野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的糖基化方法
【专利摘要】本发明涉及野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的糖基化方法。采用的技术方案是：用定点突变技术构建cC的I108T突变体；利用pPICZαA载体构建糖基化cC的表达系统；糖基化cC在毕赤酵母中的表达；糖基化cC的分离纯化。本发明探究了糖基化cC的最适发酵条件的方法是：设计不同发酵条件，分别对I108T菌株进行25℃和30℃培养，诱导表达培养基YPM分别做pH4、pH5、pH7、添加0.1mM/LPMSF、添加1%酪蛋白水解物处理。本发明验证了糖基化cC对于淀粉样沉积具有明显抑制作用，N端糖基化可阻止cC形成淀粉样纤维而不影响其本身抑制活性，可以更好地用来研究淀粉样蛋白沉积疾病。
【专利说明】野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的糖基化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂(chicken cystetine, cC)的糖基化方法及表达糖基化cC最适发酵条件的探究，涉及基因工程、分子生物学、微生物学领域。
【背景技术】
[0002]蛋白质糖基化是蛋白质翻译后的一种重要的加工过程，它是指蛋白质与葡萄糖(醛基糖)之间发生的非酶反应而生成糖化蛋白的过程，即指在肽链生物合成的同时或合成后在酶的催化下糖链被接到肽链上的特定糖基化位点的过程。糖基化是真核细胞中常见和复杂的翻译后修饰方式之一，具有重要的生物学意义。
[0003]糖复合物中糖链的功能多种多样，如从空间上调节糖复合物的整体结构、保护多肽链不被蛋白酶水解、防止与抗体识别等。糖链的存在对肽链的折叠、糖蛋白质的进一步成熟、分拣、投送、以及最后的定位都有重要影响。糖蛋白的糖链能修饰并改变蛋白的内在特性，对糖蛋白整体生物学功能的体现至关重要。 [0004]鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂(chicken cystatin , cC)是由116个氨基酸组成的非糖基化蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，cC含有两个二硫键，分子量约为14kDa，是一种分泌性蛋白。由于与人cystatin C (人类血液、精液及唾液中含有大量的此抑制剂)相似，同属于cystatin超家族II。因此常用cC来代替人cystatin C来研究淀粉样蛋白沉积疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、II型糖尿病、疯牛病和亨廷顿病等。蛋白质沉积疾病很大一部分具有高度的致死性，它们共同的特征是蛋白质纤维化聚合物成为细胞内含物或细胞外的淀粉样物质。
[0005]生物体内存在某些因素控制着蛋白质的糖基化，包括:(I)蛋白质的氨基酸序列决定着潜在糖基化位点的分布和数目；(2)在糖蛋白的生物合成过程中，糖蛋白的折叠方式，即蛋白质的三维空间结构，影响糖基转移酶与蛋白表面特定序列的接触，从而引起糖链的延伸和添加糖基的不同；(3)合成糖蛋白细胞中糖基转移酶及相关酶类的表达类型；(4)细胞中不同糖链加工区域的排列，以及糖链通过这些区域的速率。前两点只影响糖基化的位点，后两点则可归结为表达系统中细胞的类型和培养条件等因素影响，从而决定糖基化所形成的糖链结构。其中，细胞的类型也是决定糖基化程度和形式的主要因素。
[0006]毕赤酵母作为一种成功的外源基因表达系统，其应用越来越广泛。毕赤酵母表达体系表达出的野生型cC是非糖基化蛋白，因此如何对野生型cC进行糖基化，而且使糖基化cC的表达量最大化是本领域技术人员不断探索的课题。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂(chicken cystatin,cC)的糖基化方法，及能够使糖基化cC的表达量最大化的发酵条件。
