信使rna帽的抗-反向硫代磷酸类似物的合成和用途
【专利摘要】本发明公开了新的RNA帽类似物，其包含一个或多个硫代磷酸基团。所述类似物还在7-甲基鸟苷的2’-O位置处包含修饰，其防止它们在mRNA的体外合成过程中以相反的方向掺入，并因此是“抗-反向帽类似物”(anti-reverse?cap?analog，ARCA)。所述ARCA修饰确保，S原子在翻译和脱帽机器中都准确地定位在帽结合蛋白的活性位点内。所述新的S-ARCA类似物对于体内脱帽酶具有抗性。有些S-ARCA具有相比于不包含硫代磷酸基团的相应类似物而言更高的对于eIF4E的亲和力。当将包含各种S-ARCA的mRNA引入培养的细胞中时，有些mRNA以相比于用常规类似物m7GpppG合成的mRNA而言高至五倍的程度有效地进行翻译。
【专利说明】信使RNA帽的抗-反向硫代磷酸类似物的合成和用途
[0001]本申请是申请日为2008年6月19日、申请号为200880102959.9、发明名称为“信使RNA帽的抗-反向硫代磷酸类似物的合成和用途”的发明专利申请的分案申请。
[0002]Jacek Jemielity, Ewa M.Grudzien-Nogalska, Joanna Kowalska, EdwardDarzynkiewicz,和 Robert E.Rhoads
[0003]文件编号:Jemielity07S01W
[0004]在美国中根据35U.S.C.§ 119(e)，和在所有国家中根据适用的条约和公约，要求2007年6月19日提交的临时美国申请系列号60/944,842的提交日期的权益。
[0005]本发明的开发部分地在由国家综合医学研究所(Nat1nal Institute of GeneralMedical Sciences)给予的基金号R01GM20818下得到美国政府的资助。美国政府享有本发明中的某些权利。
[0006]本发明的开发部分地在由波兰科学和高等教育部(Polish Ministry of Scienceand Higher Educat1n)给予的基金号2P04A00628下得到波兰政府的资助。
【技术领域】
[0007]合成了新的信使RNA帽的抗-反向(ant1-reverse)硫代磷酸类似物,并且显示在mRNA的翻译中是有用的。
技术背景
[0008]在真核细胞中，大多数信使RNA(mRNA)的5’末端被封闭，或“帽化(加帽)”。此外，还存在有一些也被帽化的其他形式的RNA，例如核内小RNA(snRNA)。所述帽包含有在两个核苷部分之间的5’ -5’三磷酸键合和远端鸟嘌呤环上的7-甲基。mRNA和snRNA的帽化促进其在细胞中的正常功能。
[0009]能够在体外合成加帽的RNA分子是有用的，因为这使得工作人员能够制备在各种生物学应用中表现适当的RNA分子。此类应用包括多肽的研究应用和商业生产，例如，在无细胞翻译体系中产生在特定位点包含“非天然”氨基酸的多肽，或在培养的细胞中产生就其活性或稳定性而言需要翻译后修饰的多肽。在后者体系中，合成进行显著更长的时间，并因此产生更多的蛋白质。
[0010]最经常用来在体外制备加帽的RNA的方法是，在所有四种核糖核苷三磷酸和帽二核苷酸例如m7G(5’)ppp(5’)G(此后，m7GpppG)存在下用细菌或噬菌体RNA聚合酶来转录DNA模板。聚合酶以下列方式来起始转录:m7GpppG的Guo部分的3’ -OH对于下一个由模板所决定的核苷三磷酸上的ct -磷酸发动亲核攻击，从而导致产生初始产物m7GpppGpN。通过在转录反应混合物中将m7GpppG与GTP的比率设定为在5和10之间来遏制备选的、由GTP起始的产物pppGpN。
[0011 ] 合成RNA可以通过DNA模板的无细胞转录来合成。参见R.Contreras等人,“Simple, efficient in vitro synthesis of capped RNA useful for directexpress1n of cloned eukaryotic genes,，，Nucl.Acids Res.,第 10 卷，第 6353-6362页(1982) ;J.Yisraeli 等人，“Synthesis of long, capped transcripts in vitro bySP6and T7RNA polymerases,第 42-50 页，在 J.Dahlberg 等人(编辑)，Meth.Enzymo1.，第 180 卷，第 42-50 页(1989)中；和 D.Melton 等人，“Efficient in vitro synthesis ofb1logically active RNA and RNA hybridizat1n probes from plasmids containinga bacter1phage SP6promoter，，，Nucl.Acids Res.，第 12 卷，第 7035-7056 页(1984)。
[0012]如此产生的加帽的RNA在体外进行的剪接反应中是有活性的。参见M.Konarska等人，“Recognit1n of cap structure in splicing in vitro of mRNA precursors.Cell,第 38 卷，第 731-736 页(1984);和 1.Edery 等人，“Cap-dependent RNA splicing in aHeLa nuclear extract，，，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA，第 82 卷，第 7590-7594 页(1985)。
[0013]加帽的mRNA在无细胞翻译体系中比非加帽的mRNA更有效地被翻译。参见 S.Muthukrishnan 等人，“5’-Terminal7_methylguanosine in eukaryoticmRNA is required for translat1n，，，Nature，第 255 卷，第 33-37 页(1975)；L.Chu 等人，“Paradoxical observat1ns on the5’ terminus of ovalbuminmessenger ribonucleic acid，，，J.B1l.Chem.，第 253 卷，第 5228-5231 页(1978)；
