4月12日保存在DSMZ (德国，布伦瑞克）。使用以下命名：
[0088] RAM9 -重链：E. coli GA. 662-01. pRAM9hc - DSM 25860。
[0089] RAM4 -轻链：Ε· coli GA. 906-04. pRAM41c - DSM 25861。
[0090] RAM9 -轻链：E. coli GA. 661-01. pRAM91c - DSM 25859。
[0091] RAM4 -重链：E. coli GA. 657-02. pRAM4hc - DSM 25862。
[0092] RAMO -轻链：E. coli GA. 906-01. pRAMOlc - DSM 25863。
[0093] RAMO -重链：Ε· coli GA. 784-01. pRAMOhc - DSM 25864。
[0094] 术语"预防性"或"治疗性"治疗在本领域是熟知的，其是指对病人进行给药。如 果是在有不希望的状态的临床表现（例如，个体的疾病或其他不希望的状态）之前给药，那 么该治疗就是预防性的，即它保护个体免于形成不希望的状态，而如果是在不希望的状态 表现之后给药，那么该治疗就是治疗性的（即其是为了从中减小、减轻或维持现存的不希 望的状态或其副作用）。
[0095] 此处，抗-(Ox)MIF化合物是指能够减弱、抑制、对抗、抵消或降低（Ox)MIF生物学 活性的任意试剂。抗 -(〇x)MIF的化合物可为能够抑制或中和（ox)MIF活性的试剂，例如抗 体、特别优选此处所述的抗体，更优选抗体RAB9、RAB4和/或RABO或RAM9、RAM4或RAM0。
[0096] 根据本发明，优选的MIF拮抗剂是抗-MIF抗体。更优选的抗-MIF抗体是针对 oxMIF的抗体。在其他实施例中，所述抗-oxMIF抗体，例如上述抗体或结合oxMIF的抗原结 合部分，其Kd小于ΙΟΟηΜ，优选K D小于50nM，更优选K D小于ΙΟηΜ。
[0097] 本发明进一步涉及一种试剂盒，其包含抗-MIF抗体或其抗原结合部分以及本发 明所述的糖皮质激素。除了抗体和糖皮质激素，试剂盒还进一步包含治疗剂及其用途。试 剂盒也可包含在治疗方法中的使用说明。
[0098] 早期结果表明，在动物模型中，抗-MIF抗体只能结合oxMIF而不能结合redMIF，并 能够抑制GCO和/或细胞增殖，从而带来有益效果。
[0099] 发明详述
[0100] 本
【发明内容】
通过所附附图进行进一步描述。
【专利附图】
【附图说明】
[0101] 图1 :实施例Ia中进行的地塞米松的剂量探索治疗示意图。
[0102] 图2 :几个不同剂量的地塞米松给药后第8天的蛋白尿。
[0103] 图3 :几个不同剂量的地塞米松给药后的巨噬细胞浸润。测定每个肾小球横截面 的巨噬细胞（EDI阳性细胞）的数量。显示每只动物的结果以及每组动物的平均值。
[0104] 图4 :几个不同剂量的地塞米松给药后的肾小球新月体。显示测得的每只动物中 肾小球新月体的百分比和每组动物中肾小球新月体比例的平均值。
[0105] 图5 :根据实施例Ib所述的甘氨酸配方中的抗-MIF抗体RAM9的剂量探索示意图。
[0106] 图6 :两种剂量的抗体RAM9给药后第8天的蛋白尿。
[0107] 图7 :两种剂量的抗体RAM9给药后的巨噬细胞浸润。测定每个肾小球横截面的巨 噬细胞（EDI阳性细胞）的数量。显示每只动物的结果以及每组动物的平均值。
[0108] 图8 :两种剂量的抗体RAM9给药后的肾小球新月体的形成。显示测得的每只动物 中肾小球新月体的百分比和每组动物中肾小球新月体比例的平均值。
[0109] 图9 :根据实施例Ic所述的地塞米松联合抗体RAM9的治疗日程示意图。
[0110] 图10 :抗体RAM9 (剂量范围：0-120mg/kg)联合地塞米松（0· 025mg/kg)治疗后蛋 白尿的降低。提供了两组独立实验的平均值。箭头表示使用不同剂量的地塞米松而不使用 抗体时蛋白尿降低的百分比。
[0111] 图11 :抗体RAM9 (剂量范围：0-120mg/kg)联合地塞米松（0· 025mg/kg)治疗后观 察到的巨噬细胞浸润的降低。提供了两组独立实验的平均值。箭头表示使用不同剂量地塞 米松而不使用抗体时巨噬细胞浸润降低的百分比。
[0112] 图12 :抗体RAM9 (剂量范围：0-120mg/kg)联合地塞米松（0· 025mg/kg)治疗后新 月体形成的下降。提供了两组独立实验的平均值。箭头表示使用不同剂量地塞米松而不使 用抗体时新月体形成降低的百分比。
[0113] 图13 :针对DNFB的接触性超敏反应（CHS)。与单独使用RAM9而没有使用氢化可 的松（-HC)治疗小鼠相比，抗-MIF(RAM9)联合氢化可的松（+HC)治疗小鼠的被刺激的耳朵 后CHS反应减弱。使用同型对照抗体治疗小鼠（不施用/局部施用氢化可的松）作为阴性 对照。每组使用八只小鼠，通过测量右耳（被刺激的）和左耳（未被刺激的）的耳朵厚度 的差值而将耳朵接触性皮炎的降低进行量化。
[0114] 定义和基本技术