[0008]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的糖基化方法，其步骤如下:1)用定点突变技术构建野生型CC的I108T突变体:通过PCR的方法在野生型CC的cDNA的两端添加通ο /和油<3 /的切割位点序列；用定点突变技术对两端添加ZAo I和油<3 I切割位点序列的野生型cC的cDNA进行定向诱变，使野生型cC氨基酸序列的Asnl06-1lel08突变为Asnl06_Thrl08，得到野生型cC的I108T突变体；
2)利用pPICZaA载体构建重组质粒:利用限制性内切酶通ο /和油a I同时处理野生型cC的I108T突变体与pPICZaA质粒载体，通过T4 DNA连接酶将野生型cC的I108T突变体基因连接到载体上，获得含有糖基化cC目的基因的重组质粒；
3)糖基化cC在毕赤酵母中的表达:将含有糖基化cC目的基因的重组质粒用Jkt//线性化后，通过电转法将其转化到毕赤酵母X-33中，选取已经成功转化的菌落，在YPD培养基(1%酵母浸粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖)中活化，25 1:或30 °C, 250 rpm摇床培养，12h后，再以1%的比例接入新的YPD培养基中25 1:或30 °C、250rpm培养24h，得菌液，将菌液5000 Xg离心5 min，弃上清；将菌体转入YPM诱导表达培养基中，30 °C, 250rpm诱导培养，并于诱导表达起始后，每隔24 h以1%的比例补加甲醇溶液，诱导表达3天，得到菌液；
4)糖基化cC的分离纯化:诱导表达后的菌液，首先3000Xg，4°C，离心lOmin，除去菌体留上清液，再11900 X g，4°C，离心40min，除去不溶性蛋白聚集体，所剩上清液经LabScalTFF System浓缩；然后用20mM，pH5.0的醋酸缓冲液将浓缩液稀释到5倍体积后，样品通过CM-Toyopearl离子交换柱，用醋酸缓冲液溶解的0.1M_0.5M的NaCl进行梯度洗脱，与紫外检测仪连接，洗脱峰下的溶液即含有糖基化的cC，再将收集的混合液经过夜透析除盐，得到糖基化的野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
[0009]上述的野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的糖基化方法，步骤3)中，所述的YPM诱导表达培养基的组成是:包括1%酵母浸粉和2%蛋白胨，初始pH为4-7。进一步的，所述的YPM诱导表达培养基中含有0.1mM/L PMSF (苯甲基磺酰氟)或1%酪蛋白。
[0010]不同发酵条件对I108T菌株分泌糖蛋白量的影响主要有以下三个方面:
(1)诱导表达期不同培养基初始pH对I108T菌株糖蛋白表达量的影响:毕赤酵母能忍耐较宽的pH范围(pH 3.0~7.0)，而蛋白酶都有其特定的最适PH范围，因此可调节溶液PH值抑制蛋白水解酶活性，防止目的蛋白降解。
[0011](2)诱导表达期不同温度对I108T菌株糖蛋白表达量的影响:温度较高时毕赤酵母代谢比较旺盛，最适温度约为30°C，但某些蛋白酶此时活性也较强。因此通过尝试对甲醇诱导表达时期温度的控制来调节糖蛋白表达量。
[0012](3)额外添加培养基组分对I108T菌株糖蛋白表达量的影响:一些额外添加物可以抑制酵母自身产生的蛋白酶对糖蛋白的水解作用，如蛋白酶抑制剂PMSF和添加竞争性底物酪蛋白水解物。PMSF作为抑制剂，可以抑制蛋白酶对表达蛋白的水解；适量的酪蛋白水解物可以作为竞争性底物抑制蛋白酶对目的蛋白的水解作用。
[0013]通过进一步对cC 108T菌株所表达蛋白的研究，本发明进行了不同温度、PH、添加酪蛋白水解物、蛋白酶抑制剂对糖蛋白表达量的影响研究。结果得出上述的野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的糖基化方法，步骤3)糖基化cC在毕赤酵母中的表达，最优方案是:将含有糖基化cC目的基因的重组质粒用Jkt//线性化后，通过电转法将其转化到毕赤酵母X-33中，选取已经成功转化的菌落，在YH)培养基中活化，30 °C, 250 rpm摇床培养，12h后，再以1%的比例接入新的YB)培养基中30 1:、250印111培养2411，得菌液，将菌液5000\ g离心5 min，弃上清；将菌体转入YPM诱导表达培养基中，30 °C, 250rpm培养，并于诱导表达起始后，每隔24 h以1%的比例补加甲醇溶液，诱导表达3天，得到菌液。所述的YPM诱导表达培养基的组成是:包括1%酵母浸粉和2%蛋白胨，初始pH为7，添加0.1mM/L PMSF或1%酪蛋白水解物。
