一种非洲黄爪蝎抗菌肽基因、抗菌肽Os_116、其结构同源抗菌肽、制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明具体涉及一种非洲黄爪蝎抗菌肽基因、抗菌肽Os_116、其结构同源抗菌肽、制备方法及应用。本发明筛选获得一种新的非洲黄爪蝎抗菌肽基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示，由该基因编码的非洲黄爪蝎抗菌肽的氨基酸序列如序列表SEQIDNO：2所示。本发明还提供了人工合成的非洲黄爪蝎抗菌肽Os_116及其结构同源抗菌肽，其氨基酸序列如SEQIDNO：3~5所示，所述抗菌肽Os_116及其结构同源抗菌肽对多重耐药性病原菌和革兰氏细菌具有较强的抗菌活性，其分子量小且具有广谱抗菌机制作用，和传统抗生素相比大大降低了耐药机率，且在低浓度下对人的正常细胞毒性小，是抗生素的最佳替代物。
【专利说明】一种非洲黄爪蝎抗菌肽基因、抗菌肽Os_116、其结构同源抗菌肽、制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域，具体涉及一种非洲黄爪蝎抗菌肽基因、抗菌肽0s_116、其结构同源抗菌肽、制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ipwthici 11 in-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)是指对异唑青霉素(如甲氧西林、苯唑西林和氟氯西林)耐药的金黄色葡萄球菌株，目前也被称为超级细菌。自1961年，MRSA在英国首次发现后，其分离率逐年增加；1985年开始爆发流行，已成为医院感染的重要致病菌之一。MRSA多重耐药现象日益严重，部分地区已经出现对万古霉素耐药、中介耐药以及异质性耐药MRSA细菌。MRSA引起的感染耐药高、死亡率高因而成为威胁全球公共卫生安全的严重问题。MRSA流行的分布，根据地域的不同而存在很大的差异，到20世纪80年代后期，MRSA就已成为全球发生率最高的医院内感染病原菌之一。全球约有超过16亿人携带葡萄球菌，保守估计携带MRSA的人群大约在200- 8500万。MRSA感染率逐年上升，2009年，中国CHINET细菌耐药性监测中，得到金葡菌中甲氧西林耐药株MRSA平均为52.17%。在2004年，美国ICU病房，MRSA的分离率达到了 66.17%。在1995年至2003年加拿大医院MRSA的发生率增长了 10倍。欧洲最近的一项抗生素耐药检测指出，在2000~2008年，马耳他MRSA引起的菌血症，已经居欧洲之首，2006年最高达到了 66%。在地中海地区很多国家，MRSA的感染也已经很严重。
[0003]随着万古霉素临床应用的增多，万古霉素耐药肠球菌(yancomycin resis tan tenterococcus, VRE)不断出现。自1988年首次分离得到第一株VRE以来,糖肽类抗生素耐药肠球菌的数量不断增多 ，并且VRE具有将万古霉素耐药性传递到金黄色葡萄球菌的危险。目前还没有发现十分有效的治疗VRE的药物，一般原则是检测病原菌的敏感性，根据药敏结果来选择合适的抗感染药物。研究还表明，VRE存在多种基因型，VRE基因型不同对糖肽类抗生素的耐药性不同。由于肠球菌对几种常用的抗生素天然耐药，而且它们能够通过变异或通过质粒或转座子转移来的外来基因获得更多的耐药性，VRE往往对抗生素多重耐药，这给临床治疗带来更多的困难。目前VRE在美国已成为致死率高达36%的院内感染病原菌，美国医院感染监视系统(NISS)已将其列为引起医院感染的第二位的病原菌，引起了人们的极大关注。有证据表明，VRE的耐药基因可轻易地传递至肠球菌外的其它细菌(如金黄色葡萄球菌)，这对将来的抗感染治疗带来了极大的威胁。
[0004]藤黄微球菌CliicrococciAs Iuteus)为专性需氧革兰氏阳性细菌,广泛分布于空气、水、土壤中，也见于人与动物皮肤、咽部、眼睛等部位，是人和动物的条件致病菌，能引起人的脑膜炎、肺炎、败血症、脓毒性关节炎。近年来在抗生素选择压力下，条件致病菌日益增多，并且有继续增高的趋势，因此对藤黄微球菌应引起高度的重视。
[0005]蝎子是我国的一种传统名贵中药材料，具有抗肿瘤、杀虫、抑菌和抗菌功效，其作用主要来源蝎尾毒腺分泌的毒液。从多种蝎毒中鉴定了一类小分子抗菌活性肽，是一类由宿主生成在天然免疫中特异性发挥防御性作用的一类小分子多肽，通常由10-50个氨基酸构成，静电荷从+2到+9等。这样的抗菌肽在大多数生物的天然防御方面具有重要的功能，用于抵御革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、原虫及病毒感染。研究表明阳离子抗菌肽可选择性作用于细胞外膜或信号通路中不同的靶标。与传统抗生素相比较，这可能是细菌对阳离子抗菌肽更难产生抗性的原因。另有一些研究表明抗菌肽不仅具有抗菌活性，而且还作为信号分子参与免疫反应调节(尤其是感染和炎症)。阳离子抗菌肽具有分子量小、广谱抗菌活性及不易产生耐药性等特点，因此可以作为潜在的、理想的抗生素替代药物。
