一种适用于工业生产的1-脱氧野尻霉素的制备方法
【专利摘要】一种适用于工业生产的1-脱氧野尻霉素的制备方法，包括以下步骤：（1）原料前处理：将干燥原料桑叶粉碎；（2）酶解：向粉料中加入水，升温，加入组合酶酶解，过滤；（3）连续组合提取：将滤渣使用3-4个提取装置连续组合提取，合并提取液，过滤；（4）醇沉、离心：减压浓缩至原体积的1/3-1/2，冷却，调节pH，加入醇溶液，搅拌，静置，管式离心；（5）膜滤：在常温压力25-35bar条件下，使用有机超滤膜进行超滤处理，然后在常温压力0.5-1.5MPa条件下，使用纳滤膜进行纳滤处理；（6）浓缩；（7）干燥。利用本发明可实现很大程度地降低溶剂损耗量、降低能耗、提高产品收率，适用于工业生产。
【专利说明】一种适用于工业生产的1-脱氧野尻霉素的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种1-脱氧野尻霉素的制备方法，尤其涉及一种适用于工业生产的1-脱氧野尻霉素的制备方法。
【背景技术】
[0002]桑叶，别名铁扇子，是桑科植物桑(Morus alba L.)的干燥叶，在我国分布较广并大量种植，长期以来，桑叶主要应用于两个方面，一是桑蚕的饲养，一是入中药，被认为具有疏散风热、清肝明目、凉血止血、清肺润燥等功效。作为一种卫生部批准的药食两用的植物，随着研究的深入，表明桑叶中含有黄酮类、生物碱类、氨基酸、维生素以及矿物质等活性物质，其中一种哌啶类生物碱1-脱氧野尻霉素(DNJ)被广泛关注，被证实具有明显的降血糖功效，现代药理学发现1-脱氧野尻霉素降血糖的机理主要是其能够作为多种α -糖苷酶的抑制剂，可以阻止淀粉等多糖分 解成葡萄糖或其他单糖。相对于其他药物，1-脱氧野尻霉素具有安全性高、依赖性小等特点，倍受青睐，将有望取代传统降血糖药物。
[0003]目前，关于从桑叶中提取1-脱氧野尻霉素(DNJ)的方法较多，如申请号为200710067498.3的中国专利申请公开了一种从桑叶中提取1_脱氧野尻霉素的方法，该方法是将桑叶粉碎后进行提取、无机酸进行酸化，然后过阳离子交换树脂，氨醇洗脱，经浓缩干燥，得含量为10%以上的DNJ产品，其工艺虽简单，但过阳离子交换树脂，损失较大；申请号为201210190238.6中国专利申请公开了一种利用滤膜和树脂制备桑叶1_脱氧野尻霉素提取物的方法，该方法是将桑叶进行提取、浓缩、微孔过滤、经有机超滤膜过滤后，然后过大孔吸附树脂以及阳、阴离子交换树脂，最后浓缩、干燥得产品，产品纯度可达50%以上，该方法的缺陷是工艺繁琐、过程复杂，设备投入大，不利工业生产；申请号为201210411230.8的中国专利申请公开了一种从桑叶中提取制备1-脱氧野尻霉素的工艺方法，该方法是将药材粉碎后进行提取、醇沉过滤，然后依次过大孔树脂、阳离子交换树脂，经浓缩、硅胶吸附、解吸以及干燥可得DNJ纯度70%以上产品，该方法存在工艺复杂，收率低，成本高等缺陷。
[0004]就上述方法而言，大多为致力于提高1-脱氧野尻霉素的纯度，对于生产的实际操作与成本控制方面关注不够，所以，现有真正适用于工厂生产的技术较少。
【发明内容】
[0005]本方法所要解决的技术问题是，提供一种以干燥桑叶为原料的适用于工业生产的1-脱氧野尻霉素的制备方法，该方法可实现很大程度地降低溶剂损耗量、降低能耗、提高产品收率，最终制备出低成本的含量12%以上的1-脱氧野尻霉素产品。
[0006]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种适用于工业生产的1-脱氧野尻霉素的制备方法，包括以下步骤:
(1)原料前处理:将干燥原料桑叶粉碎至20-40目，得粉料；
