通过用正电性有机添加剂处理来降低蛋白质制剂中蛋白质-污染物复合物和聚集物水平...的制作方法

通过用正电性有机添加剂处理来降低蛋白质制剂中蛋白质-污染物复合物和聚集物水平 ...的制作方法
【专利摘要】通过以低浓度的正电性有机添加剂(例如依沙吖啶、氯己定或聚乙烯亚胺)与酰脲(例如尿素、尿酸或尿囊素)或有机调节剂(例如非离子有机聚合物、表面活性剂、有机溶剂或酰脲)的组合的处理来降低抗体和其他蛋白质制剂中的聚集物水平的方法。本发明的一些方面涉及用于降低细胞培养物收获物的聚集物水平并使其澄清的方法。其还涉及将这些能力与另一些纯化方法整合，以达到期望的最终纯化水平。
【专利说明】通过用正电性有机添加剂处理来降低蛋白质制剂中蛋白 质-污染物复合物和聚集物水平的方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于增强包含抗体在内的蛋白的纯化的方法。其特别涉及用于降低细 胞培养物收获物的聚集物水平并使其澄清的方法。其还涉及将这些能力与另一些纯化方法 整合，以达到期望的最终纯化水平。
[0002] 发明背景
[0003] 有研宄表明，来源于宿主细胞的污染物与体外细胞培养法产生的重组蛋白质之 间自发形成非天然的异质结合（Shukla等，Biotechnol.Progr. (2008)24:1115-1121; Luhrs等，J.Chromatogr.B(2009) 877: 1543-1552;Mechetner等，J.Chromatogr. B(2011)879:2583-2594;Gagnon等，J.Chromatogr.A, (2011) 1218:2405-2412 ; Gagnon,BioprocessingJ. (2010)9(4) :14-24)。这些异质结合可在两个方面视作非天然 的：1)组成型污染物常常是非人源的，由活的非人宿主细胞分泌至培养基中或当非人宿主 细胞在死亡后裂解时释放至培养基中。在活人体内，这样的非人污染物不存在；以及2)与 快速消除死细胞组分的人体内系统相比，组成型污染物积累至高浓度。因此，重组产物暴露 于一般不出现在活系统中的浓度的高水平强相互作用性污染物。同时，重组蛋白质的高表 达水平使它们成为与这些非人污染物非特异性结合的合适底物，倾向于形成不期望的多种 组合物的异质结合，包括复合物和聚集物。
[0004] 通过直接革E1向污染性蛋白质（Shukla等和Gagnon等，见上文）以及间接通过革巴向 与污染性蛋白质有关的相应DNA组分（Luhrs等和Gagnon，间上文），在一定程度上克服了 异质聚集物中的污染性蛋白含量。当一些复合物解离时，指示抗体聚集水平的降低（Shukla 等、Mechetner等和Gagnon，见上文）。公开了阴离子交换剂降低抗体-污染物复合物水平 的的能力（Luhrs等和Gagnon等，见上文），但是没有指示阴离子交换处理能够完全消除异 质聚集物。已经尝试使用了尺寸排阻色谱、阳离子交换色谱和疏水相互作用色谱来降低异 质聚集物，但是这些技术一般不如阴离子交换（Gagnon等，见上文）。
[0005]用可期望使异质聚集物解离的试剂处理抗体制剂一般被证明是无效的。例如，使 用高浓度尿素、盐或这两者的组合基本不使IgM-污染物的异质聚集物解离（Gagnon等，见 上文）。有研宄表明，以尿素、醇和表面活性剂进行洗脱前洗涤的蛋白A亲和色谱比不进行 洗涤更有效地降低异质聚集物水平（Shukla等，见上文），组合尿素、盐和EDTA以及蛋白G 亲和色谱的洗脱前洗涤的亦有此效果（Mechetner等，见上文）。有研宄表明，以尿素进行 洗脱前洗涤的阴离子交换色谱比没有尿素洗涤更有效地减少异质聚集物（Gagnon等，见上 文）。还有研宄表明，以EDTA进行洗脱前洗涤的阳离子交换色谱比不进行洗涤更有效地减 少异质聚集物（Gagnon等，见上文）。最后，以尿素和/或盐进行洗脱前洗涤的羟磷灰石层 析也比不进行这样的洗涤更有效地减少异质聚集物（Gagnon，见上文）。尽管有这些发现， 但是一般而言，在对结合至色谱柱的抗体进行洗脱前洗涤中使用解离试剂仅取得了中度的 成功。
[0006] 有研宄指示了正电性有机添加剂用于酸性蛋白质沉淀（Farhner等，美国专利申 请No. 20080193981;Ma等，J.Chromatogr.B(2010)878:798-806;Peram等，Biotechnol.Progr.，（2010) 26:1322-1326 ;Glynn，inU.Gottschalk(编写），ProcessScale PurificationofAntibodies,J.T.Wiley和Sons, (2009)Hoboken, 309-324)，以及用于 DNA和内毒素沉淀（Glynn，见上文；Cordes等，Biotechnol.Progr.，（1990) 6:283-285 ; Dissingetal.，Bioseparation, (1999)7221:9-11)和病毒失活（Bernhardt，美国专利 5, 559, 250)。还有研宄表明，多价金属阳离子从一些蛋白制剂去除DNA和内毒素（Akcasu 等，Nature, (1960) 187:323-324;Matsuzawa等，Nucl.AcidsRes.，（2003) 3 (3): 163-164; Christensen等，Prot.Expr.Purif.，（2004)37:468-471;Kejnovsky等，Nucl.Acids Res.，（1997) 25:1870-1871 ;0ngkudon等，Anal.Chem.，（2011) 83391:13-17) 〇 [0007]发明概述
[0008] 在某些实施方案中，本发明提供了用于通过以正电性有机添加剂处理样品来降低 包含所需蛋白质种类的样品（例如蛋白质制剂）中产物-污染物复合物和聚集物的量的方 法。在某些实施方案中，以超低水平的正电性有机添加剂实现复合物和/或聚集物的减少。 在某些实施方案中，本发明特别降低包含染色质残余物（例如核小体和/或组蛋白和/或 DNA)的聚集物的含量。在某些实施方案中，在升高的电导率值（盐浓度）下处理所述样品。 在某些实施方案中，以未溶解的酰脲额外处理所述样品，并收集包含所需蛋白质的上清。在 某些实施方案中，替选地或额外的用诸如非离子有机聚合物、有机溶剂、表面活性剂或酰脲 的其他有机添加剂处理所述样品，以增强复合物或聚集物中与所需蛋白质结合的污染物的 解离。在某些实施方案中，随后将经处理的样品暴露于携带化学部分的固体材料，所述化学 部分从所述所需蛋白质选择性去除正电性有机添加剂以及其他可能的化学实体。
[0009] 发明详述
[0010] 提供了用于蛋白质纯化的方法和试剂盒。在某些实施方案中，本发明提供通过 使抗体或其他蛋白质与正电性有机添加剂接触来从抗体或其他蛋白质的制剂中减少蛋白 质-污染物复合物和聚集物。在某些实施方案中，本发明可以在从所谓生理学条件至最高 3倍或更多倍这样的生理学条件的电导率值的电导率水平范围内实施；这样的升高的电导 率水平可抑制所需蛋白质或靶蛋白的沉淀。在某些实施方案中，本发明可以超低浓度的正 电性有机添加剂来实施，例如是这样的添加剂用于介导沉淀目的时的浓度的1/10或1/100 的水平。在某些实施方案中，本发明提供了以下优点，降低针对为目的蛋白定制的要求开发 要求的需要、改进目的蛋白的回收、改进纯化方法的重现性并降低去除聚集物的额外处理 步骤的需要。
[0011] 本文公开的实施方案提供了降低包含所需蛋白质的样品的聚集物含量的方法，所 述方法包括使所述样品与正电性有机添加剂和未溶解的酰脲接触。
[0012] 在一些这样的实施方案中，在15mS/cm或更高的电导率值下降低包含所需蛋白质 的样品的聚集物含量的方法，所述方法包括以〇. 1 %或更低浓度添加正电性有机添加剂。
[0013] 在前述实施方案中的一个或多个中，降低包含所需蛋白质的样品的聚集物含量的 方法，所述样品具有5mS/cm或更高电导率值，所述方法包括在一种或多种有机添加剂的存 在下以0. 1%或更低的浓度添加正电性有机添加剂，以减少沉淀形成，其中所述一种或多种 有机添加剂选自酰脲、有机溶剂或表面活性剂。
[0014] 在前述实施方案的一个或多个中，降低包含所需蛋白质的样品的聚集物含量的方 法，所述方法包括提供包含聚集物的样品，以及使所述样品与正电性有机添加剂接触，其中 所述所需蛋白质溶解于所述样品中。
[0015] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述酰脲是尿囊素。
[0016] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述酰脲以约0. 5 %重量/体积至约2 %重量 /体积的范围存在。
[0017] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述正电性有机添加剂包含选自依沙吖啶、 氯己定、聚乙烯亚胺、亚甲蓝和苯扎氯铵中的一种。