【发明内容】
[0006]本发明的一个目的在于提供一种非洲黄爪蝎抗菌肽基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1 所示。
[0007]本发明的另一个目的在于提供一种由上述非洲黄爪蝎抗菌肽基因编码的非洲黄爪蝎抗菌肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID Ν0:2所示。
[0008]本发明的再一个目的在于提供一种人工合成的非洲黄爪蝎抗菌肽0s_116，它是将上述非洲黄爪蝎抗菌肽基因编码的非洲黄爪蝎抗菌肽去除信号肽和前体肽后得到的，其氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:3所不。
[0009]本发明的四个目的在于提供上述人工合成的非洲黄爪蝎抗菌肽0s_116的结构同源抗菌肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:4~5所示。
[0010]本发明的第五个目的在于提供上述非洲黄爪蝎抗菌肽0s_116及其结构同源抗菌肽的人工合成方法。
[0011]本发明的第六个目 的在于提供上述非洲黄爪蝎抗菌肽0s_l 16及其结构同源抗菌肽在制备治疗或预防多重耐药性病原菌和革兰氏细菌的药物中的应用，所述多重耐药性病原菌为MRSA和VRE。
[0012]为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为:
一种非洲黄爪蝎抗菌肽基因，其特征在于，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。
[0013]按上述方案,所述非洲黄爪蝎抗菌肽基因是首次从非洲黄爪蝎iOpistophthalmus
毒腺中分离得到的，具体通过如下步骤获得:(1)首先提取非洲黄爪蝎毒腺mRNA,通过反转录和PCR扩增得到大小不一的双链cDNA，再将双链cDNA与载体连接并转化后，构建得到cDNA文库；(2)采用PCR策略从上述cDNA文库中筛选PCR产物为300_600bp大小的克隆子，进行测序并与已知抗菌肽序列比对其同源性，经过同源性比对发现了一种非洲黄爪蝎抗菌肽基因和已有报道的Meucin-18、BmKb2、BmKbl和BmKbP等抗菌肽基因的同源性分别为44.9%,30.8%,29.5%和29.5%，结果表明，该筛选得到的非洲黄爪蝎抗菌肽基因是一个新抗菌肽基因。
[0014]由上述黄爪蝎抗菌 肽基因编码的非洲黄爪蝎抗菌肽，其特征在于，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。所述非洲黄爪蝎抗菌肽由76个氨基酸残基组成，包括三部分:22个氨基酸残基长的信号肽， 19个氨基酸残基长的成熟肽，以及35个氨基酸残基长的前体肽(见图1)。[0015]人工合成的非洲黄爪蝎抗菌肽0s_116，其特征在于，它是将上述非洲黄爪蝎抗菌肽基因编码的非洲黄爪蝎抗菌肽去除信号肽和前体肽后得到的，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:3 所示。
[0016]按上述方案,对所述非洲黄爪蝎抗菌肽0s_116通过NPSA server和HeliQuest软件结构预测，发现该非洲黄爪蝎抗菌肽0s_116具有以下抗菌肽的结构特征:a -螺旋并有疏水和未水面(结构特征不意图见图2)。
[0017]人工合成的非洲黄爪蝎抗菌肽0s_116的结构同源抗菌肽，其特征在于，它是基于非洲黄爪蝎抗菌肽0s_116的氨基酸序列进行点突变后得到的，其氨基酸序列如序列表SEQID NO:4~5所示。
[0018]按上述方案，所述的点突变需遵循以下原则:1、在保持现有非洲黄爪蝎抗菌肽0s_116的α-螺旋结构的前提下，尽量使突变后的抗菌肽两亲性更加明显，即使其疏水面更疏水、亲水面亲水性更强；2、增强亲水面的静电荷数量，提高其对磷脂膜的静电吸引作用；3、去掉对形成α-螺旋结构有破坏作用的氨基酸。将突变后得到的氨基酸序列如序列表SEQ ID Ν0:4所示的结构同源抗菌肽命名为抗菌肽0s_116Ml，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示的结构同源抗菌肽命名为抗菌肽0s_116M2，抗菌肽0s_116Ml和抗菌肽0s_116M2的结构特征示意图见图3和图4。