E.Darzynkiewicz 等人，“ β-Globin mRNAs capped with m7G, m22' 7G or m32'2'7G differin intrinsic translat1n efficiency，，，Nucl.Acids Res.,第 16 卷，第 8953-8962页(1988)；和 Ε.Darzynkiewicz 等人，“Inhibit1n of eukaryotic translat1n bynucleoside5’-monophosphate analogues of mRNA5’-cap:Changes in N7substituentaffect analogue activity，” B1chem.，第 28 卷，第 4771-4778 页(1989)。
[0014]5’-未甲基化的mRNA在翻译上的活性比5’-甲基化的mRNA低。参见G.Both等人，“Methylat1n-dependent translat1n of viral messenger RNAs in VitrojnProc.Natl.Aca d.Sc1.USA,第 72 卷，第 1189-1193 页(1975)。
[0015]通过电穿孔引入培养的哺乳动物细胞中的加帽的mRNA比非加帽的mRNA更有效地被翻译。参见 E.Grudzien 等人，“Differential inhibit1n of mRNA degradat1npathways by novel cap analogs, ” J.B1l.Chem.，第 281 卷，第 1857-1867 页(2006) ?
[0016]A.Pasquinelli 等人，“Reverse5，caps in RNAs made in vitro by phage RNApolymerases, ”RNA，第I卷，第957-967页(1995)报道了，嗷菌体聚合酶使用m7GpppG的7-甲基鸟嘌呤部分的3’-OH来起始转录，这证明用该帽类似物制备的RNA产物中的大约三分之一至一半实际上包含相反方向的帽，即Gpppm7GpN。此类反向帽化的RNA分子表现异常。相同的作者报道，当将反向帽化的Pre-UlsnRNA转录物注射入光滑爪蟾(Xenopuslaevis)细胞核中时，它们比天然转录物更慢地被输出。类似地，细胞质中的胞质反向帽化的UlsnRNA不被正确地输入到细胞核中。
[0017]mRNA上帽的存在强烈地剌激mRNA转录物翻译成蛋白质。E.Grudzien等人，“Novel cap analogs for in vitro synthesis of mRNAs with high translat1nalefficiency, "RNA,第10卷，第1479-1487页(2004)证明，包含有专一地以相反方向掺入的帽的mRNA在无细胞体系中仅以包含有专一地以正常方向掺入的帽的mRNA的效率的4%进行翻译。
[0018]J.Stepinski 等人，“Synthesis and properties of mRNAs containingthe novel ‘ant1-reverse’ cap analogues7-methyl (3’ -0-methyl)GpppGand7-methyl (3，-deoxy)GpppG, ”RNA,第 7 卷，第 1486-1495 页(2001)报道了不能以相反方向掺入的两种新型帽类似物，m73’ dGpppG和m/’3’_°GpppG，的合成和用途。用这些“抗_反向帽类似物”(ant1-reverse cap analog, ARCA)帽化的mRNA在体外体系中比用常规类似物m7GpppG帽化的mRNA更有效地被翻译。还可参见，美国专利号7，074, 596，和美国专利申请公开 2003/0194759。
[0019]Z.Peng 等人,“Synthesis and applicat1n of a chain-terminatingdinucleotide mRNA cap analog,，，Org.Lett.,第 4 卷，第 161-164 页(2002)报道了m/’3’_°GpppG的合成以及其在均一地加帽的RNA的体外转录中的用途。
[0020]J.Jemielity 等人，^Novel' ant1-reverse' cap analogues with super1rtranslat1nal properties, "RNA,第 9 卷，第 1108-1122 页(2003)报道，用-OCH3 或-H在2’位进行取代以分别产生m/’2’_°GpppG或m72’ dGpppG，这产生了具有与在3’位取代的ARCA的性质相等或稍微更有利的性质的ARCA，如通过与翻译帽结合蛋白eIF4E的结合，在体外转录期间向mRNA中的正确掺入，以及在无细胞体系中所得的mRNA的翻译效率这样的标准所测量的。
[0021]从引入培养的哺乳动物细胞中的合成mRNA所产生的蛋白质的量受限于通过天然周转过程的mRNA降解。mRNA降解的主要体内途径通过由特异的焦磷酸酶Dcpl/Dcp2(其在α和β磷酸之间进行切割)从完整的mRNA上去除帽来起始。E.Grudzien等人"Differential inhibit1n of mRNA degradat1n pathways by novel cap analogs, 〃J.B1l.Chem.，第281卷，第1857-1867页(2006)设计并合成了其中亚甲基替代了 α和β磷酸基团之间的O原子的帽类似物，m/’3’ -°GpPai2pG，用该类似物帽化的mRNA在体外对于通过重组人Dcp2的水解具有抗性。当引入培养的细胞中时，用m27’3’_°GpPc:H2pG帽化的mRNA比用m/’3 _°GpppG帽化的mRNA更为稳定。
