抗Nogo-A抗体在肌萎缩侧索硬化治疗中的最佳剂量方案的制作方法
【专利摘要】本发明涉及治疗或预防神经障碍特别是但并非排他地为肌萎缩侧索硬化（ALS）的方法，其包括抗Nogo-A抗体的施用。
【专利说明】抗Nogo-A抗体在肌萎缩侧索硬化治疗中的最佳剂量方案 发明领域
[0001] 本发明涉及治疗或预防神经障碍特别是但并非排他地为肌萎缩侧索硬化(ALS)的 方法，其包括抗Nogo-A抗体的施用。
[0002] 发明背景 肌萎缩侧索硬化（ALS)也称为卢伽雷氏病（Lou Ge虹ig's Disease)或夏科氏病 (Maladie de化arcot)，是最常见的成人发病的运动神经元病。主要疾病标志是皮质脊髓 束中的上位和下位运动神经元的进行性退变。下位运动神经元(在脑干和脊髓中）的功能障 碍触发全身乏力，肌肉萎缩和痛疾。呼吸肌的失效一般是致命事件，在发病1-5年内发生。
[0003] ALS是成人中最常见的运动神经元病，每年影响美国大约30, 000人和英国5, 000 人（Lei曲和Swash, 1991)。典型发病年龄在50至70岁之间，尽管有时在更年轻时发生。 大多数病例（90-95%)分类为散发性ALS (sALS)，并且剩余部分是遗传性的，并且被称为家 族性ALS(fALS)。散发性和家族性形式是临床和病理学相似的，提示共同发病机理（Bruijn 等人，2004)。然而，大多数病例的确切原因仍是未知的，并且不存在停止该疾病进程的有效 治疗法。
[0004] Nogo也称为Reti州lon-4或神经突增生抑制剂（Neurite outgrowth inh化itor)，是在人中由《7}似基因编码的蛋白质，所述《7}似基因已鉴定为对于中枢神经系 统特异性的神经突增生的抑制剂。
[0005] H种形式的人Nogo已得到鉴定；Nogo-A具有1192个氨基酸残基（GenBank登录号 AJ251383);Nog〇-B，缺乏在假定细胞外结构域中的残基186至1004的剪接变体（GenBank登 录号AJ251384); W及更短的剪接变体，Nogo-C，其也缺乏残基186至1004并且还具有更小 的替代氨基末端结构域（GenBank登录号AJ251385) (Prinjha R等人（2000)化Uire 403， 383-384)。CNS抑制蛋白质例如Nogo的抑制可W提供改善神经元损害且促进神经元修复和 生长的治疗方法，由此潜在帮助从神经元损伤例如持续于中风中的神经元损伤恢复。此类 Nogo抑制剂的实例可W包括小分子、肤和抗体。
[0006] 已报道针对NI-220/250产生的鼠单克隆抗体IN-1促进轴突再生（Caroni，P 和 Schw油，ME (1988) Neuron 1 85-96 ;Schnell, L 和 Schwab, ME (1990) P^Jature ；343 269-272 ;Bregman，BS 等人（1995WaUire 378 498-501 和 IliallmairiM 等人（1998WaUire Neuroscience 1 124-131 )，所述NI-220/250是其为神经突生长的有效抑制剂的髓磯脂 蛋白（并且W后显示为Nogo-A的片段)。还已报道Nogo-A是IN-1的抗原（化en等人（2000 ) 化化re 403 434-439)。IN-1 F油片段或人源化IN-1的施用增强在已经历脊髓横切术的 大鼠中的恢复（Fiedler, M 等人（2002)Protein 化 g 15 931-941;化 osamle，C 等人（2000) J. Neuroscience 20 8061-8068)。
[0007] 与 Nogo 结合的单克隆抗体在 WO 2004/052932、W0 2005/028508、W0 2005/061544 和WO 2007/068750中描述。WO 2004/052932公开了 w高亲和力与某些形式的人Nogo结合 的鼠抗体11 口。W0 2005/061544还公开了高亲和力单克隆抗体，包括鼠单克隆抗体2A10， 并且一般公开了其人源化变体，例如化L11(化和L11的序列分别在SEQ ID NO. 33和34 中提供(仅VH或化序列））。所公开的抗体W高亲和力与人Nogo-A结合。wo 2007/068750 公开了许多高亲和力人源化单克隆抗Nogo抗体，包括肥化16 (肥8和L16的序列分别在 SEQ ID NO. 49和14中提供(仅VH或化序列））。公开的抗体指示可用于治疗神经性疾病。
[0008] 尽管本领域提供了用于治疗神经障碍的高亲和力抗Nogo抗体，但优化此类障碍 的治疗方案仍是高度期望的目标。
[000引发明概述 根据本发明的第一个方面，提供了治疗或预防患者中的神经障碍的方法，所述方法包 括给所述患者施用抗Nogo-A抗体或其功能片段，其剂量实现且维持所述抗体与人Nogo-A 在所述患者的细胞膜上大于90%的共定位水平。