[0019]上述非洲黄爪蝎抗菌肽0s_l 16及其结构同源抗菌肽的人工合成方法，其特征在于:分别根据序列表SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，采用固相化学法合成多肽序列，并对合成的多肽进行C端酰胺化，然后通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化得到非洲黄爪蝎抗菌肽0s_116及其结构同源抗菌肽。
[0020]上述非洲黄爪蝎 抗菌肽0s_116及其结构同源抗菌肽在制备治疗或预防多重耐药性病原菌和革兰氏细菌的药物中的应用，所述多重耐药性病原菌为MRSA和VRE。
[0021]按上述方案，所述非洲黄爪蝎抗菌肽0s_116对革兰氏细菌的抗菌结果为:(I)对革兰氏阴性细菌:大肠杆菌(疋coli ) DH5 α、绿脓杆菌iPseudomorms aeruginosa )和恶臭假单胞菌putida')的最小抑制菌生长浓度(minimal inhibitoryconcentration, MIC)均为20 μΜ ；(2)对革兰氏阳性细菌:金黄色葡萄球菌{Staphylococcus aureus ) > 珊瑚诺卡氏 HNocardia coralIina ) > 苏云金芽胞杆菌{Bacillus thuringiensis')、藤黄微球菌 iMicrococcus Iuteus)和巨大芽抱杆菌(.Bacillus megaterium)饱 WiC 分别为 4 μΜ、4 μΜ、6 μΜ、8 μ M 和 10 μ Μ。所述非洲黄爪蝎抗菌肽0s_116的结构同源抗菌肽:抗菌肽0s_116Ml和抗菌肽0s_116M2对革兰氏细菌的MIC值见表1。上述抗菌结果表明所述非洲黄爪蝎抗菌肽0s_l 16及其结构同源抗菌肽可应用于制备治疗或预防革兰氏病菌的药物中，特别地可以应用于制备治疗或预防因藤黄微球菌引起的疾病的药物中，如应用于制备治疗或预防因藤黄微球菌引起的脑膜炎、肺炎、败血症、脓毒性关节炎和脑脓肿等疾病的药物中。
[0022]所述非洲黄爪蝎抗菌肽0s_116对多重耐药性病原菌的抗菌结果为:(I)对从北京朝阳医院分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA:菌株5^的MIC为2 μΜ，菌株16436、16465、16558、16559、16585、16679、16731、16748 和 16760 的 MIC 均为 4 μΜ;(2)对万古霉素耐药肠球菌VRE:菌株E147、E161、E179、S13的MIC均为4 μ M，菌株E11、E128、E156的MIC均为6 μ M。所述非洲黄爪蝎抗菌肽0s_l 16的结构同源抗菌肽:抗菌肽0s_116Ml和抗菌肽Os_116M2对多重耐药性病原菌的MIC值见表2。上述抗菌结果表明，所述非洲黄爪蝎抗菌肽Os_l 16及其结构同源抗菌肽在低浓度的条件下就能高效抑制MRSA以及VRE的生长，可以应用于制备治疗或预防因MRSA、VRE引起的疾病的药物中，尤其是制备治疗或预防因MRSA、VRE引起的呼吸机相关性肺炎、败血症、脑膜炎、中耳炎、皮肤软组织感染、泌尿系统感染和中枢神经系统感染等严重感染性疾病的药物中。
[0023]本发明提供的非洲黄爪蝎抗菌肽0s_116及其结构同源抗菌肽对多重耐药性病原菌和革兰氏细菌具有较强的抗菌活性，分子量小且具有广谱抗菌机制作用，和传统抗生素相比大大降低了耐药机率，并且在低浓度下对人的正常细胞毒性小，因此在面临抗药性和筛选新的抗生素极端困难的情况下，成为抗生素的最佳替代物。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为本发明提供的非洲黄爪蝎抗菌肽基因及其编码的抗菌肽的氨基酸序列示意图。图中核苷酸序列下方为推断的对应氨基酸序列；信号肽氨基酸以单下划线标记；阴影部分氨基酸为C端前体肽；信号肽和C端前体肽中间序列为成熟肽序列，第一个成熟肽氨基酸残基用+1表示；方框里氨基酸序列为羧肽酶切位点；多聚腺苷酸化信号以斜体下划线标记。
[0025]图2为非洲黄爪蝎抗菌肽0s_116的结构特征图。
[0026]图3为非洲黄爪蝎抗菌肽0s_116的结构同源抗菌肽0s_116Ml的结构特征图。
[0027]图4为非洲黄爪蝎抗菌肽0s_116的结构同源抗菌肽0s_116M2的结构特征图。
[0028]图5为非洲黄爪蝎抗菌肽0s_116及其结构同源抗菌肽(抗菌肽0s_116Ml和抗菌肽0s_116M2)的毒性试 验结果图。
【具体实施方式】
[0029]下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护内容并不局限于以下实施例。
[0030]实施例1非洲黄爪蝎抗菌肽基因的获得
1、非洲黄爪蝎毒腺总RNA的提取(RNAiso Plus，购于Takara)