[0022]存在两种已知的脱帽酶:DCpl/DCp2，其作用于完整的mRNA以起始5’ 一 3’降解；和DcpS，其作用于由于3’ 一5’降解而产生的短的加帽的寡核苷酸。因为Dcpl/Dcp2或单独的Dcp2从加帽的mRNA上释放miDP，所以切割可能发生在α-和β-磷酸之间。参见 Ζ.Wang 等人,"The hDcp2protein is a mammalian mRNA decapping enzyme, 〃Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，第 99 卷，第 12663-12668 页(2002)。先前，显示了，核苷 5’ -单硫代磷酸以及三磷酸类似物例如ATP Y S、GTP Y S和⑶P β S，对于磷酸酶是稳定的。参见
F.Eckstein 等人，〃Guanosine5’ -O- (2-th1diphosphate).An inhibitor of adenylatecyclase stimulat1n by guanine nucleotides and fluoride 1ns〃，J.B1l.Chem.，第254 卷，第 9829-9834 页(1979)，和 D.Cassel 等人，"Activat1n of turkey erythrocyteadenylate cyclase and blocking of the catecholamine-stimulated GTPase byguanosine5’- (gamma-th1) triphosphate'B1chem B1phys Res Communj 第 77 卷，第868-873页(1977)。此外，还发现包含硫代磷酸核苷酸间键合的多核苷酸比其天然对应物更缓慢地被降解?参见H.Matzura等人，〃A polyribonucleotide containing alternat1nP = O and P = S linkages"，Eur.J.B1chem.，第 3 卷，第 448-452 页(1968)。令人感兴趣的是，硫代磷酸的非对映异构体可以显示出不同的对于核酸酶的敏感性。核酸酶Pl水解Sp非对映异构体比Rp更快。参见B.Potter等人，"Synthesis and configurat1nal analysisof a dinucleoside phosphate isotopically chiral at phosphorus.Stereochemicalcourse of Penicillium citrum nuclease Plreact1n.〃，B1chemistry,第 22 卷，第1369-1377页(1983)。相比于Sp，核糖核酸酶Tl和蛇毒磷酸二酯酶优先切割Rp非对映异构体。参见 F.Eckstein 等人，"Stereochemistry of the transesterificat1n step ofribonuclease Tl〃，B1chemistry,第 11 卷，第 3507-3512 页(1972),和 P.Burgers 等人，"Absolute Configurat1n of the Diastereomers of Adenosine5’-0-(1-th1triphosphate): Consequences for the stereochemistry of polymerizat1n by DNA-dependentRNA polymerase from Escherichia coli^, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,第 75 卷，第4798-4800 页(1978)。
[0023]虽然用m/’3’ ^0GPPch2PG帽化的mRNA在培养的细胞中更为稳定，但是它具有较低的翻译效率，推测这是因为m/’3^0GPPch2PG在体外以比m/’ 3’_°GpppG显著更低的亲和力与eIF4E结合。因此，即使它在培养的细胞中更为稳定，但这个优点却被较低的翻译效率给抵消了。
[0024]J.Kowalska等人〃Synthesis and properties of mRNA cap analogs containingphosphoroth1ate moiety in5’，5’-triphosphate chain,"Nucleos.Nucleot.Nucl.Acids,第24卷，第595-600页(2005)报道了其中用S替代α、β或y磷酸部分中的O的三种帽类似物的合成，例如m7GpsppG、m7GpppsG和n/GpPf^pG。这些合成的硫代磷酸帽类似物是帽依赖性翻译的更加稳定的抑制剂，并且对于DcpS脱帽酶具有抗性。然而，无论在体外还是在体内，这些化合物并没有显示出比平常ARCA更高的翻译效率，因为它们可能在很大程度上以相反方向掺入。
[0025]存在对于这样的修饰的需要，所述修饰将可能达到更高的翻译效率和增加对于体内和体外降解的抗性。本文所报道的独特的化合物可以做到这两者。
【发明内容】
[0026]我们发现，在一个或多个磷酸处的S-取代连同2’ -O甲基取代一起产生具有令人惊讶的性质的被称为S-ARCA的新型类似物。所述新的ARCA修饰确保，α、β和Y硫代磷酸基团在翻译和脱帽机器(machinery)中都准确地定位在帽结合蛋白的活性位点内。这些类似物中的至少一些对于Dcpl/Dcp2具有抗性。有些S-ARCA具有相比于缺乏硫代磷酸基团的相应类似物而言高得多的对于eIF4E的亲和力。当将包含各种S-ARCA的mRNA弓丨入培养的细胞中时，有些mRNA以相比于用常规类似物m7GpppG合成的mRNA而言高至五倍的程度更有效地进行翻译。此外，用有些S-ARCA帽化的mRNA的半寿期长至用未修饰的帽合成的mRNA的半寿期的三倍。更有效地进行翻译的mRNA和更稳定的mRNA的组合导致在经转染的细胞中获得比使用常规的合成mRNA或者使用以早期ARCA帽化的mRNA更高的报道蛋白的总产量。S-ARCA增加了体内稳定性和令人惊讶地增加了翻译效率，这是由于与Dcpl/Dcp2抗性相组合的更高的对于eIF4E的亲和力。令人惊讶地，在生理条件下对于通过Dcp2的水解的抗性与三磷酸中的β-硫代磷酸基团相关，并且预期也与四磷酸中的Y-硫代磷酸基团相关。另一个相比于平常ARCA而言的优点是出现P-非对映异构现象，这归因于硫代磷酸部分。在当硫代磷酸部分准确地定位于α-、β-或Y-位置处时的每种情况下，仍然存在两种可能性来放置硫原子(ProR和proS)，这导致获得具有可能不同的生物学活性的两种不同的非对映异构体。例如，在对应物Dl和D2非对映异构体和还有用m/’2’_°GppspG(Dl)帽化的mRNA之间存在有对于eIF4E的结合亲和力的显著差异，并且该Dl相比于其D2对应物而言对于Dcp2易感得多。因此，可以采用非对映异构体纯的S-ARCA作为P-手性探针，其可用于研究牵涉帽的酶促工艺步骤的立体化学过程。