[0115] 除非此处另有定义，本发明所使用科学和技术术语的含义为本领域普通技术人员 通常所理解的含义。一般而言，与此处所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物 学、基因和蛋白质以及核苷酸化学相关的所用术语和技术是本领域众所周知的且通用的。 除非特别指出，本发明的方法和技术一般按照本领域已知的传统方法和本说明书中所引用 和讨论的各种综述和更特定的文献中所描述的方法进行。见例如，Sambrook等，分子克隆： 实验手册第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约（1989)和Ausubel等，当代分子生物 学操作手册，格林出版联合社（1992)以及Harlow和Lane抗体：实验手册，冷泉港实验室 出版社，冷泉港，纽约（1990)，通过引用其被包括在此处。
[0116] "MIF"或"巨噬细胞移动抑制因子"是指一种蛋白质，已知其在免疫反应和炎症 反应中是一种关键的调节子，并且其是糖皮质激素的抗调控子。MIF包括哺乳动物MIF， 特别是人MIF(Swiss-Prot原始登记号：P14174)，其中单体形式编码为含115个氨基酸的 蛋白质，但由于在起始蛋氨酸处裂解，最终形成含114个氨基酸的蛋白质。"MIF"也包括 "GIF"（糖基化抑制因子）和其他形式的MIF，例如MIF的融合蛋白。MIF的氨基酸编号起 始于N端的蛋氨酸（氨基酸1号），结束于C端的丙氨酸（氨基酸115号）。
[0117] 根据本发明的目的，"氧化的MIF"或oxMIF定义为MIF的异构体，其通过采用温和 氧化剂例如胱氨酸处理MIF得到。如之前本申请所示，用该方式处理的重组oxMIF包括MIF 的异构体，该异构体和oxMIF共享结构的重排，oxMIF(例如）在动物感染细菌之后在体内 产生。
[0118] 根据本发明的目的，redMIF被定义为还原的MIF，其为不和RAB0、RAB9和/或RAB4 结合的MIF。
[0119] 本发明所述的抗-oxMIF抗体能够区分oxMIF和redMIF，所述oxMIF和redMIF分 别通过温和氧化或还原得到。抗-oxMIF抗体对于特异性地检测oxMIF是有用的。这些构 象异构体之间的区别可通过ELISA或表面等离子体共振进行评估。这两种技术的操作对于 本领域技术人员是已知的，并可以采用下述方法进行操作。
[0120] 用Biacore评估抗体的差异结合
[0121] 使用Biacore 3000系统，通过表面等离子体共振分析检测oxMIF和redMIF与抗 体RAB9和RABO的结合动力学。所述抗体涂覆于CM5(=甲基葡聚糖）芯片，并且注射与 0. 2%的Proclin300预先温育的重组MIF蛋白。（Proclin300由稳定oxMIF结构的氧化异 噻挫酮构成）。在不添加 Proclin300的天然HBS-EP缓冲液（=Biacore电泳缓冲液）中， 不能与RAB9、RABO或相关抗体（不相关的同型对照抗体）的重组MIF蛋白用作阴性（背 景）结合对照。
[0122] 在一个优选的实施例中，oxMIF是与抗体RAB9、RAB4和/或RABO或者是其抗原-结 合片段差异性结合的MIF，意味着这些抗体能与oxMIF结合，而redMIF不与这些抗体中的任 何一个结合。
[0123] 在其他实施例中，抗-oxMIF抗体，例如，上述抗体或其结合oxMIF的抗原结合部分 的K d值低于ΙΟΟηΜ，优选K D值低于50nM，更优选K D值低于10nM。在一个特别优选的实施例 中，结合oxMIF的抗体的Kd值低于5nM。
[0124] 抗体例如RAB9、RAB4或RABO能否结合（例如oxMIF或redMIF)可以根据本领域 技术人员已知的方法确定，举例而言可以是下述方法中的任何一个：使用还原态或氧化态 的重组MIF的ELISA，或使用还原态或氧化态的重组MIF的表面等离子体共振，例如上述已 知的Biacore实验。
[0125] 用于确定抗体与例如rec. (ox)MIF结合的一个优选的方法是表面等离子体共振， 其中"结合"意味着Kd值低于ΙΟΟηΜ，优选低于50nM，甚至更优选低于ΙΟηΜ，其中未结合 redMIF表征为Kd值高于400nM。"结合"和"特异性结合"在本文可交换使用，定义如上所 述。"差异性结合"在本申请上下文中是指一种化合物，特别是本文所述的抗体，其能够结合 oxMIF (例如，其Kd值如上所述），而不能结合redMIF (如上所述未结合）。
[0126] "抗体"是指完整的抗体或能够与用于（特异性）结合的完整抗体相竞争的抗原结 合部分。一般参见免疫基础，第7章（Paul, W.，ed.，第2章 .Raven Press，纽约（1989)) (通过引用包含在本文）。术语抗体包括但不限于人类抗体、哺乳动物抗体、分离的抗体和 基因工程形式的抗体例如嵌合体、骆驼化或人源化抗体。