(2)酶解:向步骤(1)所得的粉料中加入干燥原料重量6-10倍的水，升温至40-50°C，然后加入干燥原料重量的0.05-0.20%的组合酶，酶解3-5h，过滤，得滤渣；(3)连续组合提取:将步骤(2)所得的滤渣使用3-4个提取装置连续组合提取，每个提取装置中的滤渣提取3-4次，每次提取所用溶剂为干燥原料重量6-9倍的亲水溶剂，提取温度为70-90°C，提取时间为1.8-2.2h，提取后，合并提取液，过滤；
所述亲水溶剂为含酸性溶液的亲水溶剂，所述酸性溶液的体积分数为0.2-0.4% ；
(4)醇沉、离心:将经步骤(3)过滤后的提取液进行减压浓缩，浓缩至原体积的1/3-1/2，冷却至20-30°C，用质量分数为1-2%的碱液调节pH至8_9，然后加入相当于调节PH值后浓缩液重量3-4倍的醇溶液，搅拌10-15min后，静置3_4h，管式离心，离心速率为10000-14000r/min，得离心液；
(5)膜滤:将步骤(4)所得的离心液常温下在压力为25-35bar条件下，使用孔径为5-10kDa的有机超滤膜进行超滤处理，得超滤透过液，然后常温下在压力为0.5-1.5MPa条件下，使用孔径为300-800Da (道尔顿)的纳滤膜进行纳滤处理，得纳滤透过液；
(6)浓缩:将步骤(5)所得的纳滤透过液进行减压浓缩，浓缩至原体积的1/4-1/6，得浓缩液；
(7)干燥:将步骤(6)所得的浓缩液进行干燥后，即得产品。
[0007]进一步，步骤(2)中，加入的组合酶为纤维素酶与果胶酶，其中纤维素酶:果胶酶=2-4:1, w/w0
[0008]进一步，步骤(3)中，所述亲水溶剂为甲醇或乙醇，所述酸性溶液为质量分数37.5%的盐酸、质量分数98%的硫酸或甲酸。
[0009]进一步，步骤(4)中，所述减压浓缩的温度为60-80 °C，真空度为-0.08 ~-0.04MPa。
[0010]进一步,步骤(4)中,所述碱液为氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液或碳酸氢钠溶液。
[0011]进一步，步骤(4)中，所述醇溶液为体积分数80-95%的乙醇溶液。
[0012]进一步，步骤(5)中，所用超滤膜的材质为聚碳酸酯、聚砜或聚丙烯腈；所用纳滤膜的材质为CA (醋酸纤维素)膜、CTA (三醋酸纤维素)膜或芳族聚酰胺复合膜。
[0013]进一步，步骤(6)中，所述减压浓缩的温度为70-80 °C，真空度为-0.08 ~-0.06MPa。
[0014]进一步，步骤(7)中，所述干燥为真空干燥或喷雾干燥。
[0015]步骤(3 )中，所述连续组合提取是一种同时使用几套提取装置，上一提取装置提取液最大限度的应用于下一提取装置的提取溶剂的一种提取方式。
[0016]假定连续提取由三个提取装置为一个组合来进行的，三个提取装置编号分别为A、B、C，对每一个提取装置所投入的药材原料均进行3次提取处理，第1次提取使用的溶剂量为原料重量的9倍:
(1)将A的第1次提取液直接送至后续工序；
(2)将A的第2次提取液(加入溶剂为原料重量的7倍)加入B,作为B的第1次提取溶剂，B的第1次提取液送至后续工序；
(3)将A的第3次提取液(加入溶剂为原料重量的9倍)加入B,作为B的第2次提取溶剂，B的第2次提取液加入C，作为C的第1次提取溶剂，C的第1次提取液送至后续工序；
注:此时A中原料已经完成3次提取，出渣，将投入新的原料出中原料已经完成2次提取，还需加入溶剂提取第3次；C中原料已经完成了 I次提取，待B中第3次提取液出来后将进行第2次提取；
接下来向B中加入原料重9倍的溶剂，进行第3次提取，第3次提取液作为C中第2次提取溶剂，而C中第2次提取液出来后，将作为A中新的原料的第1次提取溶剂，A中第1次提取液送至后续工序；如此连续循环，即A、B、C中任何第1次提取得提取液将直接送入后续工序操作，第2次提取将作为下一罐中第3次的提取溶剂，而第3次提取液又作为下一罐中第1次提取的提取溶剂，整个组合中，只有第1次提取液送至下一工序，只在第3次提取时，加入新的提取溶剂。