[0010] 根据本发明的第二个方面，提供了用于治疗或预防患者中的神经障碍的抗Nogo-A 抗体，所述治疗或预防包括施用所述抗Nogo-A抗体或其功能片段，其剂量实现且维持所述 抗体与人Nogo-A在所述患者的细胞膜上大于90%的共定位水平。
[0011] 根据本发明的第H个方面，提供了用于治疗或预防患者中的神经障碍的药物组合 物，所述药物组合物包含抗Nogo-A抗体或其功能片段，所述治疗或预防包括施用所述抗 Nogo-A抗体或其功能片段，其剂量实现且维持所述抗体与人Nogo-A在所述患者的细胞膜 上大于90%的共定位水平。
[0012] 附图简述 图1 :激光扫描细胞计量术（LSC)充分扫描，W鉴定组织切片（灰色图像)，并且将四个 区域(蓝绿色框)置于每个切片上。高分辨率场扫描产生H种染料的位置图像。各种蛋白质 染为蓝色（Y肌聚糖)、红色（Nogo A)和绿色（肥8L16)。
[0013] 图2:事件群体口控(给药前活检样品）。产生散布图W基于英光强度就特征区分 染料像素。
[0014] 图3 ;事件群体口控(给药前活检样品)。该图是显示"背景口控（back gating)"过 程的场图像，所述"背景口控"用于显示在组织切片上的口控事件。
[00巧]图4 ;事件群体口控(给药后活检样品）。如图2中产生散布图，然而，在用15 mg/ kg肥化16给药后。
[001引图5 ;事件群体口控(给药后活检样品)。背景口控如图3中进行，然而，在用15 mg/ kg肥化16给药后。
[0017] 图6 ;NogoA/肥化16表达（Y肌聚糖通道未示出）。显示了各个英光通道。首行仅 显示祀（Nogo A)，第二行仅显示肥化16,并且第H行显示Nogo A和肥化16。
[0018] 图7 ;在膜上与肥化16共定位的Nogo A百分比。显示了在肌纤维膜上与肥化16 共定位的Nogo A百分比。突出显示"15mg/kg"的框显示了在用15 mg/kg肥化16给药后 实现共定位的最大量。每柱表示一个切片。
[0019] 图8 ;与肥化16共定位的膜Nogo-A的中值百分比。数据来自2. 5 mg/kg重复剂 量(左图)、15 mg/kg重复剂量（中间3个图）和15 mg/kg单一剂量(右图）。来自重复剂量 组的活检样品的一式H份切片，连同来自单一剂量组的活检样品的单一切片的中值。
[0020] 图9 ;在血浆肥化16浓度和与肥化16共定位的膜Nogo-A百分比之间的模型估计 关系（Emax)。
[002。 图10 ;关于每4周施用的15mg/kg肥化16的预测中值(第5百分位数和第95百 分位数）肥化16血浆浓度时间概况。
[002引图11 ;关于每2周施用的15mg/kg肥化16的预测中值(第5百分位数和第95百 分位数）肥化16血浆浓度时间概况。
[002引 图12 ;肥化16抗体的可变重链区和可变轻链区。
[0024] 发明详述 根据本发明的第一个方面，提供了治疗或预防患者中的神经障碍的方法，所述方法包 括给所述患者施用抗Nogo-A抗体或其功能片段，其剂量实现且维持所述抗体与人Nogo-A 在所述患者的细胞膜上大于90%的共定位水平。
[00巧]应当理解本文提及"共定位"指与抗Nogo-A抗体定位、连接（associated with) 或结合化ound to)的膜结合的Nogo-A比例。例如，100%共定位的值等于所有膜Nogo-A与 抗Nogo-A抗体共定位。技术人员应当理解共定位不等于祀占据，然而，它的确提供非常有 用的可能药效作用的量度，W便确定最佳剂量方案。
[0026] 本文呈现的数据证实在细胞膜上Nogo-A与抗Nogo-A抗体W大于90%的水平共定 位实现最大药效作用。
[0027] 本文提及"抗Nogo-A抗体"指任何抗体或其变体形式，包括但不限于能够与 Nogo-A结合的抗体片段、结构域抗体或单链抗体。抗Nogo-A抗体可W是中和性抗Nogo-A 抗体。抗Nogo-A可W是鼠、嵌合、人源化或全人抗体或其片段。"中和"及其语法变化指任 何Nogo功能，并且更具体地，任何Nogo-A功能的全部或部分抑制。
[002引如本文使用的，提及"治疗"指与肌萎缩侧索硬化相关的疾病症状和/或肌萎缩侧 索硬化的原因的降低或消除，包括皮质脊髓束中的神经元的进行性变性、肌纤维去神经和/ 或肌无力和/或痊李状态的降低或消除。如本文使用的，提及"预防"指与肌萎缩侧索硬化 相关的疾病症状的延缓、防止或降到最低，包括皮质脊髓束中的神经元的进行性变性、肌纤 维去神经和/或肌无力和/或痊李状态的延缓、防止或降到最低。
[0029] 应当理解待施用的抗Nogo-A抗体的量和频率将选择W确保实现且维持在细胞膜 上与Nogo-A的共定位大于90%。