[0018] 在前述实施方案中的一个或多个中，在添加正电性有机添加剂之前添加所述酰 脲。
[0019] 在前述实施方案中的一个或多个中，添加盐至基本防止所需蛋白质形成沉淀的水 平。
[0020] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述所需蛋白质包含选自抗体、因子VIII、生 长激素和重组蛋白质中的一种。
[0021] 在前述实施方案中的一个或多个中，添加所述正电性有机添加剂至1 %重量/体 积或更低重量/体积的水平。
[0022] 在前述实施方案中的一个或多个中，添加所述正电性有机添加剂至0. 1 %重量/ 体积或更低重量/体积的水平。
[0023] 在前述实施方案中的一个或多个中，添加所述正电性有机添加剂至0. 01%重量/ 体积或更低重量/体积的水平。
[0024] 在前述实施方案中的一个或多个中，添加所述正电性有机添加剂至0. 001%重量 /体积或更低重量/体积的水平。
[0025] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述正电性有机添加剂以0. 02 %至0. 03% 的浓度范围存在。
[0026] 在前述实施方案中的一个或多个中，存在多种正电性有机添加剂。
[0027] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述多种正电性有机添加剂的总浓度是1% 重量/体积或更低重量/体积。
[0028] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述多种正电性有机添加剂的总浓度是 0. 1 %重量/体积或更低重量/体积。
[0029] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述多种正电性有机添加剂的总浓度是 〇. 〇1 %重量/体积或更低重量/体积。
[0030] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述多种正电性有机添加剂的总浓度是 0. 001 %重量/体积或更低重量/体积。
[0031] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述未溶解的酰脲是尿囊素。
[0032] 在前述实施方案中的一个或多个中，尿囊素以约0. 56%重量/体积至约1%重量 /体积的浓度范围存在。
[0033] 在前述实施方案中的一个或多个中，尿囊素以约1%重量/体积至约2%重量/体 积的浓度范围存在。
[0034] 在前述实施方案中的一个或多个中，尿囊素以约2%重量/体积至约5%重量/体 积的浓度范围存在。
[0035] 在前述实施方案中的一个或多个中，尿囊素以约5 %重量/体积至约10 %重量/ 体积的浓度范围存在。
[0036] 在前述实施方案中的一个或多个中，尿囊素以约10%重量/体积至约15%重量/ 体积的浓度范围存在。
[0037] 在前述实施方案中的一个或多个中，在添加所述正电性有机添加剂之前向所述样 品中添加酰脲。
[0038] 在前述实施方案中的一个或多个中，将所述样品的电导率调节至足够高的水平以 抵消所述所需蛋白质因沉淀而造成的大量损失。
[0039] 在前述实施方案中的一个或多个中，将所述样品的电导率调节至比抵消所述所需 蛋白质的大量损失所需水平更高的水平。
[0040] 在前述实施方案中的一个或多个中，将所述样品的电导率调节为高至生理学电导 率的两倍。
[0041] 在前述实施方案中的一个或多个中，将所述样品的电导率调节为高至生理学电导 率的三倍过更高。
[0042] 在前述实施方案中的一个或多个中，降低所述样品的电导率，但保持足够高以抵 消所述所需蛋白质的大量损失。
[0043] 在前述实施方案中的一个或多个中，在添加所述正电性有机添加剂之前调节所述 样品的电导率。
[0044] 在前述实施方案中的一个或多个中，存在有机溶剂。
[0045] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述有机溶剂包括选自乙醇、异丙醇、乙二 醇、丙二醇、三（正丁基）磷酸酯和甘油中的一种。
[0046] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述有机溶剂包括约0. 01 %重量/体积至约 20 %重量/体积范围的浓度。
[0047] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述有机溶剂包括约0. 01%至约1%浓度范 围的乙二醇、丙二醇、甘油、乙醇、异丙醇或三（正丁基）磷酸酯。
[0048] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述有机溶剂包括约1%至约5%浓度范围 的乙二醇、丙二醇、甘油、乙醇或异丙醇。
[0049] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述有机溶剂包括约5 %至约10 %浓度范围 的乙二醇、丙二醇、甘油、乙醇或异丙醇。
[0050] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述有机溶剂包括约10%至约20%浓度范 围的乙二醇、丙二醇或甘油。
[0051] 在前述实施方案中的一个或多个中，存在有机溶剂，并且其包含选自乙醇、异丙醇 和三（正丁基）磷酸酯中的一种。
[0052] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述有机溶剂的浓度小于1%。
[0053] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述有机溶剂的浓度小于0. 1%。
[0054] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述有机溶剂的浓度小于0. 01%。
[0055] 在前述实施方案中的一个或多个中，存在可溶酰脲。
[0056] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述可溶酰脲是尿素。
[0057] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述可溶酰脲以约0. 5M至约1M的浓度范围 存在。
[0058] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述可溶酰脲以约1M至约2M的浓度范围存 在。
[0059] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述可溶酰脲以约2M至约4M的浓度范围存 在。
[0060] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述可溶酰脲以约4M至约8M的浓度范围存 在。
[0061 ] 在前述实施方案中的一个或多个中，存在表面活性剂。
[0062] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述表面活性剂包括非离子表面活性剂。
[0063] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述表面活性剂包括选自吐温和Triton中 的一种。
[0064] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述表面活性剂包括两性离子表面活性剂。
[0065] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述两性离子表面活性剂包括选自CHAPS、 CHAPS0和十八烧基葡糖苷（octaglucoside)中的一种。
[0066] 56.如权利要求51至55中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂以低于1 %的 非零浓度存在。
[0067] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述表面活性剂以低于0. 1%的非零浓度存 在。
[0068] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述表面活性剂以低于0. 01%的非零浓度存 在。
[0069] 在前述实施方案中的一个或多个中，存在螯合剂。
[0070] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述螯合剂带正电。