[0017]利用本发明所得到的桑叶提取物产品，经高效液相色谱法检测，产品中DNJ含量达12%以上，得率0.7%以上。
[0018]本发明具有以下优点:
(1)利用醇沉以及膜滤技术从桑叶原料中提取分离出纯度达12%以上的DNJ产品，实现1-脱氧野尻霉素的有效 分离；
(2)利用酶解方法提高溶剂溶出效率，进而提高产品的得率，产品得率0.7%以上；
(3)使用连续组合提取的提取方式进行提取，可大大节约溶剂的使用和损耗，保证得率的同时，提高了提取效率，很大程度上降低了生产成本；
(4)过程简单、设备要求较低，操作安全，适合工厂生产；
(5)整个过程没有使用任何对人体有害的有机溶剂，环保安全。
【具体实施方式】
[0019]以下结合实施例对本发明作进一步说明。
[0020]实施例1
本实施例包括以下步骤:
(1)原料前处理:将IOOkg干燥原料桑叶粉碎，过24目筛，得粉料99.5kg ；
(2)酶解:向步骤(1)所得的粉料中加入600kg水，升温至50°C，然后加入200g的组合酶(纤维素:果胶酶=4:1，w/w)，保持温度酶解5h，过滤，得滤渣；
(3)连续组合提取:将步骤(2)所得的滤渣均分4份，分别置于4套提取装置中进行连续组合提取，对每个提取装置中的滤渣提取4次，每次提取溶剂为干燥原料重量9倍的体积分数80%的乙醇(含体积分数为0.4%的盐酸，盐酸的质量分数37.5%)，提取温度为85°C，提取时间为2.2h,提取后,合并提取液,过滤；
(4)醇沉、离心:将经步骤(3)过滤后的提取液进行减压浓缩，减压浓缩的温度为65°C，真空度为-0.06MPa，浓缩至原体积的1/3，得595kg浓缩液，向浓缩液中加入质量分数为2%的氢氧化钠溶液，调节PH为8.5，然后加入1800kg体积分数80%的乙醇溶液，搅拌15min后，静置4h，管式离心，速率为14000r/min，得离心液；
(5)膜滤:将步骤(4)所得的离心液过聚碳酸酯超滤膜，压力为25-35bar，孔径为IOkDa,得超滤液，然后使用聚酰胺复合膜进行纳滤处理，压力为0.5-1.0MPa，孔径为600~800Da，得纳滤液；
(6)浓缩:将步骤(5)所得的纳滤液进行减压浓缩，减压浓缩的温度为70°C，真空度为-0.08MPa，浓缩至原体积的1/6，得浓缩液297kg ；
(7)干燥:将所得的浓缩液进行喷雾干燥，得成品797g,含量12.18%。[0021]实施例2
本实施例包括以下步骤:
(I)原料前处理:将IOOkg干燥原料桑叶粉碎，过24目筛，得99.5kg粉料；
(2 )酶解:向步骤(1)所得的粉料中入800kg水，升温至500C，再加入50g的组合酶(纤维素:果胶酶=2:1，w/w)，保持温度酶解3h，过滤，得滤渣；
(3)连续组合提取:将步骤(2)所得的滤渣均分3份，分别置于3套提取装置中进行连续组合提取，对每个提取装置中的滤渣提取3次，每次提取溶剂为干燥原料重量6倍的体积分数50%的乙醇(含体积分数含0.2%的盐酸，盐酸的质量分数37.5%)，提取温度为70°C，提取时间为1.8h,提取后，合并提取液，过滤；
(4)醇沉、离心:将经步骤(3)过滤后的提取液减压浓缩，减压浓缩的温度为65°C，真空度为-0.06MPa,浓缩至原体积的1/2，得510kg浓缩液，向浓缩液中加入质量分数为2%的碳酸钠溶液，调节PH为8.0，然后加入1600kg体积分数为80%的乙醇溶液，搅拌15min后，静置3h，管式离心，离心速率为14000r/min，得离心液；
(5)膜滤:将步骤(4)所得的离心液过聚砜超滤膜，压力为25-35bar，孔径为5kDa，得超滤液，然后使用CA进行纳滤处理，压力为1.0-1.5MPa，孔径为300_600Da，得纳滤液；
