一种静注人免疫球蛋白生产方法
【专利摘要】本发明公开了一种静注人免疫球蛋白生产方法，其技术方案要点是一种静注人免疫球蛋白生产方法，主要依次包括组分I的制作与离心、组分Ⅱ+Ⅲ的制作和离心、组分Ⅲ的制作和离心、组分Ⅱ的制作和离心、组分Ⅱ的溶解过滤、层析、超滤透析、配制、除菌、低pH孵放、灌装、检定的步骤，所述组分Ⅱ的溶解过滤的步骤中采用进行层析柱纯化分离和DEAESepharoseFastFlow离子交换层析柱纯化分离两步进行过滤得到层析纯化液，之后对层析纯化液进行超滤透析，超滤透析过程中调节pH值至3.9~4.3，并采用连续等倍透析法进行过滤，旨在提供一种静注人免疫球蛋白成品纯度高，低抗补体活性，产品质量好的静注人免疫球蛋白生产方法。
【专利说明】一种静注人免疫球蛋白生产方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制药领域，更具体地说，它涉及一种静注人免疫球蛋白生产方法。【背景技术】
[0002]静注人免疫球蛋白的活性成份为蛋白质，其中95%以上为免疫球蛋白。由健康人收集获得的原料血浆， 经低温乙醇蛋白分离法(压滤分离法)分离纯化，去除抗补体活性并经病毒灭活处理制成。目前，静注人免疫球蛋白由于乙醇浓度、温度、PH值等工艺参数的选择不合理，所生产的静注人免疫球蛋白成品的纯度基本在97%~98%之间，抗补体活性在30%~40%之间，静注人免疫球蛋白成品纯度低，抗补体活性高，产品质量低下，且其各组分沉淀的过程中都需要静置并离心，使得现有的静注人免疫球蛋白成品生产工艺繁琐，加工效率低下。
【发明内容】
[0003]针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种静注人免疫球蛋白成品纯度高，低抗补体活性，产品质量好的静注人免疫球蛋白生产方法。
[0004]为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案:一种静注人免疫球蛋白生产方法，主要依次包括组分I的制作与离心、组分II +III的制作和离心、组分III的制作和离心、组分II的制作和离心、层析、超滤透析、配制、除菌、低PH孵放、灌装、检定的步骤，所述层析的步骤中采用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析柱纯化分离得到层析纯化液,之后的超滤透析步骤中调节层析纯化液PH值至3.9^4.3，并采用连续等倍透析法对层析纯化液进行过滤。
[0005]通过采用上述技术方案,采用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析柱纯化分离，并在低PH值的环境下进行连续等倍透析使得静注人免疫球蛋白成品纯度高，具有低抗补体活性，提升了产品质量。
[0006]本发明进一步设置为:所述配制、除菌、低pH孵放、灌装、检定的步骤中采用DV-50纳米膜过滤除病毒，并通过0.2um和0.45um孔径的除脂滤芯进行除菌过滤。
[0007]通过采用上述技术方案，DV-50纳米膜过滤除病毒，提高了病毒安全性，通过
0.2um和0.45um孔径的除脂滤芯进打除囷过滤可去除脂蛋白和细囷提闻广品稳定性。
[0008]本发明进一步设置为:所述组分I的制作与离心、组分II +III的制作和离心、组分III的制作和离心、组分II的制作和离心、层析、超滤透析、配制、除菌、低PH孵放、灌装、检定的步骤具体为:
(I)、组分I的制作与离心，取原料血浆温室融化，过程中保持原料血浆温度2~4°C得到混合血浆，调节混合血浆的pH值至7.00-7.40保持液温为-2.5^-3.5°C，加入乙醇并调节乙醇浓度至8%(V/V)，调节离子强度为0.15，调节蛋白质浓度至4.0%~5.5%得到组分I，调节组分I的PH值至6.85~6.95保持液温为-4.5~-5.5°C，加入乙醇并调节乙醇浓度至20% (V/V)，调节离子强度为0.14，调节蛋白质浓度至3.5%~5.0%得到组分II + III溶液和组分I沉淀。
[0009](2)、组分II + III的制作和离心，取组分II + III溶液按28g/L血浆的量添加硅藻土，搅拌30min后压滤，压滤过程中过滤压力≤2.0Kg/cm2,得到组分II + III沉淀和组分II + III
上清液。
[0010](3)、组分III的制作和离心，取组分II +III沉淀加入注射用水并调节液温至3~7°C溶解，得到组分II +III溶解液，调节组分II +III溶解液PH值至5.10-5.20,保持液温为-4.5^-5.5°C，加入乙醇并调节乙醇浓度至18%(V/V)，调节离子强度至0.015得到组分III，取组分III压滤，压滤过程中过滤压力< 2.0Kg/cm2,得到组分III上清液和组分III沉淀。