[0127] 术语抗体的"抗原结合部分"是指抗体的一个或一个以上保留特异性结合抗原 (例如（ox)MIF)能力的片段。抗原结合部分可以通过重组DNA技术制备，也可以通过酶或 化学裂解完整抗体而制备。抗原结合部分包括但不限于例如下述：Fab、Fab'、F(ab'）2、Fv 和互补性决定区域（CDR)片段、单链抗体（scFv)、嵌合抗体、抗体和包含至少抗体的一部分 的多肽，其中，所述抗体足以使得特异性抗原结合到多肽，即ox或redMIF。从N端到C端， 成熟轻链和重链的可变区包含FR I、CDRI、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4区域。每个区域中氨 基酸的排列与下述文献的定义保持一致：Kabat，Sequences of Protein of immunological interest《具有免疫性兴趣的蛋白序列》（国家卫生研宄院，贝塞斯达，Md. (1987和 1991)) ；Chothia et al. J. Mol. Biol. 196:901-917(1987),或 Chothia et al.，Nature 342:878-883(1989)。抗体或其抗原结合部分可以衍生或连接到另一个功能分子（例如另 外一种肽或蛋白质）。例如，能够功能性地连接到一个或一个以上其他分子实体的抗体或其 抗原结合部分，例如另一种抗体（例如双特异性抗体或双链抗体（diabody))、可检测试剂、 细胞毒性试剂、药物试剂、和/或连接分子。
[0128] 根据本领域技术人员的通常知识，术语"KD"此处是指特定抗体相对于各自抗原的 平衡解离常数。该平衡解离常数可以测量亲和力。亲和力决定了在平衡态（结合和解离保 持平衡的稳定状态）形成了多少复合物（此处：〇x或redMIF和抗体）。
[0129] ka =结合速度常数[if1 ?Γ1]
[0130] kd =解离速度常数[?Γ1]
[0131] Kd =平衡解离常数=kd/ka[M]
[0132] 术语"人类抗体"是指可变区和恒定区是人类序列的任何抗体。该术语包括带有 源自人类基因但却被改变过的序列的抗体，所述改变例如为降低可能的免疫原性、增加亲 和力、去除可能引起不良折叠的半胱氨酸等。该术语包含了在非人类细胞重组制备的抗体， 其能够如给予人类细胞非典型的糖基化。
[0133] 术语"人源化抗体"是指包含人类序列并包含非人类序列的抗体；特别地，"人源化 抗体"是指非人类抗体，其中添加了人类序列和/或人类序列替换非人类序列。
[0134] 术语"骆驼化抗体"是指一种抗体，其中所述抗体结构或序列已经发生改变，其和 源自骆驼的抗体更加相似，也被命名为骆驼抗体。设计和制备骆驼化抗体的方法是本领域 技术人员所熟知的基本知识的一部分。
[0135] 术语"嵌合抗体"是指包含来自两种或两种以上不同物种的区域的抗体。
[0136] 术语"分离的抗体"或"其分离的抗原结合部分"是指从抗体源例如噬菌体展示库 或B细胞谱中被识别和挑选的一种抗体或其抗原结合部分。
[0137] 根据本发明所述的抗-(Ox)MIF抗体的制备包含采用基因工程生成重组DNA的任 何方法，例如通过反向转录RNA和/或扩增DNA和将其克隆到表达载体。在一些实施例中， 所述载体是病毒载体，其中额外的DNA片段可连接到病毒基因组。在一些实施例中，所述 载体能够在被引入的宿主细胞中自我复制（例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型 (印isomal)哺乳动物载体）。在其他实施例中，所述载体（例如非-游离型哺乳动物载体） 在引入宿主细胞时可以整合到宿主细胞的基因组中，从而可以和宿主基因组一起复制。此 夕卜，特定的载体能够引导与它们可操作地连接的基因的表达。这样的载体此处被称为"重组 表达载体"（或简称为"表达载体"）。
[0138] 抗-(OX)MIF抗体尤其可以通过传统表达载体制备，例如细菌载体（例如pBR322 和它的衍生物）或真核载体。编码抗体的那些序列能与调控复制、表达和/或从宿主细胞 分泌的调控序列一起被提供。这些调控序列包括例如启动子（例如CMV或SV40)和信号序 列。表达载体也包含选择和扩增标志物，例如二氢叶酸还原酶基因（DHFR)、潮霉素-B-磷酸 转移酶和胸苷激酶。所用载体的成分例如选择标记物、复制子、增强子可以通过商购获得或 通过传统方法制备。该载体可以被构建以在不同细胞培养基中表达，例如哺乳动物细胞例 如010、0^、册1(293、呢0、纤维组织母细胞、昆虫细胞、酵母或细菌例如大肠杆菌伍.(3〇11)。 在一些例子中，所用的细胞可以获得表达蛋白的最佳糖基化。
[0139] 所述抗-(ox) MIF抗体的轻链基因和抗-(ox) MIF抗体的重链基因可以插入到不同 的载体或插入到同一个表达载体中。所述抗体基因通过标准方法插入到表达载体中，例如 通过抗体基因片段和载体上的互补限制性位点的连接、或如果没有限制性位点则通过平末 端连接。
[0140] 抗-(Ox)MIF或其抗原结合片段的制备包括本领域已知的通过转染将重组DNA 导入到真核细胞的任何方法，例如通过电穿孔或微注射。例如，可以通过下述方法实现 抗-(ox) MIF抗体的重组表达：将包含编码抗-(ox) MIF抗体的DNA序列的表达质粒通过适 当的转染方法转入适当的宿主细胞株，所述序列受一种或多种调控序列例如强启动子的控 制，从而得到所转入的序列已经稳定整合到基因组的细胞。该脂质转染方法只是根据本发 明可能使用到的方法的一个举例。