[0071] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述带正电的螯合剂包括三（2-氨基乙基） 胺或去铁胺。
[0072] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述螯合剂以低于100mM的非零浓度存在。
[0073] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述螯合剂以低于50mM的非零浓度存在。
[0074] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述螯合剂以低于20mM的非零浓度存在。
[0075] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述螯合剂以低于10mM的非零浓度存在。
[0076] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述螯合剂以低于5mM的非零浓度存在。
[0077] 在前述实施方案中的一个或多个中，存在以下物质中的多种：(a)有机溶剂，（b) 有机聚合物，（c)可溶酰脲，（d)表面活性剂，（e)螯合剂和（f)盐。
[0078] 在前述实施方案中的一个或多个中，所述被接触的样品暴露于一种或多种固体， 以在随后的使所述所需蛋白质与残余的污染物分离的处理步骤之前除去至少一种正电性 有机添加剂。
[0079] 提供了用于实施前述实施方案中任一项所述方法的试剂盒。
[0080] 在某些实施方案中，本发明提供了用于降低具有比所需蛋白质更高分子量的聚集 物（例如同质聚集物）水平的方法，还提供了用于降低流体动力学尺寸仅中度大于所需蛋 白质的聚集物（例如异质聚集物）的水平的方法。在某些实施方案中，聚集物包括所需蛋 白质与污染物的异质聚集物，并且在某些这样的实施方案中，所述污染物是核酸、核苷酸、 内毒素、金属离子、蛋白质、脂质或细胞培养基组分。在某些实施方案中，基本消除存在的所 需蛋白质的同质聚集物。在某些实施方案中，基本消除存在的所需蛋白质与污染物的异质 聚集物。
[0081] 在某些实施方案中，本发明还提供了与聚集物的减少一起的诸如DNA、内毒素和病 毒等污染物水平的降低。在某些实施方案中，通过额外包括抗病毒剂来实施本发明。
[0082] 在某些实施方案中，目的蛋白质种类（例如待纯化的所需蛋白质）是重组来源的， 并且蛋白质制剂可包括：包含细胞的细胞培养物收获物、细胞培养物上清、澄清的细胞培养 物上清、色谱柱的洗脱物或得自之前纯化步骤的包含蛋白质的溶液。在某些实施方案中，所 述蛋白质制剂包含抗体，并且在某些这样的实施方案中，所述抗体是IgG、IgM或其片段形 式，或者抗体或抗体片段的融合蛋白，例如Fc融合蛋白质。在某些实施方案中，所述所需蛋 白质可为凝血蛋白，例如因子VIII。在某些实施方案中，所述所需蛋白质可为肽激素，例如 人生长激素。
[0083] 在某些实施方案中，使所述样品的电导率处于基本避免所述所需蛋白质从所述样 品中沉淀的足够高的水平来实施本发明。可根据本领域已知的方法通过添加盐或稀释剂来 调节电导率。在某些实施方案中，所述电导率比确定为避免所述所需蛋白质大量沉淀所需 的水平高51113/〇11、1〇1113/〇11、151113/〇]1或2〇1113/〇]1。在某些实施方案中，所述电导率大于2〇1113/ cm、25mS/cm、30mS/cm、35mS/cm、40mS/cm、45ms/cm或大于 45mS/cm。在升高的电导率下去除 重要的污染物亚群的方法的能力是本发明的令人意想不到的特征之一，因为已知在升高的 电导率下这些系统中的电荷相互作用降低。例如，在25mS/cm和更高的电导率下，已知仅少 数带负电的蛋白质结合至正电性表面。除了本方法之外，制备IgG抗体的大多数正电性试 剂的应用在低于5mS/cm的电导率下进行，并且通常具有附加的碱性pH运行要求。本方法 不要求这样的运行pH。对本领域技术人员将显而易见的是，升高的电导率可具有弱化聚集 物中内部静电结合的效果，并因此提高本方法实现解离聚集物和/或去与所需蛋白质结合 的污染物的能力。
[0084]在某些实施方案中，所述正电性有机添加剂是依沙吖啶、9-氨基吖啶（氨吖啶）、 3, 6吖啶二胺（原黄素）、吖啶琐辛、叮啶氯（酚吖啶）、吖啶橙、喹吖因、乐杀螨（acricide)、 吖啶酮、吖啶-9-羧酸、氯甲氧吖啶（1_[ (6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基）氨基]-3-(二乙基 氨基）-2-丙醇二盐酸盐）、酚藏花红、酚噁嗪、吩噻嗪、B丫啶黄（氯化3, 6-二氨基-10-甲基 吖啶和3, 6-吖啶二胺）、聚乙烯亚胺（聚（亚氨基亚乙基））、氯己定或聚氨基酸。在某些 实施方案中，所述正电性有机添加剂是依沙吖啶、聚乙烯亚胺或氯己定，或其盐。
[0085]在某些实施方案中，以基本为足以促进期望的聚集物减少程度的最低浓度来提供 所述正电性有机添加剂。在某些实施方案中，所述正电性有机添加剂的浓度为低于（基于 重量/体积）〇.l%、〇. 05%、0. 04%、0. 025%或0. 001%。在某些实施方案中，以0. 01%至 0. 04 %或0. 02 %至0. 025%的浓度提供所述正电性有机添加剂。在某些这样的实施方案 中，所述正电性有机添加剂是依沙吖啶、聚乙烯亚胺（PEI)或氯己定。所述方法在所述正电 性有机添加剂低于0. 1%浓度的情况下实现有用效果的能力凸显了所述方法的另一个意想 不到的特征：除了以升高的电导率并且无需碱性pH要求运行外，所述方法可为高度有效的 而不引起显著的沉淀量。正电性有机添加剂通常用于介导酸性蛋白质、DNA和病毒等污染物 的沉淀。因此，可以以例如1%或更高的高浓度来使用它们。本发明的目的是解离聚集物， 或弱化聚集物内部的结合，或除去使聚集物稳定的非产物污染物。在许多实施方案中，本方 法的第二目的是使沉淀最小化或避免沉淀，或者使去除沉淀的需要最小或避免该需要，这 是低的正电性有机添加剂浓度和高运行电导率的原因。
[0086] 在某些实施方案中，本发明可在选择的pH下实施，以在降低样品中聚集物的量的 同时避免或限制所需蛋白质的沉淀。可通过常规方法调节pH水平，并且可结合电导率的选 择来选择pH水平。在某些实施方案中，所述样品的pH为约4至约9、约5至约8、或约6至 约7. 5。这再次凸显了使用正电性有机添加剂的该不寻常的性质。
[0087] 在某些实施方案中，优选基本在添加所述正电性有机添加剂的同时，使所述样品 还与抗病毒剂接触。在某些这样的实施方案中，所述抗病毒剂本身是正电性有机分子，例如 苯扎氯铵或亚甲蓝。也可使用电中性或非离子抗病毒剂，例如三（正丁基）磷酸酯。抗病 毒剂可以低于约1% (w/v)、低于约0. 1% (w/v)或低于约0.01% (w/v)或低于约0.001 % 的量存在。在蛋白质不耐受通过在低pH下处理来进行病毒失活的情况下，这样的试剂可为 特别有用的。
[0088] 在某些实施方案中，所述方法包括使所述样品与足以使酰脲不在所述样品中溶解 的量的酰脲接触的步骤。然后可使包含所述所需蛋白质的上清从包含经沉淀的污染物的样 品平衡中分离。在某些这样的实施方案中，在使所述样品与所述正电性有机添加剂接触的 步骤之前提供所述酰脲，在另一些实施方案中，在使所述样品与所述正电性有机添加剂接 触的步骤的基本同时提供所述酰脲，并且在另一些实施方案中，在使所述样品与所述正电 性有机添加剂接触的步骤之后提供所述酰脲。在某些这样的实施方案中，所述酰脲可为任 意的以下物质：尿酸、乙内酰脲（咪唑啉啶-2,4-二酮）、尿囊素（2, 5-二氧-4-咪唑烷基） 脲、尿囊素氯羟铝、尿囊素羟铝、hemocane、脲基乙内酰脲、5-脲基乙内酰脲）、乙醛酰基酰 脲、乙醛酸二酰脲、2, 5-二氧-4-咪唑烷基脲、咪唑基啶基脲和嘌呤。在某些实施方案中，所 述酰脲是尿囊素，并且在一些这样的情况下，所述尿囊素以高于0. 56 % (w/v)、1 %、1. 5 %、 2 %或更高的浓度存在。在某些实施方案中，所述酰脲是尿酸，并且在一些这样的情况下，所 述尿酸以高于〇. 0025% (w/v)、0. 005%、0. 01%、0. 05%、0. 1%、1%或更高的浓度存在。
[0089] 在某些实施方案中，所述方法还包括使所述样品与使酰脲完全溶解的量的酰脲接 触。在某些这样的实施方案中，所述可溶酰脲可为尿素、咪唑基啶基脲或其他酰脲。在某 些实施方案中，所述酰脲是尿素，并且在一些这样的情况下，所述尿素以高于0.5M，或高于 1M，或高于2M，或高于4M，或高于6M，或高于8M的浓度存在。这再次凸显了所述方法的该出 乎意料的性质，其中避免蛋白质沉淀是所述方法的特定目的。诸如尿素等高度可溶的酰脲 具有使许多化合物的溶解度升高的一般效果，换言之，其的存在抵抗沉淀的形成。对本领域 技术人员将显而易见的是，高度可溶的酰脲的存在可具有弱化聚集物中内部疏水和/或氢 键键合结合的效果，并因此提高本方法实现解离聚集物和/或去与所需蛋白质结合的污染 物的能力。