[0014]本发明的有益效果是:本发明通过定点突变技术构建了野生型cC的I108T突变体。使野生型cC进行定向诱变(Asnl06-1lel08 — Asnl06-Thrl08)，使之具有了能进行N-糖基化的一致性序列Asn-Xaa-Thr / Ser (Xaa代表任何氨基酸)。并利用pGAPZaA表达质粒构建重组cC的毕赤酵母表达体系，从而获得体外分泌表达的糖基化重组cC。经进一步研究表明，由定点基因突变技术而带有糖链的cC蛋白的糖链对于淀粉样沉积具有抑制作用，通过106位N端糖基化来抑制经3D结构域交换形成而形成的淀粉样cC 二聚体和寡聚体的生成，也即通过106位N端糖基化来阻止淀粉样cC形成淀粉样纤维而不影响其本身抑制活性。进一步研究表明在毕赤酵母表达系统中对野生型cC进行定点糖基化能够提高其抗病毒活性。同时，在Asnl06位的N-糖基化能够大大地改善重组cC的冰冻稳定性。此外，其热稳定性和pH稳定性以及敏感性也增强。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是糖基化cC毕赤酵母表达系统的构建不意图。
[0016]图2是SDS-PAGE检测毕赤酵母中表达的野生型cC和糖基化cC。
[0017]图3a是蛋白样品的SDS-PAGE图；
图3a中，T是cC的I108T突变菌株表达的未糖基化cC ；GT是cC的I108T突变菌株表达的糖基化cC ；ff是野生型cC ；BSA是0.1%的牛血清白蛋白。
[0018]图3b是与图3a对应的底物活性SDS-PAGE图；
图3b中，T是cC的I108T突变菌株表达的未糖基化cC ；GT是cC的I108T突变菌株表达的糖基化cC ；ff是野生型cC ；BSA是0.1%的牛血清白蛋白。
[0019]图4a是培养温度为25°C时，不同条件下对糖基化cC表达量的影响。
[0020]图4b是培养温度为30°C时，不同条件下对糖基化cC表达量的影响。
【具体实施方式】
[0021]实施例1 I108T菌株表达糖蛋白最适发酵条件的探究 1.应用定点突变技术构建野生型cC的I108T突变体
首先，将含有鸡cystatin cDNA的pT7 blue T载体(日本山口大学农学部加藤昭夫教授赠予)用包含通ο /和油<3 /切割位点序列的PCR引物扩增，在野生型cC的cDNA的两端添加通ο /和油a I的切割位点序列，获得野生型cC的cDNA，其氨基酸序列如SCQ NOl所示:
正义引物 5’ 一GGGCTCGAGAAAAGAAGCGAGGA— 3’
反义引物 5’ 一GGGTCTAGATTACTGGCACTTGCT— 3’
其次，用定点突变技术对野生型cC的cDNA进行定向诱变，使野生型cC氨基酸序列的Asnl06-1lel08突变为Asnl06_Thrl08，使之具有能进行N-糖基化的一致性序列Asn-Xaa-Thr / Ser (Xaa代表任何氨基酸)，获得cC的I108T突变体。[0022]2.利用pPICZ α A载体构建重组质粒pPICZ a A_cC (1108T突变体)
利用限制性内切酶沿ο /和油a /同时处理野生型cC的I108T突变体与pPICZaA质粒载体，通过T4 DNA连接酶将野生型cC的I108T突变体基因连接到载体上，获得含有糖基化cC目的基因的重组质粒pPICZaA-cC(I108T突变体)。如图1是重组质粒--102 0么-(^(11081'突变体)构建示意图。
[0023]3.糖基化cC在毕赤酵母中的表达
3.1设计不同YPM诱导表达培养基
YPM诱导表达培养基共分六种，以1%酵母浸粉和2%蛋白胨为基准，分别为:①空白对照(初始PH6);②调节初始pH4 ;③调节初始pH5 ;④调节初始pH7 ;⑤调节初始PH为7，添加
0.1mM/L PMSF ;⑥调节初始PH为7，添加1%酪蛋白水解物。
[0024]酪蛋白水解物的制备:称取Ig酪蛋白与0.04g胰蛋白酶(1:250)于三角瓶中，加入20ml蒸馏水，搅拌混匀并调节pH至7.5。置于55°C恒温水浴锅中进行水浴，并不断加入NAOH保持pH值在7.5。水浴2h后取出三角瓶马上放入沸水中煮5min结束蛋白水解，得酪蛋白水解物。
