一种制备丝素微球的自组装方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备丝素微球的自组装方法，将家蚕茧层剪碎，投入到Na2CO3水溶液中进行脱胶处理，用去离子水清洗；将洗净的丝素样投入Na2CO3水溶液中再进行脱胶处理后，用去离子水清洗后，将丝素样摊平置于烘箱中烘干得到家蚕丝素纤维等，直到得到乳白色液体，然后冷冻干燥成粉末，从而制得成品，本发明在不添加任何有毒化学交联剂的条件下制备了丝素微球，制备工艺简单、反应条件温和，有利于保持丝素蛋白结构特征、提高丝素蛋白的利用率、降低生产成本，提高丝素微球的产量。本发明制备的丝素微球可用于载药微系统、细胞摄取等领域，为生物医学的发展提供新思路与方法。
【专利说明】—种制备丝素微球的自组装方法
【技术领域】
[0001]本发明属于一种丝素微球的制备方法，具体的说，是一种丝素微球的自组装方法。【背景技术】
[0002]丝素蛋白是蚕丝最主要的组成部分，约占2/3，由甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等18种氨基酸所组成，是一种天然蛋白质，因其良好的机械性能、生物相容性、生物降解性、透气透氧性和吸湿保湿等特点，在生物医学、化妆品、食品等领域中得到越来越广泛的研究与应用([J]Progress in Polymer Science, 2007，32:991-1007)。以丝素蛋白为原料制备的丝素微球，具有比表面积大、生物相容性好、可生物降解、较好的流动性和扩散性等优点，因此被广泛的研究。传统的制备丝素微球的方法主要有乳化法、喷雾干燥法、层流射流技术、机械粉碎法、盐析法等。但是采用传统方法(如乳化法、喷雾干燥法、层流射流法)在制备过程中加入的有机溶剂去除不彻底会引起毒性问题；另外制备出的微球粒径较大，并且制备条件需要高压高温破坏蛋白质的结构。近年来，自组装已成为一种新型的合成方法，其反应条件温和，自组装法成为丝素蛋白微球制备的首选方法。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种操作简便、反应条件温和、不添加任何化学交联剂而获得具有较小粒径的丝素蛋白微球的方法。
[0004]本发明是通过如下技术方案实现的:
[0005]一种制备丝素 微球的自组装方法特征在于，包括如下步骤:(I)将家蚕茧层剪碎，以(1:50) - (1:00)的浴比投入到质量百分比为0.3%-0.7%的Na2CO3水溶液中进行脱胶处理25-35min后，用去离子水清洗1_3次；将洗净的丝素样投入质量百分比为0.3%_0.7%的Na2CO3水溶液中再进行脱胶处理25-35min后，用去离子水清洗1_3次后，将丝素样摊平置于40-50°C的烘箱中烘干得到家蚕丝素纤维；
[0006](2)将步骤(1)中的家蚕丝素纤维投加到浓度为7-llmol/L的LiBr溶液中置于摇床中5-8h，加速溶解得到丝素溶液；将丝素溶液放在透析膜中用去离子水透析3-5d得到较纯丝素溶液，经自然风干、过滤后得到纯丝素溶液；
[0007](3)将步骤(2)中的纯丝素溶液调整为浓度为3%_7%的溶液；
[0008](4)取步骤(3)中丝素溶液置于烧杯中磁力搅拌5-10min，然后依次逐滴加入异丙醇溶液，使异丙醇与丝素溶液的体积比为(1:5) - (1:8)，继续磁力搅拌器10-30min ；
[0009](5)将步骤(4)中的溶液置于_20°C~_80°C冰箱中冷冻24_48h ；
[0010](6)将步骤(5)中的冷冻样在室温下解冻后，观察呈现乳白色液体，然后冷冻干燥成粉末，从而制得成品。
