一种表达猪瘟病毒e2基因重组病毒及制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种表达猪瘟病毒E2基因重组病毒及制备方法与应用，本发明根据密码子的偏爱性，将人工合成CSFV2.1型免疫原性基因E2基因和1.1型E2基因分别置于杆状病毒pH和p10启动子下表达，获得了一种重组杆状病毒，CCTCCNO:V201338，提高了外源基因的表达量。本发明的重组杆状病毒所表达E2蛋白制备亚单位疫苗，免疫日本大白兔和猪后，可诱导机体产生特异性免疫反应，并免受猪瘟病毒的攻击，同时可以通过鉴别诊断区分疫苗免疫和野毒感染动物，利于猪场猪瘟病毒的根除和净化。
【专利说明】一种表达猪瘟病毒E2基因重组病毒及制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于兽医生物【技术领域】。本发明涉及一种重组杆状病毒毒株的构建方法。具体涉及一种表达猪瘟病毒E2基因的重组杆状病毒AC-CSE12的制备方法及其在预防猪瘟感染的亚单位疫苗中的应用。利用本发明的重组病毒表达人工修饰的猪瘟病毒E2基因，可以用于制备安全的猪瘟病毒亚单位疫苗。
【背景技术】
[0002]猪瘟是(Classical swine fever, CSF)是由黄病毒科瘟病毒属猪瘟病毒(Classical swin e fever virus, CSFV)引起的一种高度接触性、出血性和致死性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。当前猪瘟在我国很多猪场流行，临床上表现为早产、流产、死胎、木乃伊胎及猪生产能力下降等。同时该病与伪狂犬病、圆环病毒感染相关疾病等多重感染和混合感染常常发生。但却没有有效的治疗药物，只能使用疫苗来免疫动物，达到预防疾病的目的。E2蛋白是诱导机体产生中和抗体的主要保护性抗原主要成分，可以抵抗强毒的攻毒保护实验(Weilandet al.，1990 ;Greise et al.，1990 ;Dong et al.，2006 ;Chen et al.，2011 ;LlilianneGangesa et al.，2012)，是构建猪瘟新型基因工程疫苗的首选靶蛋白。利用CSFV E2蛋白制备的亚单位疫苗没有非结构蛋白，可以利用检测Erns蛋白的抗体来区分疫苗免疫和野毒感染猪群。目前，猪瘟的流行形势十分复杂。我国流行的猪瘟病毒基因亚型较多，包括
2.1，2.2，2. 3和1.1亚型；在1994年的台湾也出现基因3型的猪瘟病毒；其中基因2.1 (尤其 2.1b)亚型在我国广泛流行(涂长春,2004 ;Weihuan Fang et al., 2007 ；Luo Y etal.，2014)。尽管猪瘟兔化弱毒疫苗能有效的预防不同基因亚型病毒的感染，但是猪瘟仍在部分区域呈流行态势，并存在代毒与免疫临床发病现象。猪瘟作为我国优先防治的一类动物传染病，仍迫切需要便于鉴别诊断的新型基因工程标记疫苗以及配套的诊断试剂。
[0003]近年来，杆状病毒表达载体因其具有操作简单、安全性高，可容纳大的目的基因，表达外源蛋白效率高，有翻译后修饰的作用，表达蛋白的免疫原性、生物活性与天然的蛋白相似等优点，已经在表达载体上占了主导的地位(Anderson et al., 1995 ；ffang etal.，2001 ；Ribe iro et al.，2001)。利用杆状病毒表达载体同时表达CSFV 2.1型和1.1型的E2蛋白，制备亚单位疫苗，能同时预防I群和II群猪瘟病毒感染，也利于与野毒感染进行鉴别诊断。
【发明内容】
[0004]本发明的一个目的是提供了一种包含了人工修饰合成的猪瘟病毒2.1型E2基因和1.1型E2基因的融合CDNA基因序列，其序列为SEQ ID N0.1所示，编码的蛋白质为SEQI D N0.2 所示。
[0005]本发明的另一个目的是提供一种转移载体PFastBac2E2，该载体分别含有I个拷贝CSF V 2.1型和1.1型免疫原性基因E2基因的cDNA序列。
[0006]本发明还有一个目的就是提供一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒，该毒株被命名为Ac-CSE12，属于杆状病毒(Baculovirus)，该病毒含有CSFV 2.1型和1.1型免疫原性基因E2，该病毒于2013年9月9日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为 CCTCC NO: V201338,分类命名:重组杆状病毒Recominant Autographa californicamultiple Nucleopolyhedrovirus Ac_CSE12,地址:中国武汉武汉大学。