[0011](4)、组分II的制作和离心，调节组分III上清液pH值至7.30-7.50,保持液温-9.0--10.(TC，加入乙醇并调节乙醇浓度至25%(V/V)，调节离子强度为0.05得到组分II，对组分II进行压滤，压滤过程中过滤压力(2.0Kg/cm2,得到组分II沉淀和组分II上清液。
[0012](5)、层析，取组分II沉淀加7倍沉淀量的注射用水溶解，保持液温:T7°C，得到组分II溶解液，对组分II溶解液进行澄清过滤后调节ρΗ6.50-7.00，调节导电率至1.3~1.4ms/cm再进行DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析柱纯化分离,得到层析纯化液。 [0013](6)、超滤透析，调节层析纯化液pH值至3.9^4.3后进行超滤透析，超滤透析过程中采用连续等倍透析法进行过滤，之后调节麦芽糖含量至9.0-11.0%，蛋白含量5(T65g/L，经筒式过滤器除菌之后在23~25°C恒温下低PH孵放21天，得到静注人免疫球蛋白原液。
[0014](7)、配制、除菌、低pH孵放、灌装、检定，调节静注人免疫球蛋白原液的蛋白含量高于50g/L，麦芽糖含量9.(Til.0%，之后DV-50的纳米膜对静注人免疫球蛋白原液进行过滤除病毒过滤，再通过0.2um和0.45um孔径的除脂滤芯进行除菌过滤，最后经过无菌灌装、二次灯检之后包装入库得到静注人免疫球蛋白成品。
[0015]通过采用上述技术方案，在制作组分I沉淀、组分II沉淀和组分III沉淀再分离的过程中无需进行静置和离心的操作，简化了生产工艺，提升了加工效率。且各个步骤的乙醇浓度、温度、PH值等工艺参数更加科学合理保证了静注人免疫球蛋白成品的高纯度、低抗补体活性的特性，提升了产品质量。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为本发明静注人免疫球蛋白生产方法实施例的流程图。
【具体实施方式】
[0017]参照图1对本发明静注人免疫球蛋白生产方法实施例做进一步说明。
[0018]一种静注人免疫球蛋白生产方法，依次包括组分I的制作与离心、组分II +III的制作和离心、组分III的制作和离心、组分II的制作和离心、层析、超滤透析、配制、除菌、低PH孵放、灌装、检定的步骤具体为:
(I)、组分I的制作与离心，取原料血浆温室融化，过程中保持原料血浆温度2~4°C得到混合血浆，调节混合血浆的pH值至7.00-7.40保持液温为-2.5^-3.5°C，加入乙醇并调节乙醇浓度至8%(V/V)，调节离子强度为0.15，调节蛋白质浓度至4.0%~5.5%得到组分I，调节组分I的PH值至6.85~6.95保持液温为-4.5~-5.5°C，加入乙醇并调节乙醇浓度至20% (V/V)，调节离子强度为0.14，调节蛋白质浓度至3.5%~5.0%得到组分II + III溶液和组分I沉淀(可用于制作限位蛋白原)。
[0019](2)、组分II +III的制作和离心，取组分II +III溶液按28g/L血浆的量添加硅藻土，搅拌30min后压滤，压滤过程中过滤压力≤2.0Kg/cm2,得到组分II + III沉淀和组分II + III上清液(可用于制作人血白蛋白)。
[0020](3)、组分III的制作和离心，取组分II +III沉淀加入注射用水并调节液温至3~7°C溶解，得到组分II +III溶解液，调节组分II +III溶解液PH值至5.10-5.20,保持液温为-4.5^-5.5°C，加入乙醇并调节乙醇浓度至18%(V/V)，调节离子强度至0.015得到组分III，取组分III压滤，压滤过程中过滤压力≤ 2.0Kg/cm2,得到组分III上清液和组分III沉淀。
[0021](4)、组分II的制作和离心，调节组分III上清液PH值至7.30-7.50,保持液温-9.0--10.(TC，加入乙醇并调节乙醇浓度至25%(V/V)，调节离子强度为0.05得到组分II，对组分II进行压滤，压滤过程中过滤压力≤2.0Kg/cm2,得到组分II沉淀和组分II上清液(废弃)。
[0022](5)、层析，取组分II沉淀加7倍沉淀量的注射用水溶解，保持液温:T7°C，得到组分II溶解液，对组分II溶解液进行澄清过滤后调节ρΗ6.50-7.00，调节导电率至
1.3~1.4ms/cm再进行DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析柱纯化分离,得到层析纯化液。 [0023](6)、超滤透析，调节层析纯化液pH值至3.9^4.3后进行超滤透析，超滤透析过程中采用连续等倍透析法进行过滤，之后调节麦芽糖含量至9.0-11.0%，蛋白含量5(T65g/L，经筒式过滤器除菌之后在23~25°C恒温下低PH孵放21天，得到静注人免疫球蛋白原液。
[0024](7)、配制、除菌、低pH孵放、灌装、检定，调节静注人免疫球蛋白原液的蛋白含量高于50g/L，麦芽糖含量9.(Til.0%，之后DV-50的纳米膜对静注人免疫球蛋白原液进行过滤除病毒过滤，再通过0.2um和0.45um孔径的除脂滤芯进行除菌过滤，最后经过无菌灌装、二次灯检之后包装入库得到静注人免疫球蛋白成品。