[0011 ] 作为进一步地改进，本发明所述步骤(1)中Na2CO3水溶液的温度为85_105°C，沸水浴能够提高脱胶的彻底性，提高丝素蛋白的纯度，使制备的球表面更加光滑。
[0012]作为进一步地改进，本发明所述步骤(1)中，将家蚕蚕茧剪碎，以1:100的浴比投加到质量百分比为0.5%的Na2CO3水溶液中进行脱胶处理。
[0013]作为进一步地改进，本发明所述步骤(1)中，脱胶处理30min中后，用去离子水清洗2次，再脱胶30min，去离子水清洗3次，再进行温度为50°C烘干得到家蚕丝素纤维。多次清洗样品可彻底清除丝胶蛋白的干扰；温度适宜，不会影响丝素蛋白结构的改变。
[0014]作为进一步地改进，本发明所述的步骤(2)中，将步骤(1)中的家蚕丝素纤维投加到浓度为9mol/L的LiBr溶液中置于摇床中6h，加速溶解并降低分子量从而得到丝素溶液。
[0015]作为进一步地改进，本发明所述的步骤(2)中，LiBr溶液的浓度为8-lOmol/L。
[0016]作为进一步地改进，本发明所述的步骤(2)中，LiBr溶液的浓度为9mol/L，使丝素在较短的时间内溶解的更加彻底，LiBr溶液的浓度过高会使透析的时间过长，并且透析不彻底，如果过低，丝素溶液溶解的处理时间过长，会发生凝胶现象。
[0017]作为进一步地改进，本发明所述的步骤(3)中的纯丝素溶液调整为浓度为3%的溶液，能够使制备的丝素微球微粒直径控制在Ium左右，微球粒径分布均匀。
[0018]作为进一步地改进，本发明所述的步骤(4)中，将步骤(3)中丝素溶液置于烧杯中磁力搅拌5min，然后逐滴加入异丙醇溶液，使异丙醇与丝素溶液的体积比为1: 5，继续磁力搅拌器30min,能够微球粒径分布均匀,微球分散性良好。
[0019]本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:在不添加任何有毒化学交联剂的条件下制备了丝素微球，制备工艺简单、反应条件温和，有利于保持丝素蛋白结构特征、提高丝素蛋白的利用率 、降低生产成本，提高丝素微球的产量。本发明制备的丝素微球可用于载药微系统、细胞摄取等领域，为生物医学的发展提供新思路与方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1是本发明实施例1中丝素微球的电镜图；
[0021]图2是本发明实施例3中丝素微球的电镜图；
[0022]图3是本发明实施例5中丝素微球的电镜图；
[0023]图4是本发明实施例6中丝素微球的电镜图。
【具体实施方式】
[0024]下面结合附图并通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
[0025]实施例1
[0026]本实施例中丝素微球的制备方法依次包括如下步骤。
[0027](I)将家蚕蚕茧剪碎，称取20g以1:00的浴比投入到质量百分比为0.5%的Na2CO3水溶液中。水溶液中进行脱胶处理，脱胶处理30min后，用去离子水清洗2次；再重复以上步骤，用去离子水清洗3次后，将丝素样摊平置于50°C的烘箱中烘干得到家蚕丝素纤维；所述Na2CO3水溶液的温度为85-105°C。
[0028](2)称取步骤(1)中的IOg家蚕丝素纤维投加到浓度为9mol/L的LiBr溶液中置于摇床中6h，加速溶解得到丝素溶液；将丝素溶液放在透析膜中用去离子水透析4天得到较纯丝素溶液，经自然风干、过滤后得到纯丝素溶液。本发明可以将步骤(1)中的丝素蛋白置于一定浓度LiBr溶液中溶解处理一定时间，获得粘稠液体:所用的LiBr溶液浓度通常为7~11M，优选为8-10M，最佳为9M ;所用的处理时间为5_8h，最佳是6h。
[0029](3)将步骤(2)中的纯丝素溶液调整为浓度为3%_7%的溶液，优选3%的浓度。