[0025]3.2诱导表达 将上述重组质粒pGAPZ a A-cC(I108T突变体)用Jkt //线性化后，通过电转法将其转化到毕赤酵母X-33中。选取已经成功转化的菌落，在5ml YPD培养基(1%酵母浸粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖)中活化，25°C或30 °C, 250 rpm摇床培养，12h后，再以1%的比例将0.25ml菌体转接至25 ml YPD液体培养基中，25°C或30 °C, 250 rpm进行次级培养，培养24 h，得到菌液。
[0026]将培养物5000 X g离心5 min,弃上清。将菌体分别转入6种YPM诱导表达培养基中，25°C或30 °C,250rpm诱导培养，并于诱导表达起始后，每隔24 h以1%的比例(体积t匕)补加甲醇溶液诱导表达。诱导表达完毕后(3天)，得到菌液。
[0027]4.糖基化cC粗提及SDS-PAGE检测表达量
将得到的菌液，首先3000Xg，4°C，离心lOmin，除去菌体留上清液，上清液用45%饱和度的硫酸铵进行盐析，3 h静置后，11900Xg离心30 min，取离心上清液，用60%饱和度的硫酸铵进行盐析。
[0028]将上述处理后的样品于4°C，8000rpm离心15min，吸取ΙΟΟμ L离心后上清液并于ρΗ6.8、含10%SDS、5%巯基乙醇、0.5%溴酚蓝的Tris-glycine缓冲液混合，于100°C沸水中加热5min处理样品。采用12%的分离胶和4%的浓缩胶。在0.02A恒流条件下进行电泳。电泳后得到的胶在卡马斯亮蓝中进行染色。结果如图4a和图4b所示。
[0029]图4a和4b中，分别为25 1:和30 °C培养I108T突变体菌株，YPM培养基分别做以下六种处理:空白对照(约pH6)、pH4、pH5、pH7、添加0.1mM/L PMSF、添加1%酪蛋白水解物，M是Marker为10mg/ml溶菌酶，得到的SDS-PAGE电泳图。底部条带为不带糖链的单体蛋白，中间部分的模糊区为带有糖链的单体蛋白，由于所带糖链分子大小不一，在电泳中无明显条带，显示出模糊区域。
[0030]由图4a中可以看出，在培养温度25°C时，糖基化cC表达量由大到小的顺序为添加1%酪蛋白水解物、pH7、pH4、添加0.1mM/L PMSF、pH4、空白、pH5。25°C时最适表达条件为添加1%酪蛋白水解物，YPM培养基为pH7。[0031]由图4b中可以看出，在培养温度30°C时，糖基化cC表达量由大到小的顺序为添加1%酪蛋白水解物、添加0.1mM/L PMSF、pH7、空白、pH5、pH4。30°C时最适表达条件为添加1%酪蛋白水解物、添加0.1mM/L PMSF, YPM培养基为pH7。
[0032]比较图4a和4b，可以看出培养温度30°C时糖基化cC的表达量大于培养温度为25°C 时。
[0033]综上所述:
I)温度:30°C培养比25°C培养糖基化cC表达量大。
[0034]2) pH:pH4培养时蛋白表达量明显减少，pH7培养时蛋白表达量增多。
[0035]3)添加物:添加酪蛋白和添加PMSF都会使糖蛋白表达量明显增多。
[0036]因此，最优诱导发酵条件是:在30°C，YPM诱导表达培养基初始pH7，添加1%酪蛋白或者0.1mM/L PMSF的条件下进行培养，能使糖基化cC的表达量最大化。
[0037]实施例2 糖基化鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cC)的获得
1.应用定点突变技术构建cC的I108T突变体
首先，将含有鸡cystatin cDNA的pT7 blue T载体(日本山口大学农学部加藤昭夫教授赠予)用包含通ο / 和油<3 /切割位点序列的PCR引物扩增，在野生型cC的cDNA的两端添加通ο /和油a I的切割位点序列，获得野生型cC的cDNA，其氨基酸序列如SCQ NOl所示:
正义引物 5’ 一GGGCTCGAGAAAAGAAGCGAGGA— 3’
反义引物 5’ 一GGGTCTAGATTACTGGCACTTGCT— 3’
其次，用定点突变技术对野生型cC的cDNA进行定向诱变，使野生型cC氨基酸序列的Asnl06-1lel08突变为Asnl06_Thrl08，使之具有能进行N-糖基化的一致性序列Asn-Xaa-Thr / Ser (Xaa代表任何氨基酸)，获得cC的I108T突变体。
