一种埃博霉素b内酰胺衍生物的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种埃博霉素B内酰胺衍生物合成方法，它包括以下步骤：它采用埃博霉素B、叠氮钠作为起始原料，选择催化剂，进行开环氮化反应生成氮酸，再进行水解反应，生成氨基酸，再进行环合反应生成埃博霉素B内酰胺衍生物。本发明可以有效地化学合成埃博霉素B内酰胺衍生物。
【专利说明】一种埃博霉素B内酰胺衍生物的制备方法【技术领域】
[0001]本发明涉及一种埃博霉素B-内酰胺衍生物化学的合成方法。
【背景技术】
[0002]埃博霉素是由黏细菌纤维素堆囊菌分泌的结构为16元内酯大环为中心体、噻唑环配基为侧链的一类细胞毒化合物，是一种具有类似紫杉醇微管蛋白聚合和微管稳定作用的新型抗肿瘤药物。埃博霉素良好的应用前景，引起了化学界、生物界和医学界的广泛关注。目前获得该类活性物的手段主要是生物发酵、半合成结构修饰、化学合成和基因工程改造的研究。
[0003]以纤维素堆囊菌培养方法进行埃博霉素的大规模生产是理想的途径。但是目前微生物发酵方法生产埃博霉素的产量很低。美国施贵宝公司将So ce90菌株经过UV诱变继之以随机选择产生So ce90B2菌株，然后再用亚硝基胍(NTG)诱变，得到高产菌株(SC16408)。传统的生物发酵仍然聚焦在采用诱变的方法获得高产菌株，优化发酵条件和提高产物的纯化工艺。
[0004]目前，通过纤维 堆囊菌发酵合成埃博霉素的手段仍然存在很大局限性。首先纤维堆囊菌的分离和纯化工作繁琐，生产周期较长。此外，从发酵液中分离、提纯产物的方法有待进一步优化。目前，埃博霉素传统的工业菌株育种技术仍然具有实用价值。
[0005]针对化学合成条件过于苛刻，而生物发酵获得的类别有限的缺点，人们也采用半合成手段来获得新的埃博霉素衍生物，即采用发酵的手段获得埃博霉素母体以后，再进行化学修饰。如BMS-247550和BMS-310705均采用半合成技术获得。因此半合成的方法有利于获得有活性的产物。
[0006]与紫杉醇比较，埃博霉素的化学结构相对简单，所以化学合成埃博霉素及其衍生物成为近年来生物有机化学家们关注的热点。埃博霉素是一种结构复杂的天然产物，天然产物的有机合成可谓是20世纪后十年对有机化学最巨大的挑战。埃博霉素一问世，有数十条全合成路线相继报道。
[0007]从1993年发现至今(2007年10月)，有关埃博霉素研究报告的文献量约有500多篇。国外报道全合成埃博霉素的方法路线不下30余种。但是，具有商业价值的全合成方法必须具备合成步骤短、最长线性片段少、总产率高这3个优势。但是目前全合成埃博霉素都是步骤冗长，大都在20步反应以上，反应条件苛刻，产率很低，大都小于2%。
[0008]为了解决现有技术中的上述不足，本发明提出了一种新的解决方案。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种埃博霉素B-内酰胺衍生物化学的合成方法，它可以有效地化学合成埃博霉素B-内酰胺衍生物。
[0010]为达上述目的，本发明采用了以下技术方案:一种埃博霉素B-内酰胺衍生物合成方法，它包括以下步骤:步骤一，开环氮化反应:在氮气保护下，在反应釜中投入圆氢呋喃和水的混合液、埃博霉素B和催化剂，然后再分批投入叠氮钠进行搅拌，慢慢升温，当反应溶液变成黄色后依次采用乙酸乙酯萃取、有机相用饱和盐水洗涤和无水硫酸钠干燥后得到氮酸；步骤二，水解反应:在氩气的保护下，在反应釜中投入四氢呋喃、步骤一得到的氮酸和三苯膦进行第一次搅拌和升温，然后进行第一次冷却，冷却后再滴加氢氧化铵，滴加后再进行第二次升温搅拌，然后再进行第二次冷却至室温，最后再用乙酸乙酯进行萃取，有机相用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到氨基酸；步骤三，环合反应:在氩气的保护下，在反应釜中投入四氢呋喃和步骤二得到的氨基酸，接着再投入碳酸钠后降温，然后温度控制在零度以下后缓慢地滴加二苯基磷酰基叠氮化物，保温搅拌，配置25