[0007]本发明还有一个目的是提供了一种猪瘟病毒重组杆状病毒Ac-CSE12的制备方法，该方法简单易行，适合大规模生产。
[0008]本发明还有一个目的是提供了一种猪瘟重组杆状病毒Ac-CSE12在制备亚单位疫苗中的应用，将该病毒免疫日本大白兔后可诱导机体产生特异性免疫反应，并能免受1.1型和2.1型的CSFV的攻击。重组杆状病毒表达E2蛋白制备亚单位疫苗免疫动物后，可以通过鉴别诊断区分疫苗免疫和野毒感染动物。
[0009]更详细的技术方案见《【具体实施方式】》所述。
[0010]本发明的有益效果是:
[0011]1.本发明根据密码子的偏爱性，人工修饰合成了 CSFV QZ-07毒株的免疫原性基因E2，提高了这些基因在杆状病毒中表达水平。
[0012]2.本发明是将人工合成CSFV 2.1型免疫原性基因E2基因和1.1型E2基因分别置于杆状病毒PH和plO启动子下表达，提高了外源基因的表达量。
[0013]3.本发明的重组杆状病毒所表达E2蛋白制备亚单位疫苗，免疫日本大白兔和猪后，可诱导机体产生特异性免疫反应，并免受猪瘟病毒的攻击。
[0014]4.本发明的重组杆状病毒表达E2蛋白制备亚单位疫苗免疫动物后，可以通过鉴别诊断区分疫苗免疫和野毒感染动物。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为一种杆状病毒载体PFastBac2E2的酶切鉴定图谱。
[0016]M:5000bp DNA Marker ；1:pFastBac2E2/BgLII 酶切；2:pFastBac2E2/NHeI 酶切
[0017]图2为一种重组杆粒rBac_CSE12PCR鉴定示意图。
[0018]鉴定正确的杆状病毒转移载体pFastBac2E2转化DHlOBac，蓝白斑筛选获得阳性菌落，提取杆粒rBac-CSE12进行PCR鉴定的电泳图片。
[0019]水:阴性对照M: 15000bp ;1、7:阴性对照 M: 15000bp DNA Marker ；2:M13 上游引物和2.1E2下游引物扩增(3800bp) ;3~6:M13引物扩增(4800bp)
[0020]图3为一种Western blot分析杆状病毒Ac_CSE12蛋白表达的示意图；
[0021]1:杆状病毒Ac-CSE12感染sf9细胞；2:为感染的sf9细胞
[0022]图4为一种间接免疫荧光分析杆状病毒Ac-CSE12蛋白表达的示意图；
[0023]a:观察红荧光，b:绿荧光，c:观察细胞核，d:a-c合在一起的图片
[0024]图5为重组杆状病毒Ac-CSE12表达E2蛋白的western blot定量分析
[0025]M:marker ;1_3:CSFV E2 蛋白；4_7:为倍比稀释的 His 标签蛋白(4:112μ g/mL ；5:56 μ g/mL ；6:28 μ g/mL ；7:14 μ g/Ml)；
[0026]图6重组杆状病毒Ac_CSF12表达外源蛋白的稳定性分析
[0027]M:蛋白 marker ；1:F15 代 Ac_CSF12 ；2:F12 代 Ac_CSF12 ；3:F9 代 Ac_CSF12 ；4:F6代 Ac-CSF12 ；5:F3 代 Ac_CSF12 ；6:F1 代 Ac_CSF12
[0028]图7为日本长耳大白兔免疫后不同时间抗CSFV的阻断ELISA示意图
[0029]重组杆状病毒Ac-CSE12亚单位疫苗、猪瘟兔化弱毒疫苗以及细胞对照免疫日本大白兔后0、14、28、42和56天采集血清，检测不同时间血清中抗CSFV的阻断ELISA抗体水平。
[0030]图8为日本长耳大白兔免疫后不同时间抗CSFV 1.1和2.1基因型病毒中和试验结果图
[0031]重组杆状病毒Ac-CSE12亚单位疫苗、猪瘟兔化弱毒疫苗以及细胞对照免疫日本大白兔后O、14、28和42天采集血清，检测不同时间血清中抗CSFV石门毒株(1.1基因型)和HZ07毒株(2.1基因型)中和抗体水平。
[0032]A:抗CSFV石门毒株(1.1基因型)的中和抗体水平；B:抗CSFV HZ07毒株的中和抗体水平。