[0090] 在某些实施方案中，通过以下事实增强了本发明的效用，其还加速了细胞培养物 收获物中的细胞碎肩的沉淀，并显著降低所存在的DNA、内毒素和病毒的水平。实验数据表 明，一些酰脲倾向于与聚集物、内毒素和病毒相互作用的能力对这些结果有贡献，并且与不 存在酰脲的情况下用正电性有机添加剂相比，低水平溶解的酰脲可贡献它们所支持的更高 的抗体回收率。本发明与非正电性的抗病毒剂的添加相容，后者可进一步扩展本发明的效 用。在处理后，可通过沉淀或过滤去除固体材料，留下上清中基本不含聚集物的蛋白质。这 提供了本发明的另一个优点，即，经处理的材料为光学澄清的并且没有颗粒，而通过其他方 法处理的材料通常是浑浊并且不透明的。
[0091] 在某些实施方案中，本发明可通过使所述样品与诸如非离子有机聚合物、有机溶 剂、表面活性剂或酰脲等可溶有机调节剂接触的附加步骤来实施。在某些这样的实施方案 中，在使所述样品与所述正电性有机添加剂接触步骤之前进行使所述样品与所述有机调节 剂接触的步骤。在另一些实施方案中，在使所述样品与所述正电性有机添加剂接触步骤的 基本同时进行使所述样品与所述有机调节剂接触的步骤。在另一些实施方案中，在使所述 样品与所述正电性有机添加剂接触步骤之后进行使所述样品与所述有机调节剂接触的步 骤。在某些实施方案中，所述有机调节剂是非离子有机聚合物，例如聚乙二醇、聚丙二醇和 聚丁二醇，并且在某些这样的实施方案中，所述非离子有机聚合物的平均分子量为约1000D 或更低、500D或更低、250D或更低或者100D或更低。在某些实施方案中，所述有机调节剂 是有机溶剂，例如乙二醇、丙二醇、丁二醇、二甲基亚砜、乙醇或苯氧乙醇。在某些实施方案 中，以约1% (w/v)或更高的浓度提供所述有机调节剂。在某些实施方案中，所述有机调节 剂是表面活性剂，例如吐温、triton、CHAPS、CHAPSO或辛基葡糖苷，并且在某些这样的实施 方案中，以约1% (w/v)或更低、约0. 1 %或更低或者约0. 02% (w/v)或更低的浓度提供所 述表面活性剂。在某些实施方案中，所述有机调节剂是以亚饱和量提供的酰脲，并且在某些 这样的实施方案中，所述酰脲是尿素、乙内酰脲或尿囊素。这再次凸显了本发明的该不同寻 常的性质，其中在降低或消除显著量的沉淀形成的条件下使用正电性有机添加剂。除了异 常低浓度的正电性有机添加剂外，高的运行电导率、对碱性pH的非依赖性以及公知的尿素 增溶效果、有机溶剂和表面活性剂的存在，都具有弱化某些优选的正电性有机添加剂与蛋 白质污染物或其他污染物之间的疏水相互作用的效果。这尤其适用于疏水性的正电性有机 添加剂，例如依沙吖啶或其类似物，或者适用于氯己定或苯扎氯铵。对本领域技术人员将显 而易见的是，诸如所述的有机添加剂的存在可具有弱化聚集物中内部化学结合的效果，并 因此提高本方法实现解离聚集物和/或去与所需蛋白质结合的污染物的能力。
[0092] 在某些实施方案中，本发明提供了用于降低溶液中包含所需蛋白质的样品的聚集 物含量的方法，其中使所述样品与正电性有机添加剂接触。在某些实施方案中，所述样品的 电导率处于基本避免所述所需蛋白质从所述样品中沉淀的足够高的水平。在某些实施方案 中，所述电导率高于15mS/cm，或者所述电导率高于30mS/cm。
[0093] 在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述正电性有机添加剂的浓 度低于约0.1% (w/v)。在某些实施方案中，所述正电性有机添加剂选自依沙吖啶、9-氨基 吖啶（氨吖啶）、3, 6吖啶二胺（原黄素）、吖啶琐辛、叮啶氯（酚吖啶）、吖啶橙、喹吖因、乐 杀螨（acricide)、吖啶酮、丫啶-9-羧酸、氯甲氧吖啶（1-[(6_氯-2-甲氧基-9-吖啶基）氨 基]-3-(二乙基氨基）-2-丙醇二盐酸盐）、酚藏花红、酚噁嗪、吩噻嗪、叮啶黄（氯化3, 6-二 氨基-10-甲基吖啶和3, 6-吖啶二胺）、聚乙烯亚胺、氯己定和聚氨基酸。在某些实施方案 中，本发明提供了这样的方法，其中所述正电性有机添加剂是依沙吖啶、聚乙烯亚胺或氯己 定，或其盐。在某些实施方案中，本发明提供这样的方法，其中所述正电性有机添加剂以约 0. 01 %至约0. 05%的量存在，或以低于约0. 01 %的量存在，或以低于约0. 005%的量存在， 或以低于约0. 001 %的量存在。
[0094] 在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述样品的pH为约4至约9、 约5至约8或约6至约7. 5。
[0095] 在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，减少的聚集物包括所需蛋白质的 同质聚集物，在另一些实施方案中，减少的聚集物包括所需蛋白质与污染物的异质聚集物， 并且在另一些实施方案中，所述聚集物包括同质聚集物和异质聚集物二者。在某些实施方 案中，本发明提供了这样的方法，其中基本消除样品中聚集物。在某些实施方案中，减少的 聚集物具有与所需蛋白质基本相同的流体动力学尺寸。在某些实施方案中，减少的聚集物 是异质聚集物，包括核酸、核苷酸、内毒素、金属离子、蛋白质、脂质或细胞培养基组分。
[0096] 在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所需蛋白质是抗体或抗体片 段。在某些实施方案中，所述样品是细胞培养物收获物、细胞培养物上清、来源于细胞培养 物的包含抗体的溶液或来源于之前的蛋白质纯化阶段的包含抗体的溶液。
[0097] 在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述样品是来源于之前的蛋 白质纯化阶段的包含所需蛋白质的溶液。在某些实施方案中，所述样品是来自色谱柱的洗 脱物。
[0098] 在某些实施方案中，本发明提供了其中还使所述样品与抗病毒剂接触的方法。在 某些实施方案中，所述抗病毒剂选自苯扎氯铵、亚甲蓝和三（正丁基）磷酸酯。在某些实施 方案中，所述抗病毒剂以低于约1% (w/v)的量存在，或以低于约0.1% (w/v)的量存在，或 以低于约0.01% (w/v)的量存在。
[0099] 在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其包括以下附加步骤：使所述样品 与足以使酰脲不在所述样品中溶解的量的酰脲接触，并且从所述样品的部分分离包含所需 蛋白质的上清。
[0100] 在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中在使所述样品与所述正电性 有机添加剂接触步骤之前进行使所述样品与所述酰脲接触的步骤。
[0101] 在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中在使所述样品与所述正电性 有机添加剂接触步骤的基本同时进行使所述样品与所述酰脲接触的步骤。
[0102] 在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中在使所述样品与所述正电性 有机添加剂接触步骤之后进行使所述样品与所述酰脲接触的步骤。
[0103] 在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述酰脲选自尿素、尿酸、乙 内酰脲、尿囊素、尿囊素氯羟铝、尿囊素羟铝、hemocane、脲基乙内酰脲、5-脲基乙内酰脲、乙 醛酰基酰脲、乙醛酸二酰脲、2, 5-二氧-4-咪唑烷基脲和嘌呤。
[0104] 在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述酰脲是尿囊素。在某些实 施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述尿囊素以高于0.5% (w/v)的量存在。在某 些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述尿囊素以高于约1% (w/v)的量存在。
[0105] 在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述酰脲是尿酸。在某些实施 方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述尿酸以高于0.0025% (w/v)的量存在。在某 些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述尿酸以高于约0.01% (w/v)的量存在。 在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述尿酸以高于约0.1% (w/v)的量存 在。在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述尿酸以高于约1% (w/v)的量 存在。