[0030](4)取步骤(3)中丝素溶液置于烧杯中磁力搅拌5min，然后依次逐滴加入异丙醇溶液，使异丙醇与丝素溶液的体积比为1: 5，继续磁力搅拌器30min。
[0031](5)将步骤(4)中的溶液置于_20°C冰箱中冷冻24h。
[0032](6)将步骤(5)中的冷冻样在室温下解冻后，观察呈现乳白色液体，然后冷冻干燥成粉末，从而制得成品。
[0033](7)如图1，该丝素微球颗粒直径为0.694±0.210 μ m，微球粒径分布较均匀，分散性良好，微球表面较光滑，呈规则的球状这说明控制一定的条件可以制备出粒径均匀，分散性良好的丝素微球。
[0034]实施例2
[0035](I)将家蚕蚕茧剪碎，称取20g以1:00的浴比投入到质量百分比为0.5%的Na2CO3水溶液中。水溶液中进行脱胶处理，脱胶处理30min后，用去离子水清洗2次；再重复以上步骤，用去离子水清洗3次后，将丝素样摊平置于50°C的烘箱中烘干得到家蚕丝素纤维；所述Na2CO3水溶液的温度为85-105°C。
[0036](2)称取步骤(1)中的IOg家蚕丝素纤维投加到浓度为9mol/L的LiBr溶液中置于摇床中5h，加速溶解得到丝素溶液；将丝素溶液放在透析膜中用去离子水透析4天得到较纯丝素溶液，经自然风干、过滤后得到纯丝素溶液。
[0037](3)将步骤(2)中的纯丝素溶液调整为浓度为3%的溶液。
[0038](4)取步骤(3)中丝素溶液置于烧杯中磁力搅拌5min，然后依次逐滴加入异丙醇溶液，使异丙醇与丝素溶液的体积比为1: 8，继续磁力搅拌器30min。
[0039](5)将步骤(4)中的溶液置于_20°C冰箱中冷冻24h。
[0040](6)将步骤(5)中的冷冻样在室温下解冻后，观察呈现乳白色液体，然后冷冻干燥成粉末，从而制得成品。
[0041](7)该丝素微球颗粒直径为1.192±0.137 μ m。
[0042]实施例3
[0043](I)将家蚕蚕茧剪碎，称取20g以1:00的浴比投入到质量百分比为0.5%的Na2CO3水溶液中。水溶液中进行脱胶处理，脱胶处理30min后，用去离子水清洗2次；再重复以上步骤，用去离子水清洗3次后，将丝素样摊平置于50°C的烘箱中烘干得到家蚕丝素纤维；所述Na2CO3水溶液的温度为85-105°C。
[0044](2)称取步骤(1)中的IOg家蚕丝素纤维投加到浓度为9mol/L的LiBr溶液中置于摇床中5h，加速溶解得到丝素溶液；将丝素溶液放在透析膜中用去离子水透析4天得到较纯丝素溶液，经自然风干、过滤后得到纯丝素溶液。
[0045](3)将步骤(2)中的纯丝素溶液调整为浓度为5%的溶液。
[0046](4)取步骤(3)中丝素溶液置于烧杯中磁力搅拌5min，然后依次逐滴加入异丙醇溶液，使异丙醇与丝素溶液的体积 比为1: 5，继续磁力搅拌器30min。
[0047](5)将步骤(4)中的溶液置于_20°C冰箱中冷冻24h。
[0048](6)将步骤(5)中的冷冻样在室温下解冻后，观察呈现乳白色液体，然后冷冻干燥成粉末，从而制得成品。[0049](7)如图2，该丝素微球颗粒直径为1.519±0.134 μ m。微球粒径分布较均匀，分散性不佳，多数微球呈现规则的球状，这说明增加丝素浓度后，微球粒径增加，随着溶液粘稠度增加，部分丝素蛋白没有充分与异丙醇反应，而呈现出形状不规则，分散性不佳的现象。
[0050]实施例4
[0051](I)将家蚕蚕茧剪碎，称取20g以1:00的浴比投入到质量百分比为0.5%的Na2CO3水溶液中。水溶液中进行脱胶处理，脱胶处理30min后，用去离子水清洗2次；再重复以上步骤，用去离子水清洗3次后，将丝素样摊平置于50°C的烘箱中烘干得到家蚕丝素纤维；所述Na2CO3水溶液的温度为85-105°C。