(1)取电击过好的蝎尾腺迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至将蝎尾腺研磨成粉末状(研磨越彻底，RNA的收率和质量越高)，向研钵中加入与样品匀 染量匹配的适量的RNAiso Plus,充分匀衆；
(2)将匀浆液转移至离心管中，室温(15~30°C)静置5min ；
(3)然后加入氯仿(氯仿体积为RNAisoPlus体积的1/5)，盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色，室温静置5 min；
(4)12,000 g 4°C离心15 min，从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即:无色的上清液(含RNA)、中间的白色蛋白层(大部分为DNA)及带有颜色的下层有机相，吸取上清液转移至另一新的离心管中(切勿吸出白色中间层)；
(5)向上清液中加入异丙醇(异丙醇体积为RNAisoPlus体积的0.5~I倍)，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10 min ； 12, OOOg 4°C离心10 min，得到RNA沉淀；
(6)RNA沉淀用75%乙醇洗涤(乙醇加入量与RNAiso Plus体积相同)，7，500X g 4°C离心5 min后弃去上清；室温下将RNA沉淀干燥后，加入适量的RNase-free水溶解RNA沉淀，得到蝎毒腺总RNA。整个过程参照RNAiso Plus (Total RNA提取试剂)推荐方法进行，制备的蝎毒腺总RNA采用用琼脂糖凝胶电泳(1%琼脂糖+溴乙锭)分析检测其质量。
[0031]2、mRNA的分离纯化
采用PolyA Tract mRNA分离系统(Promega，USA)分离和纯化蝎毒腺总RNA，得到mRNA，其工作原理是基于Oligo (dT)与mRNA 3 ^端poly (A)尾的互补配对特性，
用生物素标记oligo (dT),通过它与mRNA3 '端poly (A)的退火形成杂合体,然后用标有亲和素的磁珠和磁性分离架捕获并洗漆生物素01igo(dT)/mRNA杂交体,最后用无RNA酶的ddH20将之洗脱下来，达到从总RNA中分离mRNA的目的。具体操作步骤如下:
(1)样品的制备:将RNA加入到含有32μ I β-巯基乙醇的800 μ I的GTC中。
[0032](2)探针的退火:取250ρΜ浓度Oligo (dT)5 μL，加入蒸馏水至50 μ I ;加入1.6 ml 预热的 dilution buffer (dilution buffer 中已加入 32 μ I β-疏基乙醇)，与RNA 混匀，70°C温浴 5 min。
[0033](3)磁珠的活化-M 1.2ml的磁珠SA-PMPS (购自Promega)于1.5 ml的离心管中；用0.5 X SSC重悬SA-PMPS，以磁架吸附磁珠，原体积0.5 X SSC洗涤SA-PMPS三次。
[0034](4) mRNA的获取:将70°C温育的RNA与SA-PMPS混合，室温放置5 min后放在磁架上吸附磁珠，弃上清液；取2ml的0.5 X SSC悬浮磁珠，洗涤重复2次，最后一次尽量去除SSC ;加入无RNA酶的ddH20至磁珠中，轻轻混匀，然后离心(12000gX 3min)或磁架吸附磁珠；取上清，获得mRNA，通过电泳和紫外测定mRNA的浓度和纯度。
[0035](5)mRNA的沉淀:将`上步骤获得的mRNA中加入糖原和2.5倍体积的无水乙醇，沉淀过夜，所得沉淀即为mRNA，mRNA将用于cDNA合成。
[0036]3、第一链 cDNA 合成
利用 SMART cDNA synthesis Kit (购于 Takara)构建 cDNA 文库。首先以 3’ SMART ?CDS Primer II A - AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT^N—iN - 3’)为引物，以 mRNA 为模板合成第一链cDNA。
[0037](I)将 1000 ng mRNA 和 1μ I 3' SMARTer CDS Primer II A 引物(12 μ M)分别加入到0.5 ml PCR管中,用无RNase水补足溶液体积至4.5 μ I,混匀,简短离心十几秒；
(2)放在PCR仪中孵育，72°C孵育3min，然后将温度降至42°C孵育2 min ；
(3)按照以下顺序混合得到混合试剂,其中SMARTerIIA Oligonucleotide的引物序列为 5’ - AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX _ 3’:
2.0 μ I 5X First-Strand Buffer