[0038]2.利用pPICZ a A载体构建重组质粒pPICZ a A_cC (1108T突变体)
利用限制性内切酶通ο /和油a /同时处理野生型cC的I108T突变体与pPICZaA质粒载体，通过T4 DNA连接酶将目的基因连接到载体上，获得含有糖基化cC目的基因的重组质粒pPICZ a Α-cC (1108T突变体)。如图1是重组质粒pPICZ a A_cC (1108T突变体)构建示意图。
[0039]3.糖基化cC在毕赤酵母中的表达
将上述重组质粒pGAPZ a A-cC(I108T突变体)用Jkt //线性化后，通过电转法将其转化到毕赤酵母X-33中。选取已经成功转化的菌落，在5ml YPD培养基(1%酵母浸粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖)中活化，30 °C, 250 rpm摇床培养，12h后，再以1%的比例将0.25 ml菌体转接至25 ml YPD液体培养基中，30 °C, 250 rpm，进行次级培养，培养24 h，得到菌液。
[0040]将培养物5000 X g离心5 min，弃上清。将菌体转入YPM诱导表达培养基(1%酵母浸粉，2%蛋白胨，初始pH7，添加1%酪蛋白水解物)中，30 °C,250rpm培养，并于诱导表达起始后，每隔24 h以1%的比例补加甲醇溶液诱导表达。诱导表达完毕后(3天)，得到菌液。
[0041]4.糖基化cC的分离纯化
诱导表达后的菌液，首先3 O O O X g，4 °C，I Om i η离心除去菌体留上清液，将上清液1900\8,4<€离心40111；[11除去不溶性蛋白聚集体,然后经LabScal TFF Systerm浓缩至体积为50-100ml，用20mM，pH5.0的醋酸缓冲液将其稀释到5倍体积。样品通过CM-Toyopearl离子交换柱，用醋酸缓冲液溶解的0.1M-0.5M的NaCl进行梯度洗脱。与紫外检测仪连接，洗脱峰下的溶液即含有糖基化的cCs，再将收集的混合液经过夜透析除盐。将洗脱后的产品做SDS-PAGE电泳图，如图2所示。
[0042]图2中，M是Marker，1-4道是在洗脱峰下收集的野生型cC，5-9道是在洗脱峰下收集的糖基化cC。从图2中可看出，1-4道是分离纯化的野生型cCs，分子量约为14KDa。4-9道表明I108T突变体菌株成功表达了糖基化cCs，由于糖基化的数量和大小不同，因此在图上不同出现比较宽的条带。
[0043]5.糖基化cC抑制活性的检测
测糖基化cC抑制活性可用Substrate SDS-PAGE。我们采用15%的分离胶和4%的浓缩胶含有1%的SDS’在0.02A恒流条件下进行电泳。15%分离胶中加入0.l%(w/v)的酪蛋白来进行活性测定。上样量为每孔0.5 μ g蛋白。电泳后的凝胶先用2.5%的TritonX-1OO至少洗两次(每次30min)来去除SDS，然后在含有2mM半胱氨酸、ImM EDTA和0.01mg/ml木瓜蛋白酶的磷酸缓冲液(0.1OM,pH为6.0)中40°C温浴2.5h。染色液(0.01%考马斯亮蓝，40%甲醇，10%醋酸)染色测糖基化cC活性。经脱色液(25%甲醇和10%醋酸)后，在澄清背景的胶上可看到的深蓝色条带即糖基化cC活性带。如图3a和3b所示。
[0044]图3a和3b中，T是cC的I108T突变菌株表达的未糖基化cC ；GT是cC的I108T突变菌株表达的糖基化cC ；ff是野生型cC ；BSA是0.1%的牛血清白蛋白。
[0045]由图3b可以看出，W道较图3a基本无颜色，表示酪蛋白基本全部被木瓜蛋白酶降解，即野生型cC由于易形成二聚体而失去抑制活性；GT道相比图3a颜色明显加深，表示酪蛋白基本没有被木瓜蛋白酶水解，即糖基化cC对于淀粉样沉积具有明显抑制作用，N端糖基化可阻止cC形成淀粉样纤维而不影响其本身抑制活性。
[0046]实施例3 糖基化鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cC)的获得
方法同实施例2，不同点在于:步骤3糖基化cC在毕赤酵母中的表达中，所述的YPM诱导表达培养基的组成是:1%酵母浸粉，2%蛋白胨，初始pH7，添加0.1mM/L PMSF。