[0030] W0 2010/004031公开了用于治疗人中的ALS或其他神经性疾病的抗Nogo-A抗体 的合适剂量将在0. 1 mg/kg至300 mg/kg的范围内，通常为约2 mg/kg至约40 mg/kg。因 此，在一个实施方案中，抗Nogo-A抗体的剂量为0.1 mg/kg至300 mg/kg。在进一步的实施 方案中，抗Nogo-A抗体的剂量为2 mg/kg至40 mg/kg。
[0031] 此外，WO 2007/068750公开了用于治疗人中的中风及其他神经性疾病的抗 Nogo-A抗体的合适剂量将在700 mg至3500 mg/70 kg体重的范围内。因此，在一个实施方 案中，抗Nogo-A抗体的剂量为10 mg/kg至50 mg/kg。
[0032] 在本发明的一个特定实施方案中，抗Nogo-A抗体的剂量为15 mg/kg。本文呈现的 数据令人惊讶地显示了 15 mg/kg剂量的有利结果。特别地，该剂量特别顺应方便的剂量频 率，W实现大于在细胞膜上与Nogo-A的90%共定位的本发明阔值。
[0033] 本文呈现了本发明特别有利的15 mg/kg剂量的数据，其显示对于施用后8天的持 续时间，在细胞膜上与Nogo-A的共定位增加至大于90%，而在施用后22至27天之间，降至 大约70%。因此，在一个实施方案中，当剂量为15 mg/kg时，维持大于90%共定位的合适剂 量间隔为8至22天。在进一步的实施方案中，当剂量为15 mg/kg时，维持大于90%共定位 的合适剂量间隔为10至18天。
[0034] 在本发明的一个特定实施方案中，当剂量为15 mg/kg时，维持大于90%共定位的 合适剂量间隔为14天。应当理解14天剂量间隔的轻微变化将是可接受的，并且给药将在 最佳的14天剂量间隔前或后14天+/-直到3天时发生。因此，在一个实施方案中，当剂量 为15 mg/kg时，维持大于90%共定位的合适剂量间隔为11天至17天巧P在最佳的14天剂 量间隔前或后3天)。在可替代实施方案中，当剂量为15 mg/kg时，维持大于90%共定位的 合适剂量间隔为12天至16天（即在最佳的14天剂量间隔前或后2天)。在可替代实施方 案中，当剂量为15 mg/kg时，维持大于90%共定位的合适剂量间隔为13天至15天（即在最 佳的14天剂量间隔前或后1天)。
[0035] 根据本发明的进一步方面，提供了治疗或预防患者中的神经障碍的方法，其包括 每14天（+/- 3天）给所述患者施用剂量为15 mg/kg的抗Nogo-A抗体。
[0036] 可W依照本发明使用的抗Nogo-A抗体的实例在W0 2004/052932、W0 2005/028508、W0 2005/061544 和 W0 2007/068750 中描述，所述专利的抗 Nogo-A 抗体通过 引用并入本文。
[0037] 在一个实施方案中，抗Nogo-A抗体是单克隆抗体。
[0038] 在一个实施方案中，抗Nogo-A抗体是人源化抗体。本文提及术语"人源化抗体"指 该样的一类工程抗体，其具有来源于非人供体免疫球蛋白的CDR，该分子的剩余免疫球蛋白 衍生部分来源于一种(或多种)人免疫球蛋白。另外，可W改变构架支持残基，W保存结合亲 和力（参见例如如een 等人，Proc.化tl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989)，Hodgson 等人，Bio/Technology，9:421(1991 ))。合适的人受体抗体可W是通过与供体抗体(在该种 情况下，鼠供体抗体2A10)的核巧酸和氨基酸序列的同源性，选自常规数据库例如KABAT? 数据库、Los Alamos数据库和Swiss Protein数据库的抗体。通过与供体抗体的构架区的 同源性(在氨基酸基础上)表征的人抗体可能适合提供重链恒定区和/或重链可变构架区用 于插入供体CDR。能够贡献轻链恒定区或可变构架区的合适受体抗体可相似方式加 W 选择。应当指出受体抗体重和轻链无需源自相同受体抗体。EP-A-0239400和EP-A-054951 尤其描述了产生此类人源化抗体的几种方法。
[0039] 术语"供体抗体"指非人抗体，其对人源化抗体贡献其可变区、CDR或者它的其他功 能片段或类似物的氨基酸序列，并且从而提供具有供体抗体的抗原特异性和中和活性特征 的人源化抗体。
[0040] 术语"受体抗体"指与供体抗体异源的抗体，所述抗体对人源化抗体提供其重和/ 或轻链构架区和/或其重和/或轻链恒定区的氨基酸序列。受体抗体可W来源于任何哺乳 动物，条件是它在人中是非免疫原性的。在一个实施方案中，受体抗体是人抗体。