%的磷酸二氢钠溶液，将磷酸二氢钠溶液冷却后加入反应釜中与四氢呋喃、氨基酸和碳酸钠混合搅拌，然后加入乙酸乙酯进行萃取，有机相无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到埃博霉素B内酰胺衍生物；步骤四，纯化:在反应釜中将埃博霉素B内酰胺衍生物溶解在四氢呋喃中，依次用饱和盐水清洗搅拌，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥以及减压浓缩，最后通过两次纯化过程得到纯的埃博霉素B内酰胺衍生物。
[0011]综上所述，本发明具有以下优点:
本发明采用化学合成的方法制备埃博霉素B-内酰胺衍生物，不但制备过程简单，而且节约成本，同时制备的埃博霉素B-内酰胺衍生物可以抑制肿瘤细胞生长的作用机制，并且对多重耐药肿瘤细胞和耐紫杉醇的肿瘤细胞均表现强大的抗癌活性。
【具体实施方式】
[0012]本发明提供了一种埃博霉素B-内酰胺衍生物化学的合成方法，它包括以下步骤:步骤一，开环氮化反应:在氮气保护下，反应釜中投入800ml混合液(四氢呋喃:水=9:1)、埃博霉素B25g (5.76mmol)和3.5g (0.35mmol)四(三苯基膦)合钯，分批投入4.76g(8.64mmol)叠氮钠，在搅拌下，慢慢升温至60°C，搅拌7个小时，在搅拌的过程中跟踪TLC:Et0Ac/MS0=l:2,使得反应状态为溶液变成黄色，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯分3次，每次250ml进行萃取,有机相用饱和盐水洗漆,洗漆时进行2次,每次采用200ml有机相用饱和盐水进行洗涤，无水硫酸钠干煤，真空浓缩，得到氮酸17.1go
[0013]步骤二，水解反应:在氩气保护下，反应釜中投入四氢呋喃500ml、一步得的氮酸17.1g和三苯膦16.3g，搅拌升温至50°C，搅拌18小时，再冷却至10°C以下，滴加25%氢氧化铵溶液150ml，温度控制在10°C以下，滴加完毕，再升温至50°C，搅拌6个小时后，冷却至室温，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯分3次，每次100mL进行萃取，有机相用饱和盐水洗涤，洗涤时进行2次，每次采用200ml有机相用饱和盐水进行洗涤，无水硫酸钠干燥，真空浓缩。得到氨基酸12.5g；
步骤三，环合反应:在氩气保护下，反应釜中投入四氢呋喃500ml、二步得到的氨基酸12.5g搅拌，再投入15g碳酸钠，降温至0°C。缓慢滴加二苯基磷酰基叠氮化物20ml (8.5mmol)，温度控制在0°C以下，保温搅拌24小时。配制25%磷酸二氢钠溶液200ml，冷却至0-30C，加入到反应釜中，继续搅拌2小时。加入0-3°C乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯分3次，每次500ml进行萃取，有机相无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到5.6g埃博霉素B内酰胺衍生物。
[0014]步骤四，纯化:在反应釜中投入第三步得的5.6g埃博霉素B内酰胺衍生韧溶解在四氢呋喃300ml中，用饱和盐水200ml清洗搅拌20分钟清洗，乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯分3次，每次250ml进行萃取，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，第一次色谱纯化，色谱纯化在l(T60cm的二氧化硅上采用3-5%甲醇-氯仿进行梯度洗脱，第二次为制备型HPLC纯化，它采用5-50%甲醇 -氯仿梯度洗脱，最后得到纯埃博霉素D内酰胺衍生物4.8g。
【权利要求】