[0047]经上述最优条件诱导表达后经分离纯化，将洗脱的产品做SDS-PAGE，进一步确认大量收集并精致了重组糖基化cC。
[0048]通过糖基化cC抑制活性的检测，糖基化cC对于淀粉样沉积具有明显抑制作用，N端糖基化可阻止cC形成淀粉样纤维而不影响其本身抑制活性。
【权利要求】
1.野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的糖基化方法，其特征在于步骤如下: 1)用定点突变技术构建野生型CC的I108T突变体:通过PCR的方法获得在野生型CC的cDNA的两端添加通ο /和油a /切割位点的序列；用定点突变技术对野生型cC的cDNA进行定向诱变，使野生型cC氨基酸序列的Asnl06-1lel08突变为Asnl06-Thrl08，得到野生型cC的I108T突变体； 2)利用pPICZaA载体构建重组质粒:利用限制性内切酶通ο /和油a /同时处理野生型cC的I108T突变体与pPICZaA质粒载体，通过T4 DNA连接酶将野生型cC的I108T突变体基因连接到载体上，获得含有糖基化cC目的基因的重组质粒； 3)糖基化cC在毕赤酵母中的表达:将含有糖基化cC目的基因的重组质粒用Jkt//线性化后，通过电转法将其转化到毕赤酵母X-33中，选取已经成功转化的菌落，在YPD培养基中活化，25 1:或30 0C, 250 rpm摇床培养，12h后，再以1%的比例接入新的YB)培养基中25 1:或30 °C、250rpm培养24h，得菌液，将菌液5000X g离心5 min，弃上清；将菌体转入YPM诱导表达培养基中，30 0C, 250rpm诱导培养，并于诱导表达起始后，每隔24 h以1%的比例补加甲醇溶液，诱导表达3天，得到菌液； 4)糖基化cC的分离纯化:诱导表达后的菌液，首先3000Xg，4°C，离心lOmin，除去菌体留上清液，再11900 X g，4°C，离心40min，除去不溶性蛋白聚集体，所剩上清液经LabScalTFF System浓缩；然后用20mM，pH5.0的醋酸缓冲液将浓缩液稀释到5倍体积后，样品通过CM-Toyopearl离子交换柱，用醋酸缓冲液溶解的0.1M_0.5M的NaCl进行梯度洗脱，与紫外检测仪连接，洗脱峰下的溶液即含有糖基化的cC，再将收集的混合液经过夜透析除盐，得到糖基化的野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
2.如权利要求1所述的野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的糖基化方法，其特征在于:步骤3)中，所述的YPM诱导表达培养基的组成是:包括1%酵母浸粉和2%蛋白胨，初始pH为 4-7。
3.如权利要求2所述的野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的糖基化方法，其特征在于:所述的YPM诱导表达培养基中含有0.1mM/L PMSF或1%酪蛋白。
4.如权利要求3所述的野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的糖基化方法，其特征在于:所述的YPM诱导表达培养基初始pH为7。
5.如权利要求4所述的野生型鸡半胱氨酸蛋白酶抑制剂的糖基化方法，其特征在于:步骤3)中，将含有糖基化cC目的基因的重组质粒用Jkt //线性化后，通过电转法将其转化到毕赤酵母X-33中，选取已经成功转化的菌落，在YH)培养基中活化，30 °C, 250 rpm摇床培养，12h后，再以1%的比例接入新的YPD培养基中30 °C、250rpm培养24h，得菌液，将菌液5000X g离心5 min，弃上清 ；将菌体转入YPM诱导表达培养基中，30 °C，250rpm诱导培养，并于诱导表达起始后，每隔24 h以1%的比例补加甲醇溶液，诱导表达3天，得到菌液。
【文档编号】C07K14/81GK103804492SQ201410066987
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月26日 优先权日:2014年2月26日
【发明者】何剑为, 宋有涛, 王禹, 王娜, 种晓颖, 张博崴, 周倩 申请人:辽宁大学