[0141] 抗-(ox)MIF抗体的制备也可包含本领域已知的用于培养所述转化细胞的任何方 法，例如连续或分批培养，以及抗-(Ox)MIF抗体的表达，例如组成性或诱导性表达。特别是 进一步参考在WO 2009/086920中提及的抗-(ox)MIF抗体的制备。在一个优选的实施例中， 根据本发明制备的抗-(ox)MIF抗体可以结合oxMIF或其表位。根据本发明，特别优选的抗 体是抗体RAB9、RAB4和/或RAB0。或者优选的抗体是RAM9、RAM4和/或RAM0。
[0142] 这些抗体的序列已在WO 2009/086920中被公开，本申请的其他序列如下所示：
[0143] RAB9轻链的氨基酸序列SEQ ID NO: 1 :
[0144] DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRSSQRIM TYLNWYQQKP GKAPKLLIFV ASHSQSGVPS RFRGSGSETD FTLTISGLQP EDSATYYCQQ SFWTPLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWICV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSK AD YEKH K VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC；
[0145] RAB4轻链的氨基酸序列SEQ ID NO:2 :
[0146] DIQM 丁 QSPG 丁 LSLSPGERAT LSCRASQGVS SSSLAWYQQK PGQAPRIXIY G 丁 SSRATGIP DRFSGSASGT DF 丁 LTISRLQ PEDFAVYYCQ QYGRSLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC；
[0147] RABO轻链的氨基酸序列SEQ ID NO:3 :
[0148] DIQMTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQGVS SSSLAWYQQK PGQAPRLLIY GTSSRATGIP DRFSGSASGT DFTLT1SRLQ PEDFAVYYCQ QYGRSLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWICV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHIC VYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC；
[0149] RAB2轻链的氨基酸序列SEQ ID NO:4 :
[0150] DIQMTQSPVT LSLSPGERAT LSCRASQSVR SSYLAWYQQK PGQTPRLLIY GASN RATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGNSLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSK.ADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC；
[0151] RAB9重链的氨基酸序列SEQ ID NO:5 :
[0152] EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMNffVRQA PGKGLEffVSS IGSSGGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGSQ WLYGMDVffGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PCSRSTSEST AALGCLVKDY FPEPVTVSffN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTKTYT CNVDHKPSNT KVDKRVESKY GPPCPPCPAP EFLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEffE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRffQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK ；
[0153] RAB4重链的氨基酸序列SEQ ID NO:6 :