[0027]附图简述
[0028]图1 描绘了 a S-ARCA m27’2’-0GpppsG (Dl 和 D2)的合成。
[0029]图2 描绘了 Y S-ARCA m27’2’ _°GpsppG(Dl 和 D2)的合成。
[0030]图3 描绘了 β S-ARCA m27’2’_°GppspG (Dl 和 D2)的合成。
[0031]图4 描绘了四磷酸 Y S-ARCA, m/’2’ _°GppsppG(Dl 和 D2)的合成。
[0032]图5描绘了在三磷酸桥的α和β位置处具有两个硫代磷酸部分的S-ARCA，m27’2’ -0GppspsG(Dl、D2、D3 和 D4)的合成。
[0033]图6A-6H描绘了用hDcp2消化的体外合成的寡核苷酸的阴离子交换HPLC分析。
[0034]图7描绘了用S-ARCA帽化的萤光素酶mRNA在HCll细胞中的衰变。
[0035]图8描绘了用S-ARCA帽化的mRNA在HCll细胞中的翻译效率。
[0036]图9A-9E描绘了用S-ARCA帽化的萤光素酶mRNA在HCll细胞中的多核糖体分布，显示为在蔗糖梯度中的沉降，通过监测260nm处的吸光度(A)，和通过使用实时PCR以显示萤光素酶mRNA (B、C和D)和GAPDH mRNA (E)的分布。
[0037]图10描绘了在用经S-ARCA帽化的mRNA对HCll细胞进行核穿孔(nucleoporat1n)后萤光素酶表达的时间过程。
[0038]本发明的实施方式
[0039]材料和方法
[0040]实施例1
[0041]一般的化学操作程序
[0042]使用在去离子水中的三乙基铵碳酸氢盐(TEAB)的线性梯度，在DEAD-S^hadexA-25(HC(T形式)柱上通过离子交换色谱法来分离开中间体核苷酸,并且在通过添加乙醇在减压下进行蒸发后，将其分离为三乙基铵盐。通过分析型或半制备型RP HPLC来分离开终产物(帽类似物)，并且在反复的冷冻干燥后，将其分离为铵盐。分析型HPLC在装备有Supelcosil LC-18-T 反相柱(4.6x250mm,流速为 1.3ml/分钟)的 Spectra-Physics SP8800装置上进行，其中使用在PH5.9的0.05M乙酸铵缓冲液中的0-25%甲醇线性梯度，并且采用在260nm处的UV-检测。半制备型HPLC在装备有WatersHR-C_18反相柱(19x300mm，流速为 5.0m/分钟)的 Waters600E Multisolvent Delivery System上进行，其中使用在 0.05M乙酸铵缓冲液(PH5.9)中的甲醇线性梯度，并且采用在260nm处的UV-检测。
[0043]GMP和⑶P购自Sigma-Aldrich,并且通过使用Dowex50WX8离子交换树脂而转化为三乙基铵盐。如先前在 J.Jemielity 等人"Novel’ant1-reverse’cap analogues withsuper1r translat1nal properties, "RNA,第 9卷，第 1108-1122 页(2003)中所报道的那样来制备其他核苷酸，即m7GMP、m/，_°GMP、m7OTP、m2^ _°GDP。硫代磷酸三乙基铵盐通过下列方式而从Na3PSO3制备:在Dowex50WX8离子交换树脂上进行转化,并且(在蒸发至干后)用忙存于-2(TC的99.8%乙醇进行再度蒸发。参见J Kowalska等人“A simple andrapid synthesis of nucleotide analogues containing a phosphoroth1ate moietyat the terminal posit1n of the phosphate chain，，，Tetrahedron Lett.,第 48 卷，第5475-5479页(2007)。如先前所报道的那样来制备7-甲基鸟苷，除了使用DMF而非DMA之外(参见 J.Jones 等人，“Purine Nucleosides.111.Methylat1n Studies of CertainNaturally Occurring Purine Nucleosides，，，J.Am.Chem.Soc.，第 85 卷，第 193-201 页(1963))。通过类似的操作程序，从2’ -O-甲基鸟苷来合成7，2’ -O-二甲基鸟苷。根据J.Kusmierek 等人，“A new route to2' (3')-0-alkyl purine nucleosides，，，NucleicAcids Res.，第I卷，第73-77页，特别出版号4(1978)来制备2，-O-甲基鸟苷。
[0044]通过在RP HPLC上的再次色谱法(re-chromatography)、使用负电喷雾电离的质谱法(MS ES1-)以及1H NMR和31P NMR光谱学，来确认最终化合物的结构和均一性。(结果显示在表1中)分别在399.94MHz和161.90MHz处在Varian UNITY-plus光谱仪上于25°C记录了1H NMR和31P NMR谱。报告了相对于在D2O中的3-三甲基甲硅烷基-[2，2，3，3-D4]-丙酸钠(TSP)(作为内标)的1H NMR化学位移。报告了相对于在D2O中的20%磷酸(作为外标)的31P NMR化学位移。使用负电喷雾电离(ES1-)，在Micromass QToFIMS光谱仪上记录了质谱。
[0045]实施例2
[0046]用于核苷酸的N-酰化咪唑(imidazolide)衍生物(GMP-1m、m/KGMP-1m、⑶P-1m和 m/’2’_°GDP-1m) (7、8 和 12-15)的一般操作程序