[0025]依照上述步骤所生产的静注人免疫球蛋白成品其纯度可达99%以上，抗补体活性可低于30%，生产步骤科学合理，静注人免疫球蛋白成品的生产工艺更加简便，提升了企业生产效率。
[0026]上述步骤中所加入的乙醇为浓度为95%的乙醇溶液；上述步骤中调节pH值依靠无水醋酸钠的水溶液、冰醋酸的水溶液或氢氧化钠的水溶液。
[0027]上述组分I，组分II +III，组分II，组分III为所属【技术领域】的通用分类方法，在本发明中是对特定物质的名称的命名，并不是指单纯的序号。
[0028]上述百分比中V/V为体积百分比，其他如无特殊说明均视为质量百分比。
【权利要求】
1.一种静注人免疫球蛋白生产方法，主要依次包括组分I的制作与离心、组分II +III的制作和离心、组分III的制作和离心、组分II的制作和离心、层析、超滤透析、配制、除菌、低PH孵放、灌装、检定的步骤，其特征是:所述层析的步骤中采用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析柱纯化分离得到层析纯化液，之后的超滤透析步骤中调节层析纯化液PH值至3.9^4.3，并采用连续等倍透析法对层析纯化液进行过滤。
2.根据权利要求1所述的静注人免疫球蛋白生产方法，其特征是:所述配制、除菌、低PH孵放、灌装、检定的步骤中采用DV-50纳米膜过滤除病毒，并通过0.2um和0.45um孔径的除脂滤芯进行除菌过滤。
3.根据权利要求2所述的静注人免疫球蛋白生产方法，其特征是所述组分I的制作与离心、组分II + III的制作和离心、组分III的制作和离心、组分II的制作和离心、层析、超滤透析、配制、除菌、低pH孵放、灌装、检定的步骤具体为: (1)、组分I的制作与离心，取原料血浆温室融化，过程中保持原料血浆温度2~4°C得到混合血浆，调节混合血浆的pH值至7.00-7.40保持液温为-2.5^-3.5°C，加入乙醇并调节乙醇浓度至8%(V/V)，调节离子强度为0.15，调节蛋白质浓度至4.0%~5.5%得到组分I，调节组分I的PH值至6.85~6.95保持液温为-4.5~-5.5°C，加入乙醇并调节乙醇浓度至20% (V/V)，调节离子强度为0.14，调节蛋白质浓度至3.5%~5.0%得到组分II + III溶液和组分I沉淀； (2)、组分II+III的制作和离心，取组分II +III溶液按28g/L血浆的量添加硅藻土，搅拌30min后压滤，压滤过程中过滤压力≤2.0Kg/cm2，得到组分II + III沉淀和组分II + III上清液； (3)、组分III的制作和离心，取组分II+III沉淀加入注射用水并调节液温至:T7°C溶解，得到组分II +III溶解液，调节组分II +III溶解液PH值至5.10-5.20,保持液温为-4.5^-5.5°C，加入乙醇并调节乙醇浓度至18%(V/V)，调节离子强度至0.015得到组分III，取组分III压滤，压滤过程中过滤压力< 2.0Kg/cm2，得到组分III上清液和组分III沉淀； (4)、组分II的制作和离心，调节组分III上清液pH值至7.30-7.50,保持液温-9.0--10.(TC，加入乙醇并调节乙醇浓度至25%(V/V)，调节离子强度为0.05得到组分II，对组分II进行压滤，压滤过程中过滤压力(2.0Kg/cm2,得到组分II沉淀和组分II上清液； (5)、层析，取组分II沉淀加7倍沉淀量的注射用水溶解，保持液温:T7°C，得到组分II溶解液，对组分II溶解液进行澄清过滤后调节PH6.50-7.00，调节导电率至1.3~1.4ms/cm再进行DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析柱纯化分离,得到层析纯化液； (6)、超滤透析，调节层析纯化液pH值至3.9^4.3后进行超滤透析，超滤透析过程中采用连续等倍透析法进行过滤，之后调节麦芽糖含量至9.(Tl 1.0%，蛋白含量5(T65g/L，经筒式过滤器除菌之后在23~25°C恒温下低PH孵放21天，得到静注人免疫球蛋白原液； (7)、配制、除菌、低pH孵放、灌装、检定，调节静注人免疫球蛋白原液的蛋白含量高于50g/L，麦芽糖含量9.(Til.0%，之后DV-50的纳米膜对静注人免疫球蛋白原液进行过滤除病毒过滤，再通过0.2um和0.45um孔径的除脂滤芯进行除菌过滤，最后经过无菌灌装、二次灯检之后包装入库得到静注人免疫球蛋白成品。
【文档编号】C07K1/36GK104004089SQ201410145837
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年4月12日 优先权日:2014年4月12日
【发明者】沈荣杰, 汤浩宇, 万天金, 庄建芬, 胡云刚 申请人:浙江海康生物制品有限责任公司