[0052](2)称取步骤(1)中的IOg家蚕丝素纤维投加到浓度为9mol/L的LiBr溶液中置于摇床中5h，加速溶解得到丝素溶液；将丝素溶液放在透析膜中用去离子水透析4天得到较纯丝素溶液，经自然风干、过滤后得到纯丝素溶液。
[0053](3)将步骤(2)中的纯丝素溶液调整为浓度为5%的溶液。
[0054](4)取步骤(3)中丝素溶液置于烧杯中磁力搅拌5min，然后依次逐滴加入异丙醇溶液，使异丙醇与丝素溶液的体积比为1: 8，继续磁力搅拌器30min。
[0055](5)将步骤(4)中的溶液置于_20°C冰箱中冷冻24h。
[0056](6)将步骤(5)中的冷冻样在室温下解冻后，观察呈现乳白色液体，然后冷冻干燥成粉末，从而制得成品。
[0057](7)该丝素微球颗粒直径为2.356±0.148 μ m。
[0058]实施例5
[0059](I)将家蚕蚕茧剪碎，称取20g以1:00的浴比投入到质量百分比为0.5%的Na2CO3水溶液中。水溶液中进行脱胶处理，脱胶处理30min后，用去离子水清洗2次；再重复以上步骤，用去离子水清洗3次后，将丝素样摊平置于50°C的烘箱中烘干得到家蚕丝素纤维；所述Na2CO3水溶液的温度为85-105°C。
[0060](2)称取步骤(1)中的IOg家蚕丝素纤维投加到浓度为9mol/L的LiBr溶液中置于摇床中6h，加速溶解得 到丝素溶液；将丝素溶液放在透析膜中用去离子水透析5天得到较纯丝素溶液，经自然风干、过滤后得到纯丝素溶液。
[0061](3)将步骤(2)中的纯丝素溶液调整为浓度为7%的溶液。
[0062](4)取步骤(3)中丝素溶液置于烧杯中磁力搅拌5min，然后依次逐滴加入异丙醇溶液，使异丙醇与丝素溶液的体积比为1: 5，继续磁力搅拌器30min。
[0063](5)将步骤(4)中的溶液置于_20°C冰箱中冷冻48h。
[0064](6)将步骤(5)中的冷冻样在室温下解冻后，观察呈现乳白色液体，然后冷冻干燥成粉末，从而制得成品。
[0065](7)如图3，该丝素微球颗粒直径为5.103±0.217 μ m。微球粒径分布较均匀，但分散性不佳，有堆叠区域，偶有块状不规则形状，这说明丝素溶液浓度越大，微球粒径越大，并且随着溶液粘稠度的增高，其分散性变差，丝素微球堆叠现象严重。
[0066]实施例6
[0067](I)将家蚕蚕茧剪碎，称取20g以1:00的浴比投入到质量百分比为0.5%的Na2CO3水溶液中。水溶液中进行脱胶处理，脱胶处理30min后，用去离子水清洗2次；再重复以上步骤，用去离子水清洗3次后，将丝素样摊平置于50°C的烘箱中烘干得到家蚕丝素纤维；所述Na2CO3水溶液的温度为85-105°C。
[0068](2)称取步骤(1)中的IOg家蚕丝素纤维投加到浓度为9mol/L的LiBr溶液中置于摇床中6h，加速溶解得到丝素溶液；将丝素溶液放在透析膜中用去离子水透析4天得到较纯丝素溶液，经自然风干、过滤后得到纯丝素溶液。
[0069](3)将步骤(2)中的纯丝素溶液调整为浓度为7%的溶液。
[0070](4)取步骤(3)中丝素溶液置于烧杯中磁力搅拌5min，然后依次逐滴加入异丙醇溶液，使异丙醇与丝素溶液的体积比为1: 8，继续磁力搅拌器30min。
[0071](5)将步骤(4)中的溶液置于_20°C冰箱中冷冻48h。
[0072](6)将步骤(5)中的冷冻样在室温下解冻后，观察呈现乳白色液体，然后冷冻干燥成粉末，从而制得成品。
[0073](7)如图4，该丝素微球颗粒直径为4.083±0.182 μ m。微球粒径明显增大，分散性不佳，有粘连现象及堆叠现象出现，并有不规则形状，这说明，丝素溶液浓度和体积增大，微球粒径明显增加，溶液粘稠度增加使自组装反应不充分，呈现出不规则形状，并伴有粘连和堆叠现象。