[0033]图9为猪免疫后不同时间抗CSFV的阻断ELISA抗体示意图
[0034]重组杆状病毒Ac-CSE12亚单位疫苗、猪瘟兔化弱毒疫苗以及细胞对照免疫猪后0、14、28、42和56天采集血清，检测不同时间血清中抗CSFV的阻断ELISA抗体水平。
[0035]图10为猪免疫后不同时间抗CSFV EO的ELISA抗体示意图
[0036]重组杆状病毒Ac-CSE12亚单位疫苗、猪瘟兔化弱毒疫苗以及细胞对照免疫猪后
0、14、28、42和56天采集血清，检测不同时间血清中抗CSFV EO的ELISA抗体水平。
[0037]图11猪体攻毒后不同时间的体温统计图
[0038]攻毒后每天测定猪的体温，结果表明猪瘟病毒兔化弱毒疫苗阳性组体温没有升高，重组杆状病毒Ac-CSE12亚单位疫苗试验组猪体的体温在攻毒后6天时有所升高，而细胞阴性对照组出现典型的高热反应。
【具体实施方式】
[0039]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述实际，如未特别说明，均为商业化或是已公开的试剂材料。
[0040]实施例1:
[0041]一种表达CSFV的免疫原性基因E2基因重组杆状病毒Ac_CSE12的构建
[0042](一 )、重组杆状病毒Ac-CSE12的构建
[0043]1、CSFV主要免疫原性基因E2的获得
[0044]参照CSFV QZ-07 分离株(2.1 型猪瘟病毒)E2 基因序列(GenBank N0.FJ456876)，根据杆状病毒密码子的偏爱性人工合成1222bp的E2基因序列，该序列克隆入载体pUC-18 (Invitrogen 公司)中获得重组质粒 pUC-57-2.1-E2。
[0045]以质粒pMD-18T-CSFV-E2(含有猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株HCLV的E2基因，硕士生:谭华菊；导师:钱平；华中农业大学2009年硕士论文:BVDV E2基因重组猪瘟病毒的构建与猪IRF3/7克隆表达的研究)为模板，利用引物1.1E2-GZF和1.1E2_GZR(1.1E2-GZF:5’-TTTTGGATCCACCATGCGGCTAGCCTGCAAG-3’；1.1E2-GZR:5’_TTTGCGGCCGCTTAGTGATGGTGATGGTGATGTTCTGCGAAGTAATCT-3’)扩增993bp的E2基因，并在E2基因的C端引入6his序列作为标签。通过引物在基因片段的上下游引入BamHI和NotI酶切位点。将该片段连入pMD_18T载体,命名为pMD-18T-l.1E2。
[0046]2、杆状病毒转移载体pFastBac2E2的构建
[0047]以杆状病毒通用载体pFastBac?dual (Invitrogen公司)为骨架，通过BamHI和Not I分别酶切pFastBac?dual和pMD-18T_l.1E2，回收后进行连接构建质粒pFastBac-1.1E2。以pUC-57-2.1-E2 (上海生工生物公司合成)为模板，利用引物2.1E2-GZF 和 2.1E2_GZR(2.1E2-GZF(XhoI):5’ -TTTGCTAGCCACCATGCTCGAGTTAACCAGCGGCGAGT-3’ ；2.1E2-GZR(KpnI)5’ -TTTGGTACCTTAATGATGATGATGATGATGCCACCATGCGCCCCTTCCTGCT-3，)，扩增2.1E2基因，同时在C端引入6his标签序列，PCR产物通过XhoI和KpnI酶切后克隆入pFastBac-1.1E2的相应位点，获得转移质粒pFastBac-1.1E2-2.1E2(命名为pFastBac2E2)。通过BgLII和NHeI分别单酶切鉴定pFastBac2E2，结果显示BgLII单酶切后有3600bp，2000bp，1324bp和500bp四条片段，NHeI单酶切后有7102bp和322bp两条片段，大小与预期结果一致，表明转移质粒PFastBac2E2构建成功，酶切鉴定结果如图1所示，其包含有SEQ ID N0.1所示的融合基因序列，该序列编码的蛋白质为SEQ ID N0.2所示。
[0048]3、重组病毒杆状病毒Ac-CSE12的构建
[0049](I)重组杆粒Ac-CSE12的获得与鉴定