[0047]参见 T.Mukaiyama 等人 ^Phosphorylat1n by oxidat1n-reduct1ncondensat1n.Preparat1n of active phosphorylating reagents'M.Bull.Chem.Soc.Jpn,第44卷，2284(1971)。在DMF(约2.5ml/100mg核苷酸)中混合合适的核苷酸(I当量的TEA盐)、咪唑(8当量)和2，2’ -联硫基二吡啶(3当量)。添加三乙胺(2当量)和三苯膦(3当量)，并搅拌混合物6-8小时。用溶解在干燥的丙酮(约DMF)中的无水高氯酸钠(I当量/ 一个负电荷)从反应混合物中沉淀出产物。在冷却至4°C后，过滤沉淀物，用冷的干燥的丙酮反复洗涤，并在真空中通过P4Oltl进行干燥。产率为80-100%。在m7GMP的情况下，由于其较低的在DMF中的溶解度，使用2倍过量的试剂，并且将反应时间延长至24小时。
[0048]实施例3
[0049]用于核苷5' -O-硫代磷酸(9-11)的一般操作程序
[0050]将合适的核苷(I当量，在真空中通过？401(|过夜干燥)在磷酸三甲酯(1.5ml/100mg核苷)中的悬浮液在冰/水浴上冷却至(TC。添加2，6- 二甲基吡啶(3当量)和PSCl3 (1.5当量)。反应在(TC下维持过夜，然后用0.35M TEAB猝灭并在室温下搅拌I小时。使用0-0.7MTEAB的线性梯度，通过DEAE S印hadex色谱法来分离开产物。产率:(9)380mg(0.67mmol)，从 257mg (0.91mmol)鸟苷开始(74 % ) ； (10) 57mg (0.lOmmol),从 120mg (0.42mmol) 7-甲基鸟苷开始(24%) ;(ll)75mg(0.13mmol)，W70mg(0.23mmol)7，2' _0_ 二甲基鸟苷开始(53% )。
[0051]实施例4
[0052]核苷5' - (2-0-硫代二磷酸)的合成
[0053] 1,2' -O-二甲基鸟苷 5’-0-(2_硫代二磷酸)(17)。向 14 (lOOmg，0.21mmol)和硫代磷酸三乙基铵盐(220mg)在5ml DMF中的悬浮液之中添加无水ZnCl2 (190mg, 1.40mmol)。将所得的溶液在室温下搅拌20分钟。通过添加EDTA(520mg，1.40mmol)在50ml水中的溶液来猝灭反应，并用固体NaHCO3进行中和。使用0-1.0M的TEAB梯度，在DEAE S印hadex上分离产物。产率:106mg(0.15mmol)的(17)，作为 TEA 盐(71%)。
[0054]7-甲基鸟苷5' -0-(2-硫代二磷酸)(16)。如对于(17)所描述的那样，从
(13)(40mg,0.089mmol)和硫代磷酸三乙基铵盐(10mg)开始来合成该化合物。产率:31mg(0.046mmol)的(16)，作为 TEA 盐(52%)。
[0055]实施例5
[0056]帽S-ARCA的合成
[0057]下面是对于各种帽S-ARCA的合成的描述。合成途径描绘在图1、2和3中。(数字)是指在图1、2和3中进行编号的化合物。
[0058]m7GpppsG Dl 和 D2 (la, Ib)。向(9) (10mg,0.018mmo1)和 7 (15mg, 0.027mmol)在DMF (0.8ml)中的悬浮液之中添加无水ZnCl2 (30mg，0.22mmol)。反应在室温下维持2天。通过添加在1ml水中的90mg EDTA来猝灭反应，并用固体NaHCO3进行中和。通过分析型RPHPLC来分离开非对映异构体(Ia)和(Ib)。产率:0.8mg(la)和1.0mg(Ib)，作为NH4+盐。合成的流程图显示在图1中。
[0059]m7GppspG Dl和D2 (2a，2b)。如对于I所描述的那样，从在2ml DMF中的16 (20mg,
0.030mmol)、15 (23mg, 0.053mmol)、ZnCl2 (60mg, 0.44mmo1)开始来合成该化合物。产率:2.2mg(2a)和1.8mg (2b)，作为NH4+盐。合成的流程图显示在图3中。
[0060]m7GpsppG Dl和D2 (3a，3b)。如对于(I)所描述的那样，从在3.5ml DMF中的(10)(58mg, 0.090mmol)、(12) (120mg, 0.22mmol)、ZnCl2 (249mg, 1.8mmo1)开始来合成该化合物。产率:14.7mg(3a)和10.1mg (3b)，作为NH:盐。合成的流程图显示在图2中。
[0061]m/J -0GpppsG Dl 和 D2 (4a，4b)。将化合物(9) (48mg,0.084mmol)和(8) (57mg,
0.1Ommol)悬浮在2ml DMF中。随后,添加无水ZnCl2 (115mg,0.84mmol)。将所得的溶液在室温下维持2天。通过添加在30ml水中的350mg EDTA来猝灭反应，并用固体碳酸氢钠进行中和。在45分钟内，使用在0.05M乙酸胺(pH = 5.9)中的0-50%的甲醇线性梯度，通过半制备型RP HPLC来分离开产物。产率:5.2mg(4a)和7.4mg(4b)，作为NH:盐。合成的流程图显不在图1中。
[0062]m/夂-°GppspG Dl和D2 (5a，5b)。如对于(4)所描述的那样，从在5ml DMF中的
(17)(106mg, 0.1 Bmmol)、(15) (103mg, 0.24mmol)和 ZnCl2 (260mg, 1.Qmmol)开始来合成该化合物。用在10ml水中的800mg EDTA来猝灭反应，并用固体碳酸氢钠进行中和。使用等度的0.05M乙酸铵(pH = 5.9)，通过半制备型RP HPLC来分离开产物。产率:10.0mg (5a)和12.1mg (5b)，作为NH4+盐。合成的流程图显示在图3中。
[0063]m/’2 °GpsppG Dl和D2 (6a, 6b)。如对于(4)所描述的那样，从在3ml DMF中的