[0154] EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYAMDffVRQA PGKGLEffVSG IVPSGGFTKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVN VIAVAGTGYY YYGMDVffGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSffNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTKTYTC NVDHKPSNTK VDKRVESKYG PPCPPCPAPE FLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV SVLTVLHQDff LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEffES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRffQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SLGK ；
[0155] RABO重链的氨基酸序列SEQ ID NO:7 :
[0156] EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYAMDffVRQA PGKGLEffVSG IYPSGGRTKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVN VIAVAGTGYY YYGMDVffGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSffNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTKTYTC NVDHKPSNTK VDKRVESKYG PPCPPCPAPE FLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV SVLTVLHQDff LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEffES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRffQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SLGK ；
[0157] RAB2重链的氨基酸序列SEQ ID NO:8 :
[0158] EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYAMDWVRQA PGKGLEWVSG IVPSGGFTKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVN
[0159] VIAVAGTGYY YYGMDVffGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSffNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTKTYTC NVDHKPSNTK VDKRVESKYG PPCPPCPAPE FLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV SVLTVLHQDff LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEffES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRffQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SLGK ；
[0160] RAMOhc 的氨基酸序列 SEQ ID NO:9 :
[0161] EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYAMDWVRQA PGKGLEWVSG IYPSGGRTKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVN VIAVAGTGYY Y YGM DVWGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA
[0162] ALGCLVKDYF PEPVTVSffNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS
[0163] SSLGTQTYIC NVN H KPSNTK VDKRVEPKSC DKTHTCPPCP APELLCiGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK
[0164] GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN
[0165] YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK；
[0166] RAMOlc 的氨基酸序列 SEQ ID NO: 10 :
