一种调控小尾寒羊骨骼肌生长的myl1基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，特别提供了一种可以调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL1基因，其包括两种cDNA可变剪接体MYL1a和MYL1b，其中MYL1a的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；MYL1b的cDNA序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；该基因具有调控骨骼肌生长的功能，应用该基因可以通过对该基因的表达调控进行操作，为实现培育生长速度快的绵羊品种奠定基础，具有重要的现实意义。
【专利说明】-种调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL1基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种可以调控小尾寒羊骨骼 肌生长的MYLl基因及其在绵羊育种中的应用。
【背景技术】
[0002] 羊肉肉质细嫩，脂肪和胆固醇含量低，逐渐受到人们的青睐。近年来，随着羊肉价 格的不断攀升，提高羊只生长速度、改善羊肉品质对增加动物生产者的经济收益、满足广大 消费者对优质羊肉的需求具有重大意义。
[0003] 肌球蛋白轻链是骨骼肌纤维中的一类重要蛋白质，这类蛋白质主要与肌球蛋白重 链结合而对其构型和活性起调控作用。不同类型的肌球蛋白轻链及构成比例与不同类型的 肌纤维密切相关，从而导致肌肉的生长速度和肌肉品质显著不同。
[0004] 到目前为止，哺乳动物中肌球蛋白轻链家族已发现有四种不同的类型，其中肌球 蛋白轻链I(MYLl)在斑马鱼的骨骼肌卫星细胞分化为快肌纤维的早期阶段表达，并且发现 在增殖速度较慢的成肌细胞中高表达，因而认为该基因可能具有抑制成肌细胞增殖而促进 肌细胞的分化的功能。目前，绵羊基因组中公布了 MYLl基因的预测序列，还未见到该基因 确切序列的报道，并且关于该基因对肌肉生长和发育的调控还不清楚。
【发明内容】
[0005] 基于上述的原因，本发明提供了一种可以调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYLl基因， 其包括两种cDNA可变剪接体MYLla和MYLlb，其中MYLla的cDNA序列如SEQ ID NO. 1所 示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；MYLlb的cDNA序列如SEQ ID NO. 3所示，其 编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示；该基因具有调控骨骼肌生长的功能，应用该基因可 以通过对该基因的表达调控进行操作，为实现培育生长速度快的绵羊品种奠定基础，具有 重要的现实意义。
[0006] 本发明所提供的调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYLl基因，根据现有条件，在骨骼肌 中获得了 V端有所不同的两种cDNA可变剪接体MYLla和MYLlb，未见其他序列。其中 MYLla的cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；MYLlb 的cDNA序列如SEQ ID NO. 3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示；
[0007] 其中MYLla的cDNA序列除poly⑷外长849bp，该序列中的开放读码框编码150 个氨基酸；MYLlb的cDNA序列除poly (A)外长1046bp，该序列中的开放读码框编码192个 氨基酸。
[0008] 上述的MYLl基因是通过如下方法获得的：
[0009] (1)小尾寒羊肌肉总RNA的提取和反转录：
[0010] 采用TRIzol法提取小尾寒羊肌肉组织总RNA，提取的RNA以Agilent 2IOOBioanalyzer进行检测，要求总RNA含量在10 μ g以上且RIN (RNA完整性指标）彡7. 5， 并根据现有技术经Roche公司的cDNA反转录试剂盒反转录合成cDNA第一链；
[0011] ⑵MYLl基因 cDNA序列保守区的扩增：
[0012] 比对已有物种MYLl基因的cDNA序列，根据保守区设计上下游引物，以步骤⑴中 的cDNA第一链为模板进行PCR扩增克隆测序得到保守区序列；
[0013] (3)应用3'降落巢式PCR法对MYLl基因 CDNA序列的3'端进行扩增：
[0014] 根据所得保守区序列设计MYLl基因的3'特异内侧和外侧引物；
[0015] 以3'特异外侧引物和3'通用外侧引物采用退火温度逐渐降落法对上述cDNA第 一链进行第一轮PCR扩增；
[0016] 然后以3'特异内侧引物和3'通用内侧引物采用同样的退火温度逐渐降落法对 第一轮PCR扩增产物进行第二轮PCR扩增；
[0017] 对第二轮PCR产物经克隆测序得到MYLl基因 cDNA序列的：V端序列；
[0018] (4)应用Y RACE法对MYLl基因 cDNA序列的5'端进行扩增：
[0019] 对小尾寒羊肌肉组织经TRIzoI法所提总RNA依次进行常规的去磷酸化处理、"去 帽子"反应、与接头序列连接并以TaKaRa公司的Y -Full RACE Kit With TAP试