1.一种埃博霉素B内酰胺衍生物的制备方法，包括以下步骤: 步骤一，在氮气保护下，在反应釜中投入四氢呋喃和水的混合液、埃博霉素B和催化剂二氯二氨合钯，然后再分批投入叠氮钠进行搅拌，慢慢升温，当反应溶液变成黄色后依次采用乙酸乙酯萃取、有机相用饱和盐水洗涤和无水硫酸钠干燥后得到氮酸； 步骤二，在氩气的保护下，在反应釜中投入四氢呋喃、步骤一得到的氮酸和三苯膦进行第一次搅拌和升温，然后进行第一次冷却，冷却后再滴加氢氧化铵，滴加后再进行第二次升温搅拌，然后再进行第二次冷却至室温，最后再用乙酸乙酯进行萃取，有机相用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到氨基酸； 步骤三，在氩气的保护下，在反应釜中投入四氢呋喃和步骤二得到的氨基酸，接着再投入碳酸钠后降温，然后温度控制在零度以下后缓慢地滴加二苯基磷酰基叠氮化物，保温搅拌，配置25%的磷酸二氢钠溶液,将磷酸二氢钠溶液冷却后加入反应爸中与四氢呋喃、氨基酸和碳酸钠混合搅拌，然后加入乙酸乙酯进行萃取，有机相无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到埃博霉素B内酰胺衍生物； 步骤四，纯化:在反应釜中将埃博霉素B内酰胺衍生物溶解在四氢呋喃中，依坎用饱和盐水清洗搅拌，乙 酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥以及减压浓缩，最后通过两次纯化过程得到纯的埃博霉素B内酰胺衍生物。
2.根据权利要求1所述的埃博霉素B-内酰胺衍生物合成方法，其特征是所述的步骤一中四氢呋喃和水的混合液为800ml,四氢呋喃和水的体积比为9:1，埃博霉素B为259,叠氮钠为4.76g，催化剂为二氯二氨合钯，催化剂的重量为3.5g，在投入叠氮钠后进行搅拌的时间为?小时，在搅拌的过程中跟踪TLC:EtOAc/MSO为1:2，慢慢升温至60°C，在萃取时进行三次萃取，每次采用250ml的乙酸乙酯进行萃取；在洗涤时进行2次洗涤，每次采用200ml的有机相用饱和盐水进行洗涤，最后得到的氮酸为17.1go
3.根据权利要求1所述的埃博霉素B-内酰胺衍生物合成方法，其特征是所述的步骤二中反应釜中投入四氢呋喃为500ml、氮酸17.1g和三苯膦16.3g，第一次搅拌的时间为18小时，升高的温度为50°C，然后第一次冷却的温度为10°C以下，滴加氢氧化铵时的温度为10°C以下，氢氧化铵为25%的氢氧化铵，氢氧化铵的容量为150ml，第二次升温至50°C，搅拌的时间为6小时，在萃取时进行三次萃取，辱次采用300ml的乙酸乙酯进行萃取；在洗涤时进行2次洗涤，每次采用200ml的有机相用饱和盐水进行洗涤，最后得到的氨基酸为12.5g。
4.根据权利要求1所述的埃博霉素B-内酰胺衍生物合成方法，其特征是所述的步骤三中四氢呋喃为500ml和氨基酸12.5g,碳酸钠为15g, 二苯基磷酰基叠氮化物为20ml,保温搅拌的时间为24小时，磷酸二氢钠溶液为200ml，磷酸二氢钠溶液冷却的温度0_3°C，磷酸二氢钠溶液与四氢呋喃、氨基酸和碳酸钠混合搅拌的时间为2小时，乙酸乙酯的温度为(T3°C在萃取时进行三次萃取，每次采用500ml的乙酸乙酯进行萃取，最后得到的埃博霉素B内酰胺衍生物为5.6g。
5.根据权利要求1所述的埃博霉素B-内酰胺衍生物合成方法，其特征是所述的步骤四中埃博霉素B内酰胺衍生物为5.6g，四氢呋喃为300ml，饱和盐水为200ml，饱和盐水清洗搅拌的时间为20分钟，在萃取时进行三次萃取，每次采用250ml的乙酸乙酯进行萃取，两次纯化的过程为:第一次色谱纯化，色谱纯化在l0~60cm的二氧化娃上采用3-5%甲醇-氯仿进行梯度洗脱，第二次为制备型HPLC纯化，它采用6-55%甲醇-氯仿梯度洗脱，最后得到纯埃博霉素B内酰胺衍生物 4.8g。
【文档编号】C07D491/044GK103936748SQ201410192288
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年5月8日 优先权日:2014年5月8日
【发明者】贺正全, 安丰, 蔡泽贵 申请人:成都摩尔生物医药有限公司