[0106] 在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述方法包括使所述样品与 选自有机聚合物、有机溶剂、表面活性剂和酰脲的有机调节剂接触的额外步骤。在某些实施 方案中，本发明提供了这样的方法，其中在使所述样品与所述正电性有机添加剂接触步骤 之前进行使所述样品与所述有机调节剂接触的步骤。在某些实施方案中，本发明提供了这 样的方法，其中在使所述样品与所述正电性有机添加剂接触步骤的基本同时进行使所述样 品与所述有机调节剂接触的步骤。在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中在使 所述样品与所述正电性有机添加剂接触步骤之后进行使所述样品与所述有机调节剂接触 的步骤。
[0107] 在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述有机调节剂是选自聚乙 二醇、聚丙二醇和聚丁二醇的非离子有机聚合物。在某些实施方案中，本发明提供了这样的 方法，其中所述非离子有机聚合物的平均分子量为约500D或更低。
[0108] 在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述有机调节剂是选自乙二 醇、丙二醇、丁烯醇、二甲基亚砜、乙醇和苯氧乙醇的有机溶剂。在某些实施方案中，本发明 提供了这样的方法，其中以约1% (w/v)或更高的浓度提供所述有机调节剂。
[0109] 在某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述有机调节剂是选自吐温、 triton、CHAPS、CHAPSO和辛基葡糖苷的表面活性剂。在某些实施方案中，本发明提供了这 样的方法，其中以约1% (w/v)或更低的浓度提供所述表面活性剂。在某些实施方案中，本 发明提供了这样的方法，其中以约0. 1% (w/v)或更低的浓度提供所述表面活性剂。在某些 实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述有机调节剂是以亚饱和量提供的酰脲。在 某些实施方案中，本发明提供了这样的方法，其中所述酰脲选自尿素、乙内酰脲和尿囊素。
[0110] 在某些实施方案中，本发明提供了为方便地实施本文所公开的任意方法提供的试 剂盒，所述试剂盒包含正电性有机添加剂和足以使所述样品过饱和的量的至少一种酰脲、 有机调节剂以及抗病毒剂抗病毒剂，其中以对于提供试剂盒所针对的样品足以方便地实施 本发明的量来提供所提供的材料。
[0111] 在某些实施方案中，本发明提供了用于方便地实施本发明某些方法的试剂盒。这 样的试剂盒可提供用于实施本发明的可用试剂，例如一种或多种多价有机阳离子、酰脲、有 机调节剂、抗病毒剂，以及用于调节电导率的试剂。所述试剂盒可提供适于实施本发明用于 蛋白质纯化的量和浓度的材料。这样的试剂盒可适用于某些蛋白质，例如IgG抗体或IgM 抗体，并且可适于适合某些级别的蛋白质制备和纯化的量。材料可提供为即用的溶液形式、 适于稀释的浓缩溶液或由使用者制备溶液来使用的固体形式，用于实施本发明的方法。
[0112] 在某些实施方案中，本发明之后可使所述样品与固体材料接触，目的是所述固体 具有在其他处理之前从所述样品选择性去除所述正电性试剂或其他样品组分的效果。
[0113] 在某些实施方案中，本发明可与常规的蛋白质纯化方法组合，以达到更高的纯化 水平或去除其他污染物。例如，本发明可结合包括沉淀、色谱、和液体-液体萃取法在内的 常规纯化方法来实施。可使这样的其他方法与本发明组合成它们在本发明的方面之前、期 间或之后进行。本领域技术人员能够开发适于这些方法的条件，并且使其与本文描述的发 明整合以实现对产品进行期望的纯化。
[0114] 在某些实施方案中，本发明允许在色谱纯化开始前降低聚集物水平，消除后续处 理步骤的负荷。可与减少聚集物一起降低DNA、内毒素和病毒水平，这进一步减少了下游纯 化步骤的负荷。在某些实施方案中，使用有机调节剂组合正电性有机添加剂防止形成大量 沉淀，并且潜在地使根据本发明处理的样品可以直接应用于色谱柱，而无需中间处理步骤 来除去固体。这样的实施方案还可与添加非正电性有机添加剂抗病毒试剂相容。
[0115] 在某些实施方案中，运行条件可相对于pH和/或由存在的螯合剂、有机聚合物或 溶剂、表面活性剂、离液剂以及多种盐而变化，以调节聚集物减少到的程度并且所需蛋白质 保持于溶液中。
[0116] 本发明的其他目的和优点将部分地记载于下面的描述中，以及部分地通过该描述 而显而易见，或者可通过实施本发明来知晓。通过权利要求中规定的元素和组合将使本发 明的目的和优点被认知和得到。
[0117] 应理解，前述的一般描述和下面的详细描述二者都仅是示范性的和解释性的，并 且不限制要求保护的本发明。
[0118] 发明详述
[0119] 定义
[0120] 定义术语以更容易地理解本发明。另一些定义记载于详细描述中。
[0121] "聚集物"是指在生理学条件下稳定的并且可在宽pH范围和电导率条件下稳定的 两个或更多个分子的结合物。聚集物常常包含至少一种生物分子，例如蛋白质、核酸或脂 质，以及另一种分子或金属离子。所述结合通过任意类型的化学相互作用或化学作用的任 意组合来发生。抗体聚集物可分为两大类："同质聚集物"是指两个或更多个抗体分子的稳 定结合；"异质聚集物"是指一种或多种抗体分子与一种或多种非抗体分子的稳定结合。非 抗体组分可由选自核酸、内毒素、金属离子、蛋白质、脂质或细胞培养基组分的一种或多种 实体组成。
[0122] "抗体"是指免疫球蛋白、复合物或其片段化形式。该术语可包括但不限于衍生自 人其他哺乳动物细胞系的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类型的多克隆抗体或单克隆抗体，包括 天然形式或遗传改造形式，例如人源化、人、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、移植以及体 外生成的抗体。"抗体"还可包括复合物形式，包括但不限于包含免疫球蛋白部分的融合蛋 白。"抗体"还可包括抗体片段，例如Fab、F(ab'）2、Fv、scFv、Fd、dAb、Fc以及其他组合物， 无论其是否保留抗原结合功能。
[0123] "内毒素"是指在裂解后从细胞释放的存在于革兰氏阴性细菌外膜中的有毒的热 稳定的脂多糖物质。
[0124] "非离子有机聚合物"是指天然存在的或合成的包含连接重复有机亚单位的烃，其 不含带电基团。其可为直链的、主要直链带有一些分枝的或主要分枝的。适于实施本发明 的实例包括但不限于聚乙二醇（PEG)、聚丙二醇和聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。PEG具有结构式 H〇-(CH2-CH2-〇)n-H。实例包括但不限于平均聚合物分子量范围低于100道尔顿至高于1000 道尔顿的组合物。
[0125] "正电性有机添加剂"是指携带至少一个正电荷并且可包含多个正电荷的有机分 子、阳离子或者天然的盐或合成来源的盐。所述正电性有机添加剂还可携带负电荷，但是在 这种情况下，在使用其的工作条件下，其仍然保持净正电荷。在所述正电性有机添加剂为净 正电的情况下，其可与抗衡离子（阴离子）一起提供，例如氯离子、溴离子、硫酸根、有机酸、 乳酸根、葡糖酸根或不与所述方法相抵触的任何其他阴离子。在某些实施方案中，由胺、亚 胺或其他氮部分提供正电性有机添加剂的某些正电荷。正电性有机添加剂还可包括疏水残 基、金属亲和残基、氢键键合残基、其他官能部分，和/或其可具有参与其他类型的化学相 互作用的能力。在某些实施方案中，正电性有机添加剂的实例包括但不限于二氨基酸、二 肽、三肽或更大的均聚或异聚肽，例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸；聚乙烯亚 胺；聚烯丙胺；聚苄菊酯（polydimethrine)、聚甲基丙烯酰胺基丙基三甲基氨；聚二烯丙基 二甲基氨；聚乙烯基苄基三甲基氨；聚乙烯基胍；聚（N-乙基-4-乙烯基吡啶）；DEAE-葡聚 糖；DEAE-纤维素；依沙吖啶（CAS号442-16-0 ;7_乙氧基吖啶-3, 9-二胺）；三（2-氨基 乙基）胺；胍；氯己定；阿来西定；citricidal、鱼精蛋白；精胺；亚精胺；鞋精蛋白、壳聚糖； 以及前述物质的变体和衍生物。例如，依沙吖啶的变体和衍生物被理解为包括9-氨基吖啶 (氨吖啶）、3, 6吖啶二胺（原黄素）、吖啶琐辛、叮啶氯（酚吖啶）、吖啶橙、奎吖因、乐杀螨、 吖啶酮、吖啶-9-羧酸、氯甲氧吖啶（1_[ (6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基）氨基]-3-(二乙基 氨基）-2-丙醇二盐酸盐）、酚藏花红、吩噁嗪、吩噻嗪、B丫啶黄（氯化3, 6-二氨基-10-甲基 吖啶和3, 6-吖啶二胺），以及其盐（例如，氯化物、溴化物、硫酸盐、乳酸盐、葡糖酸盐）。