0.25μ I DTT (IOOmM)
1.0 μ I SMARTer II A Oligonucleotide (12 μΜ )
0.25μ I RNase Inhibitor
1.0 μ I SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U) *
5.5 μ I Total Volume added per reaction
上述反转录酶需在使用混合试剂前加入，混合试剂应放在微量离心机上短暂离心混合；
(4)在0.5ml PCR管中加入5.5 μ I上述混合试剂，上下吹打混匀后短暂离心，在PCR仪上42°C孵育90 min。[0038](5)在70°C加热10 min后终止反应，向其中加入40 μ I的TE缓冲液(ρΗ8.0的10 mM Tris, 0.1 mM EDTA)，至此得到第一链cDNA合成产物，并用于第二链cDNA的合成。
[0039]4、第二链 cDNA 合成
利用 SMART cDNA synthesis Kit (购于 Takara),以 SMART II? A Oligonucleotide (5’ - AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX _ 3’)为引物，以第一链为模板合成第二链。
[0040](I)以 30 μ I 第一链 cDNA 为模板，以 6 μ I 5’PCR 引物 SMART IItmAOligonucleotide (12 μ Μ)合成第二链cDNA。其PCR反应体系如下:
30 μ I 第一链 cDNA 222 μ I 超纯水
30 μ I IOXAdvantage 2 PCR 缓冲液 6 μ I 50 XdNTP 聚合物(10 mM)
6 μ I 5’PCR 引物 SMART II ? A Oligonucleotide (12 μ Μ)
6 μ I 50 X Advantage 2 酶聚合物 上述反应体系应放在微量离心机上短暂离心混合；
(2)PCR反应条件为95°C预变性Imin;95°C变性15 s，65°C复性30 s，68°C延伸3 min,共30个循环(通过优化确定的PCR循环次数)；
(3)用1.2%琼脂糖凝胶、IXTAE缓冲液，取5 μ I PCR产物进行电泳，根据其结果来决定PCR产物质量及纯度；此时的PCR产物为双链cDNA。
[0041]5、cDNA文库的构建:` 利用PMD19-T Vector试剂盒(购于Takara)双链cDNA与pMD19_T载体的连接和转化。
[0042](I)在微量离心管中配制下列DNA溶液，体系为5 μ I ; pMD?19_T Simple Vector*I I μ I
cDNAI μ I
dH203 μ I
(2)加入5 μ I (等量)的 Solution I ;在 16°C 反应 30 min ；
(3)全量(10μL)加入至100 μ I DH5 α感受态细胞中，冰中放置30 min ;
(4)42°C加热45s后，再在冰中放置I min;
(5)加入890μ I SOC培养基，37°C振荡培养60 min ;在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落，计数白色、蓝色菌落；
(6)挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。
[0043]6、用PCR策略筛选cDNA文库
使用PMD19-T载体的载体引物，正向引物:5’ - GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3 ’反向引物:5 ’ -CAGCACTGACCCTTTTGGGACCGC-3 ’，通过PCR确认载体中插入片段的长度大小，将PCR产物为300-600bp大小的克隆子进行测序；测序获得的序列经过生物软件0RF、SignalP4.0和NCBI (美国国立生物技术信息中心)网页进行序列比对判断其基因结构和同源性。经过同源性比对发现了一种非洲黄爪蝎抗菌肽基因和已有报道的Meucin-18、BmKb2、BmKbl 和 BmKbl'等抗菌肽基因的同源性分别为 44.9%,30.8%,29.5%和29.5%，结果表明，该筛选得到的非洲黄爪蝎抗菌肽基因是一个新抗菌肽基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。[0044]本实施例筛选得到的非洲黄爪蝎抗菌肽基因编码的非洲黄爪蝎抗菌肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。图1为非洲黄爪蝎抗菌肽基因及其编码的抗菌肽的氨基酸序列示意图，从图1可以看出非洲黄爪蝎抗菌肽基因编码的抗菌肽氨基酸由以下三部分组成:信号肽(22个残基)，成熟肽(19个残基)，以及前肽(35个残基)，其中成熟肽序列为FffSffLMKAATKLLPSMLGS。