(11)(70mg, 0.15mmol)、(12) (107mg, 0.20mmol)和无水 ZnCl2 (220mg, 1.6mmol)开始来合成该化合物。用在70ml水中的650mg EDTA来猝灭反应。在45分钟内，使用在0.05M乙酸铵(pH = 5.9)中的0-50%的甲醇线性梯度，通过半制备型RP HPLC来分离开产物。产率:15mg(6a)和20mg (6b)，作为NH4+盐。合成的流程图显示在图2中。
[0064]通过在RP HPLC上的再次色谱法(re-chromatography)、使用负电喷雾电离的质谱法(MS ES1-)以及1H NMR和31P NMR光谱学，来确认上述最终化合物的结构和均一性。结果显示在下表1中。
[0065]表1
[0066]相对于内标3-三甲基甲硅烷基_[2，2，3，3_2H4]-丙酸钠的以百万分率表示的1H NMR化学位移(±0.01)以及相对于外SH3PO4的以百万分率表示的31P NMR化学位移
(±0.01)
[0067]
【权利要求】
1.组合物，其包含
其中: 每个Y选自O和S ;各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S ;
Rl 选自 H、OH、OCH3 和 OCH2CH3 ；
R2 选自 H、OH、OCH3 和 OCH2CH3 ； η是3或4 ;和 如果Rl是0Η，那么R2不是0Η。
2.权利要求1中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。
3.权利要求1中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
4.RNA分子，其5’末端掺入有权利要求1的组合物。
5.用于在体外合成权利要求4中所描述的RNA分子的方法,所述方法包括使ATP、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。
6.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译权利要求2中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
7.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求4中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
8.权利要求1中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基团，或者其中η是4并且所述组合物包含Y -硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被Dcp2水解。
9.权利要求1中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基团，或者其中η是4并且所述组合物包含δ -硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。
10.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5’末端掺入有权利要求8中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。
11.组合物，其包含
其中: 每个Y选自0和S ;各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S ;
Rl 选自 H、OH、OCH3 和 OCH2CH3 ；
R2 选自 H、OH、OCH3 和 OCH2CH3 ； η是3或4 ;和 如果Rl是0Η，那么R2不是OH ； 和B选自
12.权利要求11中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。
13.权利要求11中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
14.RNA分子，其5’末端掺入有权利要求11的组合物。
15.用于在体外合成权利要求14中所描述的RNA分子的方法,所述方法包括使ΑΤΡ、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。
16.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译权利要求14中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
17.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求14中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
18.权利要求11中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基团，或者其中η是4并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被Dcp2水解。
19.权利要求11中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基团，或者其中η是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。
20.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5’末端掺入有权利要求17中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。
21.组合物，其包含
其中: 每个Y选自0和S ;各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S ;
Rl 选自 H、OH、OCH3 和 OCH2CH3 ；
R2 选自 H、OH、OCH3 和 OCH2CH3 ； η是3或4 ;和 如果Rl是0Η,那么R2不是OH ;和 B选自鸟嘌呤、腺嘌呤、尿苷、胞嘧啶；和 X选自甲基、乙基、丙基、丁基、苄基、经取代的苄基、萘基甲基、经取代的萘基甲基、以及其他经取代和未取代的Cl至ClO脂肪族或芳香族基团。