[0074]实施例7
[0075](1)将家蚕蚕茧剪碎，称取20g以1:00的浴比投入到质量百分比为0.5%的Na2CO3水溶液中。水溶液中进行脱胶处理，脱胶处理30min后，用去离子水清洗2次；再重复以上步骤，用去离子水清洗3次后，将丝素样摊平置于50°C的烘箱中烘干得到家蚕丝素纤维；所述Na2CO3水溶液的温度为85-105°C。
[0076](2)称取步骤(1)中的IOg家蚕丝素纤维投加到浓度为9mol/L的LiBr溶液中置于摇床中7h，加速溶解得到丝素溶液；将丝素溶液放在透析膜中用去离子水透析3天得到较纯丝素溶液，经自然风干、过滤后得到纯丝素溶液。
[0077](3)将步骤(2)中的纯丝素溶液调整为浓度为3%的溶液。
[0078](4)取步骤(3)中丝素溶液置于烧杯中磁力搅拌5min，然后依次逐滴加入异丙醇溶液，使异丙醇与丝素溶液的体积比为1: 5，继续磁力搅拌器30min。
[0079](5)将步骤(4)中的溶液置于_20°C冰箱中冷冻24h。
[0080](6)将步骤(5)中的冷冻样在室温下解冻后，观察呈现乳白色液体，然后冷冻干燥成粉末，从而制得成品。
[0081](7)该丝素微球颗粒直径为0.717±0.255 μ m。
[0082]实施例8
[0083](I)将家蚕蚕茧剪碎，称取20g以1:00的浴比投入到质量百分比为0.5%的Na2CO3水溶液中。水溶液中进行脱胶处理，脱胶处理30min后，用去离子水清洗2次；再重复以上步骤，用去离子水清洗3次后，将丝素样摊平置于50°C的烘箱中烘干得到家蚕丝素纤维；所述Na2CO3水溶液的温度为85-105°C。
[0084](2)称取步骤(1)中的IOg家蚕丝素纤维投加到浓度为9mol/L的LiBr溶液中置于摇床中5h，加速溶解得到丝素溶液；将丝素溶液放在透析膜中用去离子水透析4天得到较纯丝素溶液，经自然风干、过滤后得到纯丝素溶液。
[0085](3)将步骤(2)中的纯丝素溶液调整为浓度为3%的溶液。
[0086](4)取步骤(3)中丝素溶液置于烧杯中磁力搅拌5min，然后依次逐滴加入异丙醇溶液，使异丙醇与丝素溶液的体积比为1: 5，继续磁力搅拌器30min。
[0087](5)将步骤(4)中的溶液置于_20°C冰箱中冷冻48h。
[0088](6)将步骤(5)中的冷冻样在室温下解冻后，观察呈现乳白色液体，然后冷冻干燥成粉末，从而制得成品。
[0089](7)该丝素微球颗粒直径为0.679±0.199 μ m。
[0090]实施例9
[0091](I)将家蚕蚕茧剪碎，称取20g以1:00的浴比投入到质量百分比为0.5%的Na2CO3水溶液中。水溶液中进行脱胶处理，脱胶处理30min后，用去离子水清洗2次；再重复以上步骤，用去离子水清洗3次后，将丝素样摊平置于50°C的烘箱中烘干得到家蚕丝素纤维；所述Na2CO3水溶液的温度为85-105°C。
[0092](2)称取步骤(1)中的IOg家蚕丝素纤维投加到浓度为9mol/L的LiBr溶液中置于摇床中5h，加速溶解得到丝素溶液；将丝素溶液放在透析膜中用去离子水透析3天得到较纯丝素溶液，经自然风干、过滤后得到纯丝素溶液。
[0093](3)将步骤(2)中的纯丝素溶液调整为浓度为5%的溶液。
[0094](4)取步骤(3)中丝素溶液置于烧杯中磁力搅拌5min，然后依次逐滴加入异丙醇溶液，使异丙醇与丝素溶液的体积比为1: 5，继续磁力搅拌器30min。
[0095](5)将步骤(4)中的溶液置于_80°C冰箱中冷冻48h。