[0045]对上述非洲黄爪蝎抗菌肽的成熟肽通过NPSA server和HeliQuest软件结构预测，发现该非洲黄爪蝎抗菌肽的成熟肽具有以下抗菌肽的结构特征:a-螺旋并有疏水和亲水面。
[0046]实施例2非洲黄爪蝎毒抗菌肽0s_116的人工合成
根据实施例1获得的非洲黄爪蝎抗菌肽基因序列推导出非洲黄爪蝎抗菌肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)，去除其信号肽和前体肽，采用固相化学合成法，用自动多肽合成仪合成非洲黄爪蝎抗菌肽成熟肽序列，然后通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化得到合成多肽。所述合成多肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，并采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其精确的分子量，并用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列以进行确证，最终得到了纯度为91.34%，且与实施例1所述的非洲黄爪蝎抗菌肽(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)成熟肽的氨基酸序列一致、结构特征一致的合成多肽，命名为非洲黄爪蝎毒抗菌肽0s_116 (其氨基酸序列见SEQ ID NO:3，结构特征示意图见图2)。
[0047]实施例3非洲黄爪蝎毒抗菌肽0s_116的结构同源抗菌肽的设计及其人工合成 非洲黄爪蝎毒抗菌肽0s_116的结构同源抗菌肽的设计:根据非洲黄爪蝎毒抗菌肽
0s_116的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)及其结构特征，遵循以下原则设计突变体:1、在保持现有非洲黄爪蝎毒抗菌肽0s_l 16的α -螺旋结构的前提下，尽量使突变后的抗菌肽两亲性更加明显，即使得其疏水面更疏水、亲水面亲水性更强；2、增强亲水面的静电荷数量，提高其对磷脂膜的静电吸引作用；3、去掉对形成α-螺旋结构有破坏作用的氨基酸。采用点突变将非洲黄爪蝎毒抗菌肽0s_116氨基酸序列(SEQ ID NO:3)的第4位的色氨酸突变成赖氨酸，第9位的丙氨酸突变成异亮氨酸，得到氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:4所示的突变体I ;将非洲黄爪蝎毒抗菌肽0s_116氨基酸序列(SEQ ID NO:3)的第19位的丝氨酸去掉后得到氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示的突变体2。
[0048]本实施例中人工合成结构同源抗菌肽(突变体I和突变体2)的方法同实施例2，得到的合成多肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，并采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其精确的分子量，并用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列以进行确证，最终得到:(1)纯度为91.34%，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，结构特征示意图如图3所示的合成多肽，命名为抗菌肽0s_116Ml ；(2)纯度为94.67%，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，结构特征示意图如图4所示的合成多肽,命名为抗菌肽0s_116M2。
[0049]实施例3非洲黄爪蝎抗菌肽0s_116及其结构同源抗菌肽的抑菌试验
实验对象包括以下细菌:革兰氏阳性细菌，包括金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus (CCTCC:AB 94004),巨大芽孢杆 MBacillus magaterium (CCTCC:AB90008),藤黄微球菌 Micrococcus luteus (CCTCC:AB2010179),珊瑚诺卡氏菌 Nocardia coralIina(CCTCC:M92100)，苏云金芽胞杆菌也thuringiensis (CCTCC:AB93100);革兰氏阴性细菌，包括大肠杆菌瓦co/iDH5 α ,突光假单胞菌/!sewi/cwoftas fluorences (CCTCC:PF),恶臭假单胞菌putida (CCTCC:PP),阴沟肠杆菌cloacae (CCTCC:AB2010162),伤寒杆菌 5k/?o/?<977a enterica (CCTCC:AB2010185),绿胺杆菌/!sewt/cwoftasaeruginosa (CCTCC:AB93066)，产酸克雷伯式菌Z/eAsie77a oxytoca (CCTCC:AB2010143)。以上革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均购于中国典型培养物保藏中心。