[0167] D1QMTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQGVS SSSLAVVYQQK PGQAPRLLIY GTSSRATGIP DR FSGS ASGT DFTLTISRLQ PEDFAVYYCQ QYGRSLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAK.VQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC：
[0168] RAM9hc 的氨基酸序列 SEQ ID NO: 11 :
[0169] EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMNWVRQA PGKGLEWVSS IGSSGGTTYY ADSVKGRFTI SRDNiSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGSQ WLYGM DVWGQ GTTVTVSSAS TKGPS VFPL A PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN sgaltsgvht fpavlqssgl yslssvvtvp SSSLGTQTYl CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PA PE L LGG PS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCV V VDVSHE DPEVKFN W YV dgvevhn AKT kpreeqynst YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSN'IvALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKITPPVLD
[0170] SDGSFFLYSK LTVDKSRffQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK ；
[0171] RAM91c 的氨基酸序列 SEQ ID NO: 12 :
[0172] DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRSSQRIM TYLNWYQQKP GKAPKLLIFV ASHSQSGVPS RFRGSGSETD FTLTISGLQP EDSATYYCQQ SFWTPLTFGG
[0173] GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC；
[0174] RAM4hc 的氨基酸序列 SEQ ID NO: 13 :
[0175] EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYAMDWVRQA PGKGLEWVSG IVPSGGFTKY ADSVKGRFT 丨 SRDNSICNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVN VIAVAGTG Y Y YYGM DVWGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKRVEPKSC DKTHTCPPCP APELLGGPSV
[0176] FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
[0177] PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK ；
[0178] RAM41c 的氨基酸序列 SEQ ID N0:14 :
[0179] DIQMTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQGVS SSSLAWYQQK PGQAPRLLIY GTSSR ATGIP DR FSGS ASGT DFTLTISRLQ PEDFAVYYCQ QYGRSLTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC0
[0180] 本发明的抗-MIF抗体优选分离的单克隆抗体。该抗-MIF抗体可以是IgG、IgM、 IgE、IgA或IgD分子。在其他实施例中，该抗-MIF抗体是IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亚类。 在其他实施例中，该抗体是IgGl或IgG4亚类。在其他实施例中，该抗体是IgG4亚类。在 一些实施例中，该IgG4抗体带有一个单独突变，其将丝氨酸（丝氨酸228)改变成脯氨酸。 相应地，IgG4的Fc区域中的子序列CPSC变为CPPC，CPPC是IgGl的子序列（Angal et al .Mol Immunol. 1993, 30, 105-108)〇