[0041] 或者，人源化可W通过"镶面（veneering)"方法来实现。独特的人和鼠免疫球蛋 白重和轻链可变区的统计分析掲示：暴露残基的精确模式在人和鼠抗体中是不同的，并且 大多数各个表面位置具有对于少量不同残基的强优选(参见化dlan E.A.等人；（1991 ) Mol.Immunol.28,489-498 和化 dersenJ.T.等人（1994) J. Mol. Biol. 235;959-973)。 因此，通过替换其构架区中不同于在人抗体中通常发现的那些的暴露残基，能够降低非人 Fv的免疫原性。因为蛋白质抗原性可W与表面可及性关联，所W表面残基的替换可能足W 致使小鼠可变区对人免疫系统"不可见"（还参见Mark G. E.等人（1994)于Han化ook of Experimental Pharmacology 第 113 卷：The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag，第105-134页)。该人源化程序被称为"镶面"，因为仅改变抗体的表面， 支持残基保持不受干扰。进一步的可替代方法在W0 2004/006955中阐述。
[0042] "CDR"定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，其为免疫球蛋白重和轻链的高变区。 参见例如 K油at 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 4 版，U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)。 在免疫球蛋白的可变部分中存在H个重链和H个轻链CDR (或CDR区)。因此，如本文使用 的"CDR"指所有H个重链CDR，或所有H个轻链CDR (或适当时，所有重链CDR和所有轻链 CDR两者)。抗体的结构和蛋白质折叠可W意指其他残基视为抗原结合区的一部分，并且技 术人员将如此理解。参见例如 Qiothia 等人，（1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions ；Nature 342,第 877-883 页。
[0043] 在一个实施方案中，抗Nogo-A抗体是中和性抗Nogo-A抗体或其片段，例如鼠抗体 2A10、15C3和2C4巧日其内容通过引用W其整体并入本文的W0 2005/016544中所述)。
[0044] 在一个实施方案中，抗Nogo-A抗体是W0 2004/052932 (所述专利的内容通过引用 W其整体并入本文）中所述的任何抗体。W0 2004/052932中公开的抗体的实例是11C7,包 括其人源化变体。
[0045] 在一个实施方案中，抗Nogo-A抗体是如W0 2005/028508和W0 2009/056509 (所 述专利的内容通过引用W其整体并入本文)中所述的任何人抗Nogo-A抗体。在进一步的实 施方案中，抗Nogo-A抗体是如W0 2009/056509中所述的人抗Nogo-A抗体6A3。
[0046] 在一个实施方案中，抗Nogo-A抗体包括W0 2007/068750中所述的抗Nogo-A 抗体。在进一步的实施方案中，抗Nogo-A抗体包括人源化抗体例如2A10的人源化变 体，例如肥0L16、肥8L16、肥化13和肥化16 (如其内容通过引用W其整体并入本文的W0 2007/068750中所述)，人抗体或其片段。
[0047] 在进一步的实施方案中，抗Nogo-A抗体包括肥化16 (W0 2007/068750的SEQ ID NO: 48 和沈Q ID NO: 14)、H28L13(W0 2007/068750 的沈Q ID NO: 49 和沈Q ID NO: 13) 或肥化16 (WO 2007/068750的SEQ ID NO: 49和SEQ ID NO: 14)。在再进一步的实施方 案中，抗 Nogo-A 抗体包括肥化 16 (WO 2007/068750 的 SEQ ID NO: 49 和 SEQ ID NO: 14， 分别为本文的SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2)。
[0048] 在进一步的实施方案中，抗Nogo-A抗体包括肥7FL L16FL (WO 2007/068750的 沈Q ID NO: 54 和沈Q ID NO: 18)、肥8FL L13FL (W0 2007/068750 的沈Q ID NO: 55 和 沈Q ID NO: 17)或肥8FL L16化（WO 2007/068750 的沈Q ID NO: 55 和沈Q ID NO: 18)。 在再进一步的实施方案中，抗Nogo-A抗体包括肥8FL L16FL (WO 2007/068750的SEQ ID NO: 55 和沈Q ID NO: 18)。