[0126] "有机溶剂"是指天然存在的或合成的以液体状态存在的有机化合物。适于实施本 发明的实例包括但不限于乙二醇、丙二醇、二甲亚砜、乙醇和苯氧乙醇。
[0127] "有机聚合物"是指有机单体的天然存在的或合成的聚合物。实例包括但不限于聚 乙二醇、聚丙二醇、葡聚糖或纤维素等。
[0128] "多核苷酸"是指由链中共价结合的多个核苷酸单体组成的聚合物。DNA(脱氧核 糖核酸）和RNA(核糖核酸）是多核苷酸的实例。
[0129] "蛋白质"是指包含碳、氢、氧、氮以及常常包含硫并且主要包含通过肽键连接的一 条或多条氨基酸链的复合有机大分子群的任意一种，。蛋白质可为天然来源的或重组来源 的。蛋白质可由非氨基酸部分修饰，例如通过糖基化、聚乙二醇化或与另一些化学部分缀 合。蛋白质的实例包括但不限于抗体、凝血因子、酶和肽类激素。
[0130] "未溶解的酰脲"是指在特定蛋白质制备中常用的条件下包含超过酰脲最大溶解 度的量的酰脲的溶液。在某些实施方案中，本发明以高于酰脲在样品中的溶解度的量提供 具有酰脲的样品，使这样的样品处于这样的酰脲中的一部分在样品中以未溶解的形式存在 的条件下。
[0131] "表面活性剂"包括"表面活性的试剂"，例如一类一般体现疏水部分和亲水部分 的有机分子，这使其被称为两性分子。在水溶液中足够浓度下，表面活性剂可自结合成簇， 其中疏水部分浓缩于中央从而最小程度地与水的接触，并且亲水部分向外辐射从而最大 化程度地与水接触。在存在生物学制剂尤其是包含具有疏水性质或具有疏水性面积的材 料的生物学制剂的情况下，表面活性剂的疏水部分倾向于自发地与疏水材料的一部分结 合，并通过表面活性剂亲水部分的影响来提高所述制剂的溶解度。它们还可用于调节溶 解于水性溶剂中的两种不同疏水材料之间的发生的疏水相互作用。适于实施本发明某些 实施方案的表面活性剂实例包括但不限于，非离子表面活性剂，例如聚山梨醇酯表面活性 剂（例如，吐温20,聚氧乙烯（20)山梨醇酐单月桂酸酯以及吐温80,聚氧乙烯（20)山梨 醇酐单油酸酯）和Triton(例如，聚乙二醇对（1，1，3, 3-四甲基丁基）-苯基醚）；以及两 性离子表面活性剂，例如CHAPS(3-[(3-胆酰氨基丙基）二甲基胺基]-1-丙烷磺酸盐）， CHAPS0 (3-[ (3-胆酰氨基丙基）二甲基胺基]_2_轻基-1-丙烧横酸盐），以及辛基葡糖苷 (例如，（2R，3S，4S，5R，6R) -2-(羟甲基）-6-辛氧基环氧乙烷-3, 4, 5-三醇）。
[0132] "病毒"或"病毒体"是指仅在主要为细菌、植物和动物的活宿主的细胞内复制的超 显微（直径约20nm至300nm)的代谢惰性的传染剂，其包含RNA或DNA核心、蛋白质外壳， 以及（在更复杂的类型中）周围的包膜。
[0133] 在根据某些实施方案准备使用本发明的情况下，将必须选择正电性有机添加剂。 实验数据揭示，作为一般物质，正电性有机添加剂的疏水性越低，则目的蛋白质的回收率越 高。此外，疏水性越低，则可施用正电性有机添加剂以达到有效的聚集物减少而不显著损失 蛋白质的浓度范围越宽并且越高。因此，弱疏水的PEI可视为比更疏水的依沙吖啶或疏水 性高得多的氯己定更好的候选物。然后，还必须将比产品回收率更重要的其他问题纳入考 虑。PEI体现出公知的细胞毒性，并且难以以足够的灵敏度来检测它，以容易地验证其从通 过纯化方法路线的蛋白质制剂中去除。可优选依沙吖啶，因为其在血浆蛋白质分级领域中 以及作为抗病毒剂具有悠久的历史。此外，其亮黄色和固有荧光有助于在给定样品中灵敏 地测量其含量，从而帮助证明在实施本方法后除去了依沙吖啶。不同的正电性有机添加剂 可体现不同的二级化学官能性，使其具有介导期望作用的能力。例如，PEI被视为主要通过 静电相互作用和氢键来结合DNA。依沙吖啶为这两种相互作用提供较少的机会，但是已知其 插入DNA。这样的差异可在一种正电性有机添加剂的相对适用性与另一种的相对适用性之 间催生微小但是有用的差异，其凸显的点在于，评价可能表面上看起来非理想的候选物可 具有实际益处。
[0134] 在评价正电性有机添加剂用于某些实施方案的使用的过程中，用于施用所述正电 性有机添加剂的条件可按照以下来研宄。正电性有机添加剂的使用对可用于实施某些实施 方案中的方法的条件施加了一些限制。例如，可期望采用基本防止正电性有机添加剂与目 的蛋白质之间强相互作用的条件。一种得到该条件的近似条件的简单方法是将目的蛋白质 施用至阴离子交换剂，并在盐梯度中进行洗脱。刚刚高于所述蛋白质主要洗脱所处的阈值 的盐浓度鉴定为可最有效实施所述方法的最小电导率。该浓度将受到pH的影响，这可通过 相同的方法来建模。如果该方法应用于细胞培养物上清，对于IgG抗体可不需要添加盐或 改变pH以避免显著的损失。对于IgM抗体可需要添加盐，甚至添加至是电导率接近30mS/ cm(约为生理学电导率的2倍）。在某些涉及使用未溶解的酰脲和正电性有机添加剂的实 施方案中，可在低于生理学电导率的条件下进行IgG的应用，潜在地包括lmS/cm或更低的 值，在这种情况下，可结合解离聚集物来去除大量宿主蛋白质。这样的使用可要求正电性有 机添加剂的浓度提高至弥补通过结合至宿主蛋白质而损失的量。在这样的环境下，更低的 运行电导率还可提高对DNA、内毒素和病毒的去除。在某些实施方案中，本发明将一般支持 高于95 %，并且常常为98 %至99 %的抗体回收率。通常应在添加酰脲或正电性有机添加剂 之前建立样品的电导率和pH条件。
[0135] 在某些实施方案中，与由离子相互作用介导的大多数过程相反，建议对实施本发 明的条件评价具体包括并且潜在地倾向于基本高于实际最小值的电导率值。显著低于生理 学电导率的条件，特别是当施用于诸如细胞培养物上清等粗制品，可促使正电性有机添加 剂与酸性蛋白质的强相互作用，这潜在地产生至少两种不期望的结果，一种是这样的条件 可促使沉淀形成。另一种是，正电性有机添加剂的子群体被酸性蛋白质和/或沉淀螯合将 降低剩余的正电性有机添加剂的有效浓度，具有限制本发明降低聚集物含量的潜在效果。 作为一个一般问题，高至3倍生理学值的电导率值将支持有效聚集物的减少，并且抗体回 收率高于90%。
[0136] 在某些实施方案中，并且与针对由离子相互作用（尤其是生物分子和正电性有机 添加剂之间的离子相互作用）介导的大多数过程的建议相反，可降低pH，甚至降至低至4或 更低的值。这样的极限条件几乎是不必需的，并且可能比中性pH值要求更高的电导率以维 持的蛋白质溶解度。
[0137] 在某些实施方案中，一种评价用于经澄清的包含IgG单克隆抗体的细胞培养物上 清的条件的有效方法是覆盖〇. 005 %至0. 05%正电性有机添加剂的范围，以及从生理学值 至2倍生理学值范围的电导率。所述范围还可按需要进一步扩展或缩窄。在这些范围内 观察到沉淀的情况下，经常可通过将电导率提高至高至3倍生理学值而不降低聚集物的减 少。这对应于约45mS/cm。更高的电导率也可起作用。在添加正电性有机添加剂之前调节 样品的电导率一般将是有利的。
[0138] 在某些实施方案中，用于根据本发明开发针对经澄清的细胞培养物上清的纯化方 法的适当起点是使用〇. 02%依沙吖啶。未澄清的包含细胞的收获物将很可能受益于使用更 高浓度，因为细胞可结合至足够的正电性有机添加剂，从而降低可用于异质聚集物解离的 量。在应用于包含细胞的制剂的情况下，本发明的第二益处是其大幅加快了细胞和碎肩的 沉淀，利于它们的去除。在本发明应用于包含细胞的制剂的情况下，可建议维持近生理学条 件以避免过量的细胞死亡率和/或细胞内容物释放至制剂中。
[0139] 在某些实施方案中，通过在添加正电性有机添加剂之前将有机调节剂分散于细胞 制剂中来起始可为有利的，因为该实践可改善抗体回收率。在添加正电性有机添加剂之前 进行长时间孵育使不必要的；15分钟或更短即足够，尽管长时间孵育未表现出缺点。实验 数据一般显示，当在正电性有机添加剂之前以约1%过度饱和的量添加尿囊素提高IgG的 回收率。
[0140] 在某些实施方案中，建议在将正电性有机添加剂添加于样品前，将所述正电性有 机添加剂阳离子溶解于例如水或缓冲液中，以利于其快速遍布于蛋白质制剂中。应警惕 避免持续的局部过量，例如通过将溶解的正电性有机添加剂逐渐灌注至充分混合的混悬剂 中。孵育时间应至少为15分钟，优选30分钟，但长于60分钟的时间未表现出显著的益处。
[0141] 所述方法一般可在环境温度下实施，但是还可在更高或更低的温度下进行，例如 4°C至37°C。实验数据显示，温度基本不改变所得结果，这将使蛋白质的稳定性要求成为选 择运行温度的决定因素。
[0142] 在某些实施方案中，将正电性有机添加剂溶解或分散于例如水或缓冲液中，并且 在将其添加至样品前调解pH。这是因为，某些正电性有机添加剂，尤其包括阳离子组合物， 是极度碱性的，并且具有以未预料到的方式大幅改变实验条件的可能性。