[0181] 此外，抗-(ox) MIF抗体的制备可包含本领域已知的用于纯化抗体的任何方法，例 如通过阴离子交换色谱或亲和色谱。在一个实施例中，抗-(ox) MIF抗体可以通过体积排阻 色谱纯化。
[0182] 术语MIF的"中心区域"和"C端区域"分别是指包含人类MIF氨基酸第35-68位 和氨基酸第86-115位的区域，优选分别包含人类MIF氨基酸第50-68位和氨基酸第86-102 位的区域。本发明的特别优选的抗体能够结合人类MIF氨基酸第50-68位或第86-102位 的区域。这同样被能与优选的下述抗体结合的表位所反应，例如RAB0、RAB4、RAB2和RAB9， 以及RAM4、RAMO和RAM9,它们的结合如下所示：
[0183] RAB4 和 RAM4 :aa 86-102
[0184] RAB9 和 RAM9 :aa 50-68
[0185] RABO 和 RAMO :aa 86-102
[0186] RAB2 :aa 86-102
[0187] 因此，RAM4和RAB4,如同RAM9和RAB9具有相同的特异性。RAMO和RABO也是如 此。这同样在实施例中也可以得到反应，在这些实施例体现出使用这些抗体可以得到类似 的结果。
[0188] 术语"表位"包括能够特异性结合免疫球蛋白或抗体片段的任何蛋白决定簇。抗 原决定簇一般由化学性质活跃的表面分子基团例如暴露的氨基酸、氨基糖或其他碳水化合 物侧链构成，一般具有特异的三维结构特点以及特异的电荷特征。
[0189] 术语"载体"是指一种核苷酸分子，其能够将其他的核苷酸运输至与其被连接处。 在一些实施例中，所述载体是质粒，即连接有额外DNA片段的圆形双链DNA环。
[0190] 术语"宿主细胞"是指一种细胞系，其在引入表达载体后可以制备重组蛋白。术语 "重组细胞系"是指已经引入重组表达载体的细胞系。应该理解的是，"重组细胞系"不仅指 特定个体细胞系，也指该细胞系的后代。由于突变或者环境影响，后代可能发生特定修饰， 其后代虽然事实上可能和母细胞不一致，但是仍然属于此处所述的术语"重组细胞系"的范 围之内。
[0191] 根据本发明的宿主细胞类型是例如COS细胞、CHO细胞或例如HEK293细胞或其他 本领域技术人员已知的任何宿主细胞，也包括例如细菌细胞例如大肠杆菌（E. coli)细胞。 在一个实施例中，该抗-MIF抗体在DHFR-缺乏的CHO细胞系例如DXBll中表达，其中添加 G418作为选择标志物。当编码抗体基因的重组表达载体被引入到CHO宿主细胞时，通过培 养宿主细胞至足够的时间使得抗体在宿主细胞表达或者抗体分泌到宿主细胞生长的培养 基中，从而制备抗体。
[0192] 抗-(ox)MIF抗体可以使用标准蛋白纯化方法从培养基中回收。
[0193] 本发明提供的联合治疗的第二个活性成分是糖皮质激素。
[0194] 糖皮质激素，有时也被称为糖皮质类固醇，是一类可以与糖皮质激素受体（糖皮 质激素受体α)结合的留类激素，其几乎存在于所有的脊椎动物。糖皮质激素是免疫系统 反馈机制的一部分，其能够减小免疫活动，即减少炎症。在医学方面，它们用于治疗因免疫 过度引起的疾病，其代表性疾病的例子是过敏、哮喘、自身免疫病和败血症。它们也干扰癌 细胞中的一些异常机制，所以可以用于治疗癌症。在与糖皮质激素激素受体结合之后，活化 的糖皮质激素受体复合物可以通过被称为反式激活的过程上调细胞核内抗炎蛋白的表达， 并抑制细胞溶质中促炎蛋白的表达。理论上，糖皮质激素被定义为皮质类固醇的亚组。此 夕卜，已经知道一类具有糖皮质激素活性（SEGRA，选择性糖皮质激素受体激动剂）的新型化 合物。
[0195] 这些化合物只展现了完全兴奋糖皮质激素的部分作用，即它们不能引起广谱的反 式激活、反式抑制和对基因诱导的间接作用（通过NF- κ B、AP1、jun-jun同源二聚体等）。通 过对选择性雌激素受体调节剂（SERM' s =它莫西芬、雷洛昔芬、托瑞米芬）用类推的方法， 这些化合物也被称为选择性糖皮质激素受体调节剂（SERT s)。SEGR^ s/SEGRT s的例 子包括 Mapracorate ( = B0L303242X = ZK245186)、化合物 A、RU24856、RU24782、RU40066、 ZK216348。
[0196] 所有这些化合物已经在本领域中被公开，其对于本领域技术人员而言是已知的。 特别参考综述文献 De Bosscher et al, 2010, Curr Opin Pharmacol 10:497-504。如文献 VayssiSre et al，1997, Mol Endocrinol 11:1245-1255 公开了 RU 24856、RU 40066 和 RU 24782。它们的化学结构式分别如下所示：
【权利要求】
1. 抗-MIF抗体联合糖皮质激素用于糖皮质激素接受性疾病的治疗。
2. 如权利要求1所述的抗-MIF抗体联合糖皮质激素，其中所述糖皮质激素接受性疾病 对采用糖皮质激素的治疗有反应。
3. 如权利要求1或2所述的抗-MIF抗体联合糖皮质激素，用于炎症、过敏、癌症或哮喘 的治疗。
4. 如权利要求1、2或3所述的抗-MIF抗体联合糖皮质激素，其中所述抗体是抗-oxMIF 抗体。