22.权利要求21中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。
23.权利要求21中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
24.RNA分子，其5’末端掺入有权利要求21的组合物。
25.用于在体外合成权利要求24中所描述的RNA分子的方法,所述方法包括使ATP、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。
26.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译权利要求24中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
27.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求24中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
28.权利要求21中所描述的 组合物；其中η是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基团，或者其中η是4并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被Dcp2水解。
29.权利要求21中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基团，或者其中η是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。
30.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5’末端掺入有权利要求28中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。
31.组合物，其包含
其中: 每个Y选自O和S ;各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S ; η是3或4 ; B选自鸟嘌呤、腺嘌呤、尿苷、胞嘧啶；和 X选自甲基、乙基、丙基、丁基、苄基、经取代的苄基、萘基甲基、经取代的萘基甲基、以及经取代或未取代的Cl至ClO脂肪族或芳香族基团。
32.权利要求31中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。
33.权利要求31中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
34.RNA分子，其5’末端掺入有权利要求31的组合物。
35.用于在体外合成权利要求34中所描述的RNA分子的方法,所述方法包括使ATP、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。
36.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译权利要求34中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
37.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求34中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
38.权利要求31中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基团，或者其中η是4并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被Dcp2水解。
39.权利要求31中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基团，或者其中η是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。
40.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5’末端掺入有权利要求38中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。
41.组合物，其包含
其中: 每个Y选自0和S ;各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S ;和η是3或4 ;和 X选自甲基、乙基、丙基、丁基、苄基、经取代的苄基、萘基甲基、经取代的萘基甲基、以及经取代或未取代的Cl至ClO脂肪族或芳香族基团；各个X可以是相同的或不同的。
42.权利要求41中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。
43.权利要求41中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
44.RNA分子，其5’末端掺入有权利要求41的组合物。
45.用于在体外合成权利要求44中所描述的RNA分子的方法,所述方法包括使ΑΤΡ、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。
46.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译权利要求44中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
47.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求44中所描述的RNA分子引入 细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