[0143] 在某些涉及使用超饱和酰脲和正电性有机添加剂二者的实施方案中，一般可有利 的是，通过在添加正电性有机添加剂之前将所述酰脲分散于细胞制剂中来起始可为有利 的，因为使用酰脲尿囊素的经验显示该实施可改进抗体回收率。在添加正电性有机添加剂 之前进行长时间孵育是不必要的；15分钟或更短即足够，尽管长时间孵育未表现出缺点。
[0144] 在某些实施方案中，期望选择有机调节剂和正电性有机添加剂以开始确定哪种组 合或运行条件将最适于具体的应用的方法。可通过以下知识来辅助所述选择：所述正电 性有机添加剂的特性至少部分的确定最适有机调节剂，或有机调节剂的工作浓度，和/或 反之亦然。在一般情况中，针对某些实施方案，正电性有机添加剂越疏水，则对具有强的弱 化疏水相互作用的能力的有机调节剂的要求越高，或者以更高的浓度使用较低疏水的调节 剂。这过于简单化，因为调节还涉及氢键，并且可预期到不同的正电性有机添加剂和不同的 有机调节剂具备疏水相互作用和氢键键合能力的不同平衡，但是这仅是举例说明该设想。 因此，在一些例子中，弱疏水的PEI可为优选的，因为其使用最小浓度的温和有机调节剂得 到良好的结果，但是由于其已知的细胞毒性以及难以以足够的灵敏度检测PEI来容易地验 证通过纯化方法的过程从蛋白质制剂中去除，所以PEI较低优选。在一些例子中，强疏水性 的依沙吖啶可为较低优选，因为其倾向于使与其相互作用的材料沉淀，但是，依沙吖啶可为 优选，因为其在血浆蛋白质分级领域中以及作为抗病毒剂的悠久历史。此外，其亮黄色和固 有荧光有助于在指定样品中灵敏地测量其含量，从而帮助证明在实施本方法后除去了依沙 吖啶。可通过适当浓度的合适有机调剂来弥补依沙吖啶的结合/沉淀倾向。氯己定的更高 疏水性将还需要更高程度的调节，但是该选择可因其在280nm处的强UV吸收而不被鼓励。
[0145] 存在多种选择用于监测通过所述方法实现的聚集物的解离或去除，无论是在研发 方法时还是在生产中。最简单的是在具有合适选择性的柱子上进行分析性体积排除色谱， 并在280nmUV波长处进行监测。这可揭示HMW(高分子量）聚集物，因为它们常常具备适度 符合非聚集产物的多种尺寸的流体动力学尺寸。异质聚集物通常被该方法所忽视，因为它 们的流体动力学尺寸可仅比非聚集产物的流体动力学尺寸高一点点。在这种情况下，可通 过计算254nm处的UV吸收度与280nm处的吸收度的比率来揭示聚集物的异质组合物，然后 将该值与被视为完全不含结合的污染物的经纯化的蛋白质的吸收度比率进行比较。将通过 升高的254/280比率来揭示包含例如DNA等的异质聚集物。如果色谱提供相应能力的话， 可同时在365nm处监测依沙吖啶含量。这可有助于证明通过后续的纯化方法来去除依沙吖 啶。还可使用多波长监测与其他色谱方法相结合。
[0146] 在某些实施方案中，可使本发明与在后续纯化之前去除样品中的正电性有机添加 剂和可能的其他组分的处理整合。这样的处理可包括使样品暴露于携带性质与正电性有机 添加剂的性质互补的化学部分的固体，以期它们使正电性有机添加剂从样品剩余物除去。
[0147] 在某些实施方案中，可使本发明与一种或多种纯化方法整合，所述纯化方法包括 蛋白A和其他形式的生物学亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水相互作用色 谱、固定化的金属亲和色谱、羟磷灰石或其他混合模式的色谱，和/或非色谱法，例如沉淀 和液体-液体萃取。处于本领域技术人员的视界范围内的是，开发适于所述多种方法的条 件，并且使其与本发明整合以达到特定抗体的必需纯化。
[0148] 在某些实施方案中，必须选择至少一种酰脲用于评价其在实施本发明中的用途。 尿酸是几乎不溶的，其优点是在去除未溶解的尿酸后，经处理的蛋白质制剂中几乎不存在 尿酸，但是溶解的尿囊素表现出调节正电性有机添加剂的效果，并且通常支持更高的抗体 回收率。对于正电性有机添加剂的选择，依沙吖啶提供了几个引人注意的特征，特别是其在 血浆蛋白分级领域以及作为抗病毒剂的悠久历史。其还插入DNA，并强结合至内毒素。此外， 其亮黄色和固有荧光有助于在指定样品中灵敏地测量其含量，从而帮助证明在实施本方法 后除去了依沙吖啶。
[0149] 在某些实施方案中，酰脲和正电性有机添加剂的期望浓度将受到其所用于处理的 蛋白制剂的组成的影响。对于澄清的细胞培养物上清，便利的起始点是1%尿素和0. 02% 依沙吖啶。这两者皆可实验性地改变，以微调提供期望结果的量。本发明在包含细胞的细 胞培养物收获物中的应用将很可能需要更大量的酰脲和正电性有机添加剂二者。实验数据 特别指示，在某些实施方案中，可需要更高量的尿囊素以达到过饱和，并且可需要更高量的 依沙吖啶以弥补细胞表面上损失的量。实验可有助于鉴定该二者的适当的有效量。在某些 实施方案中，本发明提供了有价值的益处，通过解离聚集物而非除去聚集物来提高抗体的 回收率，在非常高细胞密度的培养物产生大比例的聚集抗体的情况下尤其有益。这进而使 得能够从极度高产的细胞培养物中纯化蛋白质，其结果大幅改善了产量以及生产/纯化方 法的总体经济效益。本发明的另一个益处是，其大幅加速了细胞核碎肩的沉淀，有利于它们 的去除。
[0150] 来自差示扫描量热的数据指示，35mM(近饱和的）尿囊素对IgG具有降低IgG热转 变温度的效果，其量为用35mM尿素降低热转变温度的量的约一半。这指示，具有尿囊素的 蛋白质变性的风险是零。还指示，与仅用正电性有机添加剂实现的那些病毒失活水平相比， 尿囊素与正电性有机添加剂的组合可提高病毒失活水平，其中除了由未溶解的酰脲结合病 毒之外，还表现出发生这样的病毒失活。 实施例
[0151] 实施例1.用于减少HMW聚集物和解离异质聚集物的正电性有机添加剂的比较。通 过在200mM精氨酸、10mMEDTA、50mMMES、pH6. 5的缓冲液中进行体积排除色谱来分析包 含单克隆IgM的澄清的细胞培养物上清。所述材料包含11%HMW聚集物，并且IgM峰值表 现出0. 506的254/280比率，这指示存在大量异质聚集物。通过添加氯化钠将上清的电导 率提高至 20mS/cm。用 0? 01%、0. 05%和 0? 1% 的PEI-1200 ;0? 01%、0. 05%和 0? 1% 的依 沙吖啶；以及〇. 01 %、〇. 05%和0. 1 %的氯己定处理9个样品，孵育30分钟，然后通过SEC 分析（结果如下）。在分析前沉淀〇. 1%氯己定样品。将所述样品孵育30分钟，然后通过 SEC分析。仅依沙吖啶消除HMW聚集物。其还支持有效的异质聚集物解离。PEI在所有浓 度下都提供高于97%的回收率，并且异质聚集物解离良好，但是异质聚集物的减少不良。氯 己定大致在依沙吖啶与PEI之间。
[0152]

【权利要求】
1. 降低包含所需蛋白质的样品的聚集物含量的方法，所述方法包括使所述样品与正电 性有机添加剂和未溶解的酰脲接触。
2. 用于在15mS/cm或更高的电导率值下降低包含所需蛋白质的样品的聚集物含量的 方法，所述方法包括以〇. 1 %或更低浓度添加正电性有机添加剂。
3. 降低包含所需蛋白质的样品的聚集物含量的方法，所述样品具有5mS/cm或更高的 电导率值，所述方法包括在一种或多种有机添加剂的存在下以0. 1%或更低的浓度添加正 电性有机添加剂，以减少沉淀形成，其中所述一种或多种有机添加剂选自酰脲、有机溶剂或 表面活性剂。
4. 降低包含所需蛋白质的样品的聚集物含量的方法，所述方法包括提供包含聚集物的 样品，以及使所述样品与正电性有机添加剂接触，其中所述所需蛋白质溶解于所述样品中。
5. 如权利要求1和3所述的方法，其中所述酰脲是尿囊素。
6. 如权利要求1、3或5所述的方法，其中所述酰脲以约0. 5 %重量/体积至约2 %重量 /体积的范围存在。
7. 如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述正电性有机添加剂包含选自依沙 吖啶、氯己定、聚乙烯亚胺、亚甲蓝和苯扎氯铵中的一种
8. 如权利要求1、5或6中任一项所述的方法，其中在添加所述正电性有机添加剂之前 添加所述酰脲。
9. 如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中添加盐至基本防止所需蛋白质形成沉 淀的水平。
10. 如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述所需蛋白质包含选自抗体、因子 VIII、生长激素和重组蛋白质中的一种。
11. 如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中添加所述正电性有机添加剂至1% 重量/体积或更低重量/体积的水平。
12. 如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中添加所述正电性有机添加剂至 0. 1 %重量/体积或更低重量/体积的水平。