[0050]多重耐药菌:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA菌株(5^、16436、16465、16558、16559、16585、16679、16731、16748 和 16760)和万古霉素耐药肠球菌 VRE 菌株(E11、E128、E147、E156、E161、E179、S13和S15);实验使用的MRSA以及VRE所有菌株均从北京朝阳医院分离的。
[0051]对以上细菌采用96孔板培养法试验:(I)分别将革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和多重耐药菌菌株培养到0D_=0.4时，用新鲜培养基稀释至0D_=0.002后取160 μ I加入到96孔板中，然后分别向各孔加入40 μ I经等比稀释的非洲黄爪蝎抗菌肽0s_116、0s_116Ml或0s_116M2，负对照只加菌，空白对照只有培养基；(2)37°C培养12小时后，用酶标仪测96孔板中各孔的在600nm波长处的吸光值；(3)确定非洲黄爪蝎抗菌肽0s_116、0s_116Ml和0s_116M2的10倍稀释的最低抑制浓度之后将最低抑制浓度进行2倍等比稀释，重复本实验实例实验的前两个步骤，最终确定非洲黄爪蝎毒抗菌肽0s_116、0s_116Ml和0s_116M2对细菌的最低抑制浓度。
[0052]非洲黄爪蝎毒抗菌肽0s_116、0s_116Ml和0s_116M2对革兰氏细菌的MIC值见表I。表1结果表明:非洲黄爪蝎毒抗菌肽抗菌肽0s_116、0s_116Ml和0s_116M2对革兰氏细菌有广谱抗菌活性，尤其对藤黄微球菌(iffcrococciAs Iuteus)的抗菌效果好,可以应用于制备治疗或预防因藤黄微球菌而引起的疾病的药物中，如应用于制备治疗或预防因藤黄微球菌而引起的脑膜炎、肺炎、败血症、脓毒性关节炎和脑脓肿等疾病的药物中。
[0053]表1非洲黄爪蝎毒抗菌肽0s_116及其结构同源抗菌肽对革兰氏细菌的抑制效果
【权利要求】
1.一种非洲黄爪蝎抗菌肽基因，其特征在于，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。
2.权利要求1所述的非洲黄爪蝎抗菌肽基因编码的非洲黄爪蝎抗菌肽，其特征在于，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。
3.人工合成的非洲黄爪蝎抗菌肽Os_116，其特征在于，它的氨基酸序列如序列表SEQID NO:3 所示。
4.权利要求3所述的人工合成的非洲黄爪蝎抗菌肽Os_l16的结构同源抗菌肽，其特征在于，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:4和SEQ ID N0:5所不。
5.非洲黄爪蝎抗菌肽Os_l16及其结构同源抗菌肽的人工合成方法，其特征在于:分别根据序列表SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，采用固相化学法合成多肽序列，并对合成的多肽进行C端酰胺化，然后通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化得到非洲黄爪蝎抗菌肽Os_116及其结构同源抗菌肽。
6.非洲黄爪蝎抗菌肽Os_116及其结构同源抗菌肽在制备治疗或预防多重耐药性病原菌和革兰氏细菌的药物中的应用，所述非洲黄爪蝎抗菌肽Os_116及其结构同源抗菌肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:3飞所示，所述多重耐药性病原菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和万古霉素耐药 肠球菌。
【文档编号】C07K7/08GK103865935SQ201410125303
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月31日 优先权日:2014年3月31日
【发明者】曾宪春, 聂尧, 张磊, 敖日格乐 申请人:中国地质大学（武汉）