5. 如权利要求1至4任一项中所述的联合，其中，所述抗-MIF抗体选自于下组：抗-MIF 抗体RAB9、RAB4 和 / 或RAB0、或RAM9、RAM4 或RAM0。
6. 如权利要求1至5任一项中所述的联合，其中，所述糖皮质激素选自于由糖皮质激素 受体激动剂构成的组，例如甲基氢化泼尼松、氢化泼尼松、氟羟氢化泼尼松、地塞米松、帕拉 米松、氟可龙、布地奈德、氟替卡松、氟尼缩松、环索奈德、莫美他松、氯倍他松、可的松和氢 化可的松，和抗炎SEGRA's/SEGRM's(例如，Mapracorate( =B0L303242X=ZK245186)、化 合物A、RU24856、RU24782、RU40066、ZK216348)。
7. 如权利要求1至6任一项中所述的联合，其中，所述抗-MIF抗体选自下组：抗体 RAB9、抗体RABO和抗体RAB0,或RAM9、RAM4或RAM0,优选抗体RAM9,所述糖皮质激素选自 下组：全身给药时为（甲基）氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，所述MIF相 关疾病是炎症，尤其是肾炎、更优选狼疮肾炎、肾小球性肾炎、IgA或IgM肾病、系统性血管 炎（例如结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿、Henoch-SchSnIdn紫癜）、抗-GBM肾炎和/或急 进性肾小球肾炎（类型I、II、III或IV)，例如ANCA(抗中性粒细胞胞质抗体）肾炎）。
8. 如权利要求1至6任一项中所述的联合，其中，所述抗-MIF抗体是抗体RAB9、抗体 RABO和抗体RABO，或RAM9、RAM4或RAMO，优选抗体RAM9，所述糖皮质激素选自下组：全身给 药时为（甲基）氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，所述MIF相关疾病是狼疮 肾炎。
9. 如权利要求1至6任一项中所述的联合，其中，所述抗-MIF抗体选自下组：抗体 RAB9、抗体RABO和抗体RABO、或RAM9、RAM4或RAMO，优选RAM9，所述糖皮质激素选自下组： 全身给药时为（甲基）氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，所述MIF相关疾病 是全身性红斑狼疮。
10. 如权利要求1至6任一项中所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体选自下组：抗 体RAB9、抗体RABO和抗体RAB0、或RAM9、RAM4或RAM0,优选RAM9,所述糖皮质激素选自下 组：全身给药时为（甲基）氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，所述MIF相关 疾病是皮肤炎症。
11. 如权利要求1至6任一项中所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体选自下组：抗 体RAB9、抗体RABO和抗体RAB0、或RAM9、RAM4或RAM0,优选RAM9,所述糖皮质激素选自下 组：全身给药时为（甲基）氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，所述MIF相关 疾病是T细胞介导的免疫反应。
12. 如权利要求10或11所述的联合治疗，其中，所述T细胞介导的免疫反应是皮肤炎 症，例如银肩病或接触性超敏反应。
13. 如权利要求10至12任一项中所述的联合治疗，其中，所述糖皮质激素是布地奈德， 并且布地奈德配制为局部施用。
14. 如权利要求1至5任一项中所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体选自下组：抗 体RAB9、抗体RABO和抗体RABO、或RAM9、RAM4或RAMO,优选RAM9,所述糖皮质激素是布地 奈德，所述MIF相关疾病是炎症性肠病（IBD)，其中，所述IBD选自溃疡性结肠炎和克罗恩 病。
15. 如权利要求1至6任一项中所述的联合治疗，其中，所述抗-MIF抗体选自下组：抗 体RAB9、抗体RABO和抗体RAB0、或RAM9、RAM4或RAM0,优选RAM9,所述糖皮质激素选自下 组：全身给药时为（甲基）氢化泼尼松和地塞米松，局部给药时为布地奈德，所述MIF相关 疾病是多发性硬化。
16. -种试剂盒，其包含权利要求1至15任一项中所述的联合，以及使用说明。
17. 如权利要求1至15任一项中所述的联合，或如权利要求16所述的试剂盒，用于糖 皮质激素接受性疾病的治疗，特别是用于炎症、过敏、哮喘或癌症的治疗。
【文档编号】C07K16/24GK104470540SQ201380028648
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年4月16日 优先权日:2012年4月16日
【发明者】R·克西堡曼, D·弗尔克尔, F·沙伊夫林格, H·埃尔利希 申请人:巴克斯特保健股份有限公司, 巴克斯特国际公司