48.权利要求41中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基团，或者其中η是4并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被Dcp2水解。
49.权利要求41中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基团，或者其中η是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。
50.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5’末端掺入有权利要求48中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。
51.组合物，其包含
其中:每个Y选自O和S ;各个Y可以是相同的或不同的；和至少一个Y是S ;和 η是3或4。
52.权利要求51中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由单种立体异构体组成。
53.权利要求51中所描述的组合物，其中所述组合物包含至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
54.RNA分子，其5’末端掺入有权利要求51的组合物。
55.用于在体外合成权利要求54中所描述的RNA分子的方法,所述方法包括使ΑΤΡ、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。
56.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译权利要求54中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
57.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求54中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
58.权利要求51中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含β-硫代磷酸基团，或者其中η是4并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被Dcp2水解。
59.权利要求51中所描述的组合物；其中η是3并且所述组合物包含Y-硫代磷酸基团，或者其中η是4并且所述组合物包含δ-硫代磷酸基团；并且其中所述组合物在生理条件下不被DcpS水解，和所述组合物抑制帽依赖性翻译。
60.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将其5’末端掺入有权利要求58中所描述的组合物的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽；其中该体内翻译速率为从其中每个Y是氧原子和其中没有Y是硫原子的在其他方面相同的方法之中将能够获得的体内翻译速率的至少两倍。
61.组合物，其包含一种或多种选自下列的化合物:m27’2,_°GppspG;m/’3, _°GppspG ;m27’2 ' _0GpppspG ；m27,3 ' _0GpppspG ；m27,2 ' _0GppsppG ；m27,3 ' _0GppsppG ；m27,2 ' _0GpspspG ；m27’3 °GpspspG ;m27’2 °GppspsG ;m27’3 °GppspsG ；bn7m2 °GppspG ；bn7m3 °GppspG ；bn7m2 °GpppspG ；bn7m3 °GpppspG ；bn7m2 °GppsppG ；bn7m3 °GppsppG ；bn7m2 °GpspspG ；bn7m3 °GpspspG ；bn7m2 °GppspsG ;和 bn7m3 0GppspsGo
62.权利要求61中所描述的组合物，其中所述组合物基本上由所述化合物之一的单种立体异构体组成。
63.权利要求61中所描述的组合物，其中所述组合物包含所述化合物之一的至少两种非对映异构体，第一非对映异构体和第二非对映异构体，的混合物；其中除了所述第一和第二非对映异构体在手性磷原子处具有不同的立体化学构型外，所述第一和第二非对映异构体在其他方面是相 同的；其中所述手性磷原子是与硫原子结合的磷原子。
64.RNA分子，其5’末端掺入有权利要求61的组合物。
65.用于在体外合成权利要求64中所描述的RNA分子的方法,所述方法包括使ATP、CTP、UTP、GTP、所描述的组合物和多核苷酸模板，在RNA聚合酶存在下，在有助于所述RNA聚合酶将所述多核苷酸模板转录成RNA拷贝的条件下进行反应；由此所述RNA拷贝中的一些将会掺入有所描述的组合物，从而产生所描述的RNA分子。
66.用于在体外合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下在无细胞蛋白质合成体系中翻译权利要求64中所描述的RNA分子，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
67.用于在体内合成蛋白质或肽的方法，所述方法包括在这样的条件下将权利要求64中所描述的RNA分子引入细胞中，其中所述RNA分子包含开放阅读框，所述条件有助于将所述RNA分子的所述开放阅读框翻译成由所述开放阅读框所编码的蛋白质或肽。
【文档编号】C07K1/00GK104072561SQ201410246751
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2008年6月19日 优先权日:2007年6月19日
【发明者】J·杰米利迪, E·M·戈鲁德琪恩-诺加尔斯卡, J·克瓦尔斯卡, E·达琴奇维克孜, R·E·罗德斯 申请人:路易斯安那州州立大学及农业机械学院管理委员会, 华沙大学