13. 如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中添加所述正电性有机添加剂至 〇. 01 %重量/体积或更低重量/体积的水平。
14. 如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中添加所述正电性有机添加剂至 0. 001 %重量/体积或更低重量/体积的水平。
15. 如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述正电性有机添加剂以0. 02%至 0.03%的浓度范围存在。
16. 如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中存在多种正电性有机添加剂。
17. 如权利要求16所述的方法，其中所述多种正电性有机添加剂的总浓度是1%重量 /体积或更低重量/体积。
18. 如权利要求16或17所述的方法，其中所述多种正电性有机添加剂的总浓度是 0. 1 %重量/体积或更低重量/体积。
19. 如权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述多种正电性有机添加剂的总浓 度是0. 01 %重量/体积或更低重量/体积。
20. 如权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述多种正电性有机添加剂的总浓 度是0. 001%重量/体积或更低重量/体积。
21. 如权利要求1所述的方法，其中所述未溶解的酰脲是尿囊素。
22. 如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中尿囊素以约0. 56%重量/体积至约 1 %重量/体积的浓度范围存在。
23. 如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中尿囊素以约1 %重量/体积至约2% 重量/体积的浓度范围存在。
24. 如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中尿囊素以约2 %重量/体积至约5% 重量/体积的浓度范围存在。
25. 如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中尿囊素以约5 %重量/体积至约10% 重量/体积的浓度范围存在。
26. 如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中尿囊素以约10 %重量/体积至约 15%重量/体积的浓度范围存在。
27. 如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中在添加所述正电性有机添加剂之前 向所述样品中添加酰脲。
28. 如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中将所述样品的电导率调节至足够高 的水平以抵消所述所需蛋白质因沉淀而造成的大量损失。
29. 如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中将所述样品的电导率调节至比抵消 所述所需蛋白质的大量损失所需水平更高的水平。
30. 如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中将所述样品的电导率调节为高至生 理学电导率的两倍。
31. 如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中将所述样品的电导率调节为高至生 理学电导率的三倍或更高。
32. 如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中降低所述样品的电导率，但保持足够 高以抵消所述所需蛋白质的大量损失。
33. 如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中在添加所述正电性有机添加剂之前 调节所述样品的电导率。
34. 如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中存在有机溶剂。
35. 如权利要求34所述的方法，其中所述有机溶剂包括选自乙醇、异丙醇、乙二醇、丙 二醇、三（正丁基）磷酸酯和甘油中的一种。
36. 如权利要求34或35所述的方法，其中所述有机溶剂包括约0. 01 %重量/体积至 约20 %重量/体积范围的浓度。
37. 如权利要求36所述的方法，其中所述有机溶剂包括约0. 01 %至约1 %浓度范围的 乙二醇、丙二醇、甘油、乙醇、异丙醇或三（正丁基）磷酸酯。
38. 如权利要求36所述的方法，其中所述有机溶剂包括约1%至约5%浓度范围的乙二 醇、丙二醇、甘油、乙醇或异丙醇。
39. 如权利要求36所述的方法，其中所述有机溶剂包括约5%至约10%浓度范围的乙 二醇、丙二醇、甘油、乙醇或异丙醇。
40. 如权利要求36所述的方法，其中所述有机溶剂包括约10%至约20%浓度的乙二 醇、丙二醇或甘油。
41. 如权利要求1至40中任一项所述的方法，其中存在有机溶剂，并且其包含选自乙 醇、异丙醇和三（正丁基）磷酸酯中的一种。
42. 如权利要求41所述的方法，其中所述有机溶剂浓度低于1 %。
43. 如权利要求41或42所述的方法，其中所述有机溶剂浓度低于0. 1 %。
44. 如权利要求41至43中任一项所述的方法，其中所述有机溶剂浓度低于0. 01 %。
45. 如权利要求1至44中任一项所述的方法，其中存在可溶酰脲。
46. 如权利要求45所述的方法，其中所述可溶酰脲是尿素。
47. 如权利要求45或46所述的方法，其中所述可溶酰脲以约0. 5M至约1M的浓度范围 存在。
48. 如权利要求45至47中任一项所述的方法，其中所述可溶酰脲以约1M至约2M的浓 度范围存在。
49. 如权利要求45至48中任一项所述方法，其中所述可溶酰脲以约2M至约4M的浓度 范围存在。
50. 如权利要求45至49中任一项所述的方法，其中所述可溶酰脲以约4M至约8M的浓 度范围存在。
51. 如权利要求1至50中任一项所述的方法，其中存在表面活性剂。
52. 如权利要求51所述的方法，其中所述表面活性剂包括非离子表面活性剂。
53. 如权利要求52所述的方法，其中所述表面活性剂包括选自吐温和Triton中的一 种。
54. 如权利要求51所述的方法，其中所述表面活性剂包括两性离子表面活性剂。
55. 如权利要求54所述的方法，其中所述两性离子表面活性剂包括选自CHAPS、CHAPSO 和十八烷基葡糖苷中的一种。
56. 如权利要求51至55中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂以低于1 %的非零 浓度存在。
57. 如权利要求51至56中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂以低于0. 1 %的非 零浓度存在。
58. 如权利要求51至57中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂以低于0. 01 %的 非零浓度存在。
59. 如权利要求1至58中任一项所述的方法，其中存在螯合剂。
60. 如权利要求59所述的方法，其中所述螯合剂带正电。
61. 如权利要求60所述的方法，其中所述带正电的螯合剂包括三（2-氨基乙基）胺或 去铁胺。
62. 如权利要求59至61中任一项所述的方法，其中所述螯合剂以低于lOOmM的非零浓 度存在。
63. 如权利要求59至62中任一项所述的方法，其中所述螯合剂以低于50mM的非零浓 度存在。
64. 如权利要求59至63中任一项所述的方法，其中所述螯合剂以低于20mM的非零浓 度存在。
65. 如权利要求59至64中任一项所述的方法，其中所述螯合剂以低于10mM的非零浓 度存在。
66. 如权利要求59至65中任一项所述的方法，其中所述螯合剂以低于5mM的非零浓度 存在。
67. 如权利要求1至66中任一项所述的方法，其中存在以下物质中的多种：(a)有机溶 剂，（b)有机聚合物，（c)可溶酰脲，（d)表面活性剂，（e)螯合剂和（f)盐。
68. 如权利要求1至67中任一项所述的方法，其中所述被接触的样品暴露于一种或多 种固体，以在随后的使所述所需蛋白质与残余的污染物分离的处理步骤之前除去至少一种 正电性有机添加剂。
69. 用于实施权利要求1至68中任一项所述方法的试剂盒。
【文档编号】C07K1/14GK104507953SQ201380040495
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年2月6日 优先权日:2012年5月31日
【发明者】彼得·加尼翁 申请人:新加坡科技研究局