[0096](6)将步骤(5)中的冷冻样在室温下解冻后，观察呈现乳白色液体，然后冷冻干燥成粉末，从而制得成品。
[0097](7)该丝素微球颗粒直径为1.4529±0.162 μ m。
[0098]以上列举的仅是本发明的部分具体实施例，显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种制备丝素微球的自组装方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将家蚕茧层剪碎，以(1:50)-(1:00)的浴比投入到质量百分比为0.3%-0.7%的Na2CO3水溶液中进行脱胶处理25-35min后，用去离子水清洗1_3次；将洗净的丝素样投入质量百分比为0.3%-0.7%的Na2CO3水溶液中再进行脱胶处理25_35min后，用去离子水清洗1-3次后，将丝素样摊平置于40-50°C的烘箱中烘干得到家蚕丝素纤维； (2)将步骤(1)中的家蚕丝素纤维投加到浓度为7-llmol/L的LiBr溶液中置于摇床中5_8h，加速溶解得到丝素溶液；将丝素溶液放在透析膜中用去离子水透析3-5d得到较纯丝素溶液，经自然风干、过滤后得到纯丝素溶液； (3)将步骤(2)中的纯丝素溶液调整为 浓度为3%-7%的溶液； (4)取步骤(3)中丝素溶液置于烧杯中磁力搅拌5-10min，然后依次逐滴加入异丙醇溶液，使异丙醇与丝素溶液的体积比为(1:5) - (1:8)，继续磁力搅拌器10-30min ； (5)将步骤(4)中的溶液置于_20°C~_80°C冰箱中冷冻24-48h； (6)将步骤(5)中的冷冻样在室温下解冻后，观察呈现乳白色液体，然后冷冻干燥成粉末，从而制得成品。
2.根据权利要求1所述的制备丝素微球的自组装方法，其特征在于， 所述步骤(1)中Na2CO3水溶液的温度为85-105°C。
3.根据权利要求1所述的制备丝素微球的自组装方法，其特征在于， 所述步骤(1)中，将家蚕蚕茧剪碎，以1:100的浴比投加到质量百分比为0.5%的Na2CO3水溶液中进行脱胶处理。
4.根据权利要求1所述的制备丝素微球的自组装方法，其特征在于， 所述步骤(1)中，脱胶处理30min中后，用去离子水清洗2次，再脱胶30min，去离子水清洗3次，再进行温度为50°C烘干得到家蚕丝素纤维。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的制备丝素微球的自组装方法，其特征在于， 所述的步骤(2)中，将步骤(1)中的家蚕丝素纤维投加到浓度为9mol/L的LiBr溶液中置于摇床中6h，加速溶解并降低分子量从而得到丝素溶液。
6.根据权利要求5所述的制备丝素微球的自组装方法，其特征在于， 所述的步骤(2)中，LiBr溶液的浓度为8-lOmol/L。
7.根据权利要求6所述的制备丝素微球的自组装方法，其特征在于， 所述的步骤(2)中，LiBr溶液的浓度为9mol/L。
8.根据权利要求1所述的制备丝素微球的自组装方法，其特征在于， 所述的步骤(3)中的纯丝素溶液调整为浓度为3%的溶液。
9.根据权利要求1或2或3或4或6或7或8所述的制备丝素微球的自组装方法，其特征在于， 所述的步骤(4)中，将步骤(3)中丝素溶液置于烧杯中磁力搅拌5min，然后逐滴加入异丙醇溶液，使异丙醇与丝素溶液的体积比为1: 5，继续磁力搅拌器30min。
【文档编号】C07K1/14GK103965310SQ201410160739
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年4月21日 优先权日:2014年4月21日
【发明者】朱良均, 潘岳林, 张海萍, 杨明英, 邓连霞 申请人:浙江大学