(6)浓缩:将步骤(5)所得的纳滤液进行减压浓缩，减压浓缩的温度为80°C，真空度为-0.08MPa，浓缩至原 体积的1/6，得浓缩液324kg ；
(7)干燥:将所得的浓缩液进行喷雾干燥，得成品732g,含量13.88%ο
[0022]实施例3
本实施例包括以下步骤:
(1)原料前处理:将IOOkg干燥原料桑叶粉碎，过24目筛，得粉料99.6kg ；
(2)酶解:向步骤(1)所得的粉料中加入600kg水，升温至50°C，然后加入100g的组合酶(纤维素:果胶酶=4:1，w/w)，保持温度酶解5h，过滤，得滤渣；
(3)连续组合提取:将步骤(2)所得的滤渣均分3份，分别置于3套提取装置中进行连续组合提取，对每个提取装置中的滤渣提取4次，每次提取溶剂为干燥原料重量9倍的体积分数80%的乙醇(含体积分数为0.4%的盐酸，盐酸的质量分数37.5%)，提取温度为85°C，提取时间为2.2h,提取后,合并提取液,过滤；
(4)醇沉、离心:将经步骤(3)过滤后的提取液进行减压浓缩，减压浓缩的温度为65°C，真空度为-0.06MPa，浓缩至原体积的1/3，得525kg浓缩液，向浓缩液中加入质量分数为2%的氢氧化钠溶液，调节PH为8.5，然后加入1600kg体积分数80%的乙醇溶液，搅拌15min后，静置4h，管式离心，速率为14000r/min，得离心液；
(5)膜滤:将步骤(4)所得的离心液过聚碳酸酯超滤膜，压力为25-35bar，孔径为IOkDa,得超滤液，然后使用聚酰胺复合膜进行纳滤处理，压力为0.5-1.0MPa，孔径为600~800Da，得纳滤液；
(6)浓缩:将步骤(5)所得的纳滤液进行减压浓缩，减压浓缩的温度为70°C，真空度为-0.08MPa，浓缩至约原体积的1/4，得浓缩液497kg ；
(7)干燥:将所得的浓缩液进行喷雾干燥，得成品756g，含量12.73%。
[0023]实施例4
本实施例包括以下步骤:(1)原料前处理:将IOOkg干燥原料桑叶粉碎，过24目筛，得粉料99.7kg ；
(2)酶解:向步骤(1)所得的粉料中加入800kg水，升温至50°C，再加入50g的组合酶(纤维素:果胶酶=2:1，w/w)，保持温度酶解3h，过滤，得滤渣；
(3)连续组合提取:将步骤(2)所得的滤渣均分4份，分别置于4套提取装置中进行连续组合提取，对每个提取装置中的原料提取4次，每次提取溶剂为干燥原料重量6倍的体积分数50%的乙醇(含体积分数含0.2%的盐酸，盐酸的质量分数37.5%)，提取温度为70°C，提取时间为1.8h，提取后，合并提取液并过滤；
(4)醇沉、离心:将经步骤(3)过滤后的提取液减压浓缩，减压浓缩的温度为65°C，真空度为-0.06MPa，浓缩至原体积的1/2，得586kg浓缩液，向浓缩液中加入质量分数为2%的碳酸钠溶液，调节PH为8.0，然后加入2300kg体积分数为85%的乙醇溶液，搅拌15min后，静置3h，管式离心，离心速率为14000r/min，得离心液；
(5)膜滤:将步骤(4)所得的离心液过聚砜超滤膜，压力为25-35bar，孔径为5kDa，得超滤液，然后使用 CA进行纳滤处理，压力为1.0-1.5MPa，孔径为300_600Da，得纳滤液；
(6)浓缩:将步骤(5)所得的纳滤液进行减压浓缩，减压浓缩的温度为80°C，真空度为-0.08MPa，浓缩至原体积的1/6，得浓缩液461kg ；
(7)干燥:将所得的浓缩液进行喷雾干燥，得成品771g,含量12.45%ο
【权利要求】