[0050]取3.0 μ L pFastBac2E2 与 100 μ L DHlOBac 大肠杆菌感受态细胞(GiBCO BRL 公司产品)混合，冰浴30min后，于42°C 45s水浴进行热激，然后冰浴2min，加入900 μ L LB液体培养基(氯化钠浓度为10% )，37°C振摇培养4h，按10-1、10-2、10-3稀释后，各取10yL涂布于含有三抗(卡那霉素、庆大霉素和四环素)高盐LB平板，使用浓度按Bac-to-BacBaculovir us Express1n System 操作说明书(Invitrogen 公司)，37°C培养 24_48h,通过蓝白斑筛选、纯化阳性菌落，提取重组杆粒rBac-CSE12，通过两对PCR引物扩增鉴定:M13上游引物(Ml3F)和2.1E2-GZF下游引物(Ml3R)，M13上游引物(Ml3F)和Ml3下游引物(Ml3R)。
[0051]M13F:5， -CCCAGTCACGACGACGTTGTAAAACG-3，；
[0052]M13R:5， -AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3，；
[0053]2.1E2-GZR:5-TTTGGTACCTTAATGATGATGATGATGATGCCACCATGCGCCCCTTCCTGCT_3
[0054]其PCR扩增体系如下:
[0055]
【权利要求】
1.一种包含了人工修饰合成的猪瘟病毒2.1型E2基因和1.1型E2基因的融合cDNA基因序列，其序列为SEQ ID N0.1所示。
2.权利要求1所述基因编码的蛋白质，其序列为SEQID N0.2所示。
3.包含权利要求1所述基因的杆状病毒转移载体pFastBac2E2。
4.权利要求3所述杆状病毒转移载体PFastBac2E2的制备方法，具体如下: 1).CSFV主要免疫原性基因E2的获得 参照CSFV QZ-07分离株E2基因序列，根据杆状病毒密码子的偏爱性人工合成1222bp的E2基因序列，该序列克隆入载体pUC-18中获得重组质粒pUC-57-2.1-E2 ； 以质粒 pMD-18T-CSFV-E2 为模板，利用引物 1.1E2-GZF: 5，-TTTTGGATCCACCATGCGGCTAGCCTGCAAG-3’ ；1.1E2-GZR:5’ -TTTGCGGCCGCTTAGTGATGGTGATGGTGATGTTCTGCGAAGTAATCT-3’扩增993bp的E2基因，并在E2基因的C端引入6his序列作为标签；通过引物在基因片段的上下游引入BamHI和NotI酶切位点；将该片段连入pMD_18T载体，命名为PMD-18T-1.1E2 ； 2).杆状病毒转移载体PFastBac2E2的构建 以杆状病毒通用载体PFastBacTMdual为骨架，通过BamHI和Not I分别酶切PFastBacTMdual 和 pMD-18T_l.1E2,回收后进行连接构建质粒 pFastBac-1.1E2 ；以pUC-57-2.1-E2 为模板，利用引物 2.1E2-GZF (XhoI): 5’-TTTGCTAGCCACCATGCTCGAGTTAACCAGCGGCGAGT-3’；2.1E2-GZR(KpnI) 5’ -TTTGGTACCTTAATGATGATGATGATGATGCCACCATGCGCCCCTTCCTGCT-3’扩增2.1E2基因，同时在C端引入6his标签序列，PCR产物通过XhoI和KpnI酶切后克隆入pFastBac-1.1E2的相应位点，获得转移质粒pFastBac-1.1E2-2.1E2，即得。
5.一种表达猪瘟病毒E2基因重组病毒，其特征在于:重组杆状病毒RecominantAutographa californica multiple Nucleopolyhedrovirus Ac_CSE12, CCTCCN0:V201338o
6.权利要求4所述的重组病毒在制备猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗中的应用。
7.权利要求4所述的重组病毒在制备疫苗免疫和野毒感染的鉴别诊断试剂的应用。
【文档编号】C07K19/00GK104178505SQ201410439805
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】李祥敏, 钱平, 张华伟, 朱世轩, 钱苏红, 陈焕春 申请人:华中农业大学