[0049] 在进一步的实施方案中，抗Nogo-A抗体包括肥化16 (WO 2007/068750的SEQ ID NO: 49 和沈Q ID NO: 14)或肥8化 L16化（WO 2007/068750 的沈Q ID NO: 55 和沈Q ID NO: 18)。在再进一步的实施方案中，抗Nogo-A抗体包括肥化16 (WO 2007/068750的SEQ ID NO: 49 和沈Q ID NO: 14)。
[0050] 在进一步的实施方案中，抗Nogo-A抗体或其片段包括2A10、肥8L16或6A3的CDR 中的一个或多个，任选六个。在进一步的实施方案中，抗Nogo-A抗体或其片段是如H2化16 结合相同的人Nogo-A表位（人Nogo-A 610-621aa，其包括来自wo 2010/004031的SEQ ID NO:6)或与肥化16竞争结合人Nogo-A的抗体。
[0051] 可W依照本发明的剂量方案治疗的神经障碍的实例选自：中风(缺血性或出血 性)、外伤性脑损伤、脊髓损伤、阿尔茨海默氏病、额顯痴呆（Tau蛋白病)、周围神经病变、 帕金森氏病、克雅氏病（CJD)、精神分裂症、肌萎缩侧索硬化(ALS)、多发性硬化、亨廷顿氏 病、多发性硬化、包涵体肌炎、多发性肌炎、皮肌炎、形态非特异性肌病（mo巧hologically nonspecific myopathies)、充血性也力衰竭和神经性疼痛。
[0052] 在一个实施方案中，神经障碍是肌萎缩侧索硬化(ALS)。
[0053] 本发明的抗Nogo-A抗体或其片段的施用模式可W是将药剂递送给宿主的任何合 适途径。本发明的抗体和药物组合物可特别用于肠胃外施用，即皮下（S. C)、銷内、腹膜内 (i. P.)、肌内（i. m.)、静脉内（i. V.)或鼻内（i. n.)。在一个实施方案中，抗Nogo-A抗体或 其片段静脉内施用。在可替代实施方案中，抗Nogo-A抗体或其片段皮下施用。
[0054] 根据本发明的第二个方面，提供了用于治疗或预防患者中的神经障碍的抗Nogo-A 抗体，所述治疗或预防包括施用所述抗Nogo-A抗体或其功能片段，其剂量实现且维持所述 抗体与人Nogo-A在所述患者的细胞膜上大于90%的共定位水平。
[0055] 根据本发明的第H个方面，提供了用于治疗或预防患者中的神经障碍的药物组合 物，所述药物组合物包含抗Nogo-A抗体或其功能片段，所述治疗或预防包括施用所述抗 Nogo-A抗体或其功能片段，其剂量实现且维持所述抗体与人Nogo-A在所述患者的细胞膜 上大于90%的共定位水平。
[0056] 本发明的药物组合物通常含有在药学上可接受的载体中的有效量的本发明的抗 体作为活性成分。在本发明的预防药剂中，优选的是通常在生理抑下缓冲，W准备用于注 射形式的含有工程抗体的含水息浮液或溶液。肠胃外施用的组合物通常包含在药学上可接 受的载体(通常为含水载体）中溶解的本发明的抗体或其混合物（cocktail)的溶液。可W 采用多种含水载体，例如0. 9%盐水、0. 3%甘氨酸等等。该些溶液是无菌的并且一般不含颗 粒物。该些溶液可W通过常规、众所周知的灭菌技术(例如过滤）进行灭菌。该组合物可W 含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如抑调节剂和缓冲剂等。在此类药 物制剂中的本发明抗体的浓度可W广泛改变，即从小于约0. 5重量％(通常为或至少约1重 量％)到多达15或20重量％，并且将根据所选的具体施用方式，主要基于流体体积、粘度等 加 W选择。
[0057] 因此，用于肌内注射的本发明的药物组合物可W制备为含有1 mL无菌缓冲水，W 及约1 ng至约100 mg,例如约50 ng至约30 mg或更多，例如约5 mg至约25 mg的本发明 抗体。类似地，用于静脉内输注的本发明的药物组合物可W制备为含有约250 ml 0.9%生 理盐水(氯化轴）溶液，W及约1至约30且通常为5 mg至约25 mg本发明的工程抗体/ml 0. 9%生理盐水(氯化轴）溶液。制备可肠胃外施用的组合物的实际方法是本领域技术人员 众所周知或显而易见的，并且例如在Remington' S化armaceutical Science,第15版，Mack Publishing Company，Easton，Penns}dvania中更详细地描述。关于本发明的可静脉内施用 的抗体制剂的制备，参见Lasmar U和Parkins D ""The formulation of Bio曲armaceutical products",化arma. Sci. Tech, today,第 129-137 页，第 3 卷（2000 年 4 月 3 日），Wang, W "Instability,stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals". Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188，St油ility of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahem T. J. , Manning M. C, New York, NY: Plenum Press (1992), Akers. M. J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J. Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300，Imamura'K 等人"Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J 化arm Sci 92 (2003) 266-274，Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protein- structure-stabilizing effect during freeze-化ying", J Pharm.曲armacol,54 (2002)1033-1039， Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization", J.化arm. Sci，91 (2002) 914-922. Ha, E Wang W, Wang YJ."化roxide formation in polysorbate 80 and protein st油ility", J.化arm Sci,91 ,2252-2264, (2002)，其完 整内容通过引用并入本文并且读者可具体参考。
[0058] 本文描述的抗体可W冻干用于胆存且在使用前在合适载体中重构。该技术已显示 对于常规免疫球蛋白有效，并且可W采用领域已知的冻干和重构技术。
[0059] 在一个实施方案中，抗Nogo-A抗体与进一步的治疗剂组合施用。在进一步的 实施方案中，进一步的治疗剂是具有针对肌萎缩侧索硬化(ALS)的效力的药剂。在再 进一步的实施方案中，具有针对肌萎缩侧索硬化（ALS)的效力的药剂是右旋普拉克索 (dexpramipexole)。右旋普拉克索（KNS-760704 ;(仍-火-丙基-4, 5, 6, 7-四氨苯并[刮喔 哇-2, 6-二胺)是由Knopp Biosciences and Biogen开发的药物。涉及102位患者的2010 年II期临床试验显示ALS疾病进展的减慢，并且III期试验目前在进行中。
[0060] 在一个实施方案中，抗Nogo-A抗体与具有抗谷氨酸活性的化合物一起施用。 在具体实施方案中，具有抗谷氨酸活性的化合物是利鲁哇（riluzole)。在另一个实施 方案中，具有抗谷氨酸活性的化合物是AMPA受体枯抗剂，例如2, 3-苯二氮卓化合物 (2, 3-benzodiazepine compound),特别是他仑帕奈。在另一个实施方案中，具有抗谷氨酸 活性的化合物是TR0 19622或头抱曲松。抗Nogo-A抗体和具有抗谷氨酸活性的化合物可 W同时、连续或分开施用于患者。当具有抗谷氨酸活性的化合物是利鲁哇时，约50mg至约 150或200mg利鲁哇可W每天施用于患者，通常lOOmg利鲁哇每天施用于患者。利鲁哇通 常是口服施用的。当具有抗谷氨酸活性的化合物是他仑帕奈时，他仑帕奈通常W约lOmg至 约250mg每天口服施用一次到五次。在一个实施方案中，他仑帕奈W 25mg或50mg的剂量 每天施用一次到五次，任选每天H次。
[0061] 本发明参考下述研究进行举例说明： 实施例1 ;Nogo A和肥化16的共定位分析 激光扫描细胞计量术（LSC)使用激光来激发英光染料，W产生染料在细胞和组织切片 中的位置的图像，该允许测量在所述位置中的表达。染料连接至与祀向蛋白质结合的抗体。 连接至Alexa 647染料的商业抗Nogo-A抗体用于鉴定肥化16的祀。商业Nogo A抗体的 使用允许测量组织切片中的祀。还期望知道多少祀（Nogo A)定位在肌纤维膜上。该通过 用连接至Alexa 488染料的针对肌纤维膜蛋白质抗y肌聚糖的抗体染色切片来进行。
[0062] 该允许鉴定和测量与肌纤维膜共定位且丕与膜共定位的祀（Nogo A)的量。接下 来，需要定量在给药的肌肉切片中的肥化16量W及与其祀（Nogo A)的共定位。为了提供 肥化16的该种定量，用Alexa 555染料标记的针对肥化16的非中和性抗独特型抗体用于标 记肌肉切片。一旦H种组分用H种不同染料标记，LSC软件就可W用于区分且测量每种特 征。
[0063] 进行充分扫描W鉴定组织切片（灰色图像)，并且将四个区域(蓝绿色框）置于每个 切片上。高分辨率场扫描产生H种染料的位置图像。
[0064] 图1显示了其中将颜色指定至每个通道的LSC区域图像。例如，各种蛋白质染色 为蓝色（Y肌聚糖)、红色（Nogo A)和绿色（肥8L16)。轮廓为白色的矩形框是构成区域图 像的各个场图像。每个区域图像含有10个场图像。
[0065] 产生散布图W基于英光强度就特征区分染料像素。像素是使用称为"口控"的方法 的阔值(使背景噪声与特异性信号区分开)。口控作为彩色线展示在散布图上，并且根据口 产生的次序，将口标记为R1、R2和R3…等（图2)。图2的散布图通过针对彼此标绘两个通 道来产生。组织的膜和非膜区域通过针对"绿色强度"标绘"绿色最大像素"进行区分。R1 中的最亮像素在用Y肌聚糖抗体标记的膜上。R5中的较微暗像素是未标记的纤维。长红 色强度值针对膜值(绿色最大像素）进行标绘，W获得与膜R2共定位的Nogo A的量。为了 获得在膜上的药物量，绿色最大像素针对黄色强度进行标绘。因为该是给药前活检样品，所 W如果存在的话，在R3中不存在会含有在膜上的药物的事件。最后一个图显示将与Nogo A 共定位在膜上的药物。
[0066] 在口控群体内的像素组可W作为彩色框展示在图像上。该方法被称为"背景口 控"。验证口的最准确放置是质量控制任务（图3)。图2中的散布图中的口控群体展示在 图3的图像中。由图3应注意到，该些数据来自仅用媒介物给药的患者，因此存在用针对 肥8L16的抗独特型抗体的最小背景染色W及与Nogo-A共定位的很少证据(红色框)。
[0067] 当与显示来自用15 mg/kg肥化16给药的患者的数据的图4和5相比较时，应当 指出背景口控显示出显示丕与Nogo A共定位的肥化16的位置的绿色框，W及显示肥化16 直Nogo A共定位的红色框。因此，图4和5显示了 R3中的阳性药物事件W及药物和Nogo A的共定位。
[0068] 图6显示了各个英光通道。给药前活检样品是红色的，并且与给药后活检样品相 比较，不存在澄色/黄色英光，所述给药后活检样品显示肥化16与Nogo A的共定位W及不 与Nogo A共定位的过量肥化16。高共定位沿纤维膜发生。
[0069] 图7是显示在肌纤维膜上与肥化16共定位的Nogo A百分比的图。切H个切片并 且评估每个患者活检样品(用药物或安慰剂给药前和后)。在来自未给药受试者(给药前或 安慰剂给药）的活检样品中可见一些低水平的共定位，代表用与Nogo-A共定位的抗独特型 抗体可见的非特异性背景染色。更高水平的抗独特型染色和共定位在药物给药后样品中始 终可见，其中共定位显示剂量依赖性增加。突出显示的切片显示了在肌肉膜上最高水平的 肥化16与Nogo A的共定位，该在从用15mg/kg肥化16给药后8天的受试者中收集的活检 样品中可见。
[0070] 实施例2 ;使用共定位实验研究肥化16对于肌萎缩侧索硬化（ALS)的最佳剂量方 案 在不存在对肌肉中的肥化16的药效应答的直接测量的情况下，使用肥化16在骨骼肌 细胞的膜上的祀位点处与Nogo-A的共定位，W告知剂量选择，如实施例1中所述。例如，为 了评估Nogo-A的肌肉水平和肥化16对骨骼肌的生物分布，从"在人中首次"（FTiH)研究 中的指定组（cohort)收集肌肉活检样品。数量足W支持免疫组织化学分析的冷冻活检样 品（主要来自0. 5 mg/kg、2. 5 mg/kg和15 mg/kg组)用针对Nogo-A的抗体、针对肥化16的 抗独特型抗体和抗Y肌聚糖界定肌肉膜）进行染色。使用英光标记的二级抗体显影表 达，并且使用激光扫描细胞计量术（LSC)定量。使用该方法，可W评价在肌肉膜上的Nogo-A 表达，并且通过与Y肌聚糖的共定位而区别于细胞内Nogo-A表达。另外，测量肌肉中的 肥化16水平的估计值，并且衍生在肌肉膜上Nogo-A与肥化16的共定位程度的估计值。
[0071] 使用抗独特型染色评价肌肉中的肥化16水平，观察到药物染色中的剂量依赖性 增加，其中在0.5 mg/kg时无可测量的染色，并且在给药后第22-27天时，在来自15 mg/kg 给药受试者的活检样品中可见最高染色(与肌肉中的药物水平的免疫测定测量一致)。改变 15 mg/kg重复剂量组(组8)中的活检样品收集时间点允许评价在给药后药物对肌肉的生物 分布的时间过程。该些数据显示在第1天时在肌肉中最初较低水平的肥化16,增加直到第 8天，然后到第23-24天再次轻微下降。
[0072] 在该些活检样品中的膜Nogo-A水平的另外测量允许评价在给药后在祀位点处 Nogo-A与肥化16的共定位程度。图8展示了在得自2. 5 mg/kg和15 mg/kg组的给药后活 检样品中的肌细胞膜处与肥化16共定位的Nogo-A的中值百分比(其中100%将等于所有膜 Nogo-A均与肥化16共定位）。
[0073] 共定位程度紧密跟随肌肉中测量的肥化16水平，其中在来自15 mg/kg处理的受 试者的活检样品中可见的水平高于来自2.5 mg/kg组的活检样品。在15 mg/kg重复剂量 组中，共定位再次与H2化16水平关联，在第1天时具有?50%中值共定位，在给药后第8天 时在肌肉膜上与研究药物共定位的Nogo-A增至>90%，然后在第22-27天时回落到?70%。
[0074] 尽管共定位不等于祀占据，但认为肌肉膜Nogo-A与肥化16的>90%共定位是在整 个剂量间隔上所需的，W便实现最大药效作用。基于LSC数据，需要15 mg/kg肥化16的剂 量水平W实现在给药后第8天时膜Nogo-A与肥化16的>90%共定位，尽管该共定位程度未 维持到第23-24天。图9中显示了探索性PK-ro建模，W研究在活组织检查时估计的血浆 肥化16浓度(使用群体PK模型)与相应共定位水平之间的潜在关系。对该些数据应用Emax 模型估计在"18帖/mL区域中的ECs。和^leOlVmL的ECg。。
[00巧]基于群体PK建模和后续模拟来研究给药方案W维持血浆肥化16浓度超过ECg。，显 而易见的是，在FTiH研究中利用的给药方案(每4周一次15 mg/kg)预测未完全平均维持 在给药间隔上超过160嗦/mL的血浆浓度。然而，将给药频率增加至每2周一次15 mg/kg 预测平均维持在给药间隔上超过160嗦/血的浓度。关于每2和4周施用的15mg/kg预测 的血浆肥化16浓度时间概况在下文分别展示于图10和图11中。就每2周15 mg/kg的提 议给药方案而言，预测的肥化16血浆暴露（Cm。,和AUC 展示于表1中。
[007引表1关于每2周施用的15mg/kg肥化16,预测的中值(第5百分位数和第95百分 位数）肥化16血浆Cmax和AUC (0-tau)。
【权利要求】
1. 一种治疗或预防患者中的神经障碍的方法，所述方法包括给所述患者施用抗 Nogo-A抗体或其功能片段，其剂量实现且维持所述抗体与人Nogo-A在所述患者的细胞膜 上大于90%的共定位水平。
2. 如权利要求1中限定的方法，其中所述抗Nogo-A抗体剂量为0.1 mg/kg至300 mg/ kg。
3. 如权利要求2中限定的方法，其中所述抗Nogo-A抗体剂量为15 mg/kg。
4. 如权利要求3中限定的方法，其中所述大于90%共定位维持8至22天。
5. 如权利要求4中限定的方法，其中所述大于90%共定位维持10至18天。
6. 如权利要求5中限定的方法，其中所述大于90%共定位维持11至17天。
7. 如权利要求6中限定的方法，其中所述大于90%共定位维持12至16天。
8. 如权利要求6中限定的方法，其中所述大于90%共定位维持13至15天。
9. 如权利要求8中限定的方法，其中所述大于90%共定位维持14天。
10. -种治疗或预防患者中的神经障碍的方法，所述方法包括每14天+/- 3天以15 mg/kg的剂量给所述患者施用抗Nogo-A抗体或其功能片段。
11. 如权利要求1-10中任一项中限定的方法，其中所述抗Nogo-A抗体是单克隆抗体。
12. 如权利要求1-11中任一项中限定的方法，其中所述抗Nogo-A抗体是人源化抗体。
13. 如权利要求1-12中任一项中限定的方法，其中所述抗Nogo-A抗体包括H28L16。
14. 如权利要求1-13中任一项中限定的方法，其中所述神经障碍选自中风(缺血性或 出血性)、外伤性脑损伤、脊髓损伤、阿尔茨海默氏病、额颞痴呆（Tau蛋白病)、周围神经病 变、帕金森氏病、克雅氏病（CJD)、精神分裂症、肌萎缩侧索硬化(ALS)、多发性硬化、亨廷顿 氏病、多发性硬化、包涵体肌炎、多发性肌炎、皮肌炎、形态非特异性肌病、充血性心力衰竭 和神经性疼痛。
15. 如权利要求14中限定的方法，其中所述神经障碍是肌萎缩侧索硬化(ALS)。
16. 如权利要求1-15中任一项中限定的方法，其进一步包括与进一步的治疗剂组合施 用。
17. 如权利要求16中限定的方法，其中所述进一步的治疗剂是具有针对肌萎缩侧索硬 化(ALS)的效力的药剂。
18. 如权利要求17中限定的方法，其中所述具有针对肌萎缩侧索硬化(ALS)的效力的 药剂是右旋普拉克索。
19. 如权利要求16中限定的方法，其中所述进一步的治疗剂是具有抗谷氨酸活性的化 合物。
20. 如权利要求19中限定的方法，其中所述具有抗谷氨酸活性的化合物是利鲁唑。
【文档编号】C07K16/22GK104395343SQ201380035806
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2013年7月3日 优先权日:2012年7月5日
【发明者】J.布尔曼, D.克鲁尔 申请人:葛兰素集团有限公司