1.一种适用于工业生产的1-脱氧野尻霉素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (O原料前处理:将干燥原料桑叶粉碎至20-40目，得粉料； (2)酶解:向步骤(1)所得的粉料中加入干燥原料重量6-10倍的水，升温至40-50°C，然后加入干燥原料重量的0.05-0.20%的组合酶，酶解3-5h，过滤，得滤渣； (3)连续组合提取:将步骤(2)所得的滤渣使用3-4个提取装置连续组合提取，每个提取装置中的滤渣提取3-4次，每次提取所用溶剂为干燥原料重量6-9倍的亲水溶剂，提取温度为70-90°C，提取时间为1.8-2.2h，提取后，合并提取液，过滤； 所述亲水溶剂为含酸性溶液的亲水溶剂，所述酸性溶液的体积分数为0.2-0.4% ； (4)醇沉、离心:将经步骤(3)过滤后的提取液进行减压浓缩，浓缩至原体积的1/3-1/2，冷却至20-30°C，用质量分数为1-2%的碱液调节pH至8_9，然后加入相当于调节PH值后浓缩液重量3-4倍的醇溶液，搅拌10-15min后，静置3_4h，管式离心，离心速率为10000-14000r/min，得离心液； (5)膜滤:将步骤(4)所得的离心液常温下在压力为25-35bar条件下，使用孔径为5-10kDa的有机超滤膜进行超滤处理，得超滤透过液，然后常温下在压力为0.5-1.5MPa条件下，使用孔径为300-800Da的纳滤膜进行纳滤处理，得纳滤透过液； (6)浓缩:将步骤(5)所得的纳滤透过液进行减压浓缩，浓缩至原体积的1/4-1/6，得浓缩液； (7)干燥:将步骤(6)所得的浓缩液进行干燥后，即得产品。
2.根据权利要求1所述的适用于工业生产的1-脱氧野尻霉素的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，加入的组合酶为纤维素酶与果胶酶，其中纤维素酶:果胶酶=2-4:1，w/w。
3.根据权利要求1或2所述的适用于工业生产的1-脱氧野尻霉素的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述亲水溶剂为甲醇或乙醇，所述酸性溶液为质量分数37.5%的盐酸、质量分数98%的硫酸或甲酸。
4.根据权利要求1或2所述的适用于工业生产的1-脱氧野尻霉素的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述减压浓缩的温度为60-80°C，真空度为-0.08~-0.04MPa。
5.根据权利要求1或2所述的适用于工业生产的1-脱氧野尻霉素的制备方法，其特征在于，步骤(4)中,所述碱液为氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液或碳酸氢钠溶液。
6.根据权利要求1或2所述的适用于工业生产的1-脱氧野尻霉素的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述醇溶液为体积分数80-95%的乙醇溶液。
7.根据权利要求1或2所述的适用于工业生产的1-脱氧野尻霉素的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所用超滤膜的材质为聚碳酸酯、聚砜或聚丙烯腈；所用纳滤膜的材质为CA膜、CTA膜或芳族聚酰胺复合膜。
8.根据权利要求1或2所述的适用于工业生产的1-脱氧野尻霉素的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述减压浓缩的温度为70-80°C，真空度为-0.08~-0.06MPa。
9.根据权利要求1或2所述的适用于工业生产的1-脱氧野尻霉素的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，所述干燥为真空干燥或喷雾干燥。
【文档编号】C07D211/46GK103965096SQ201410192731
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月9日 优先权日:2014年5月9日
【发明者】唐方华, 黄华学, 刘永胜 申请人:湖南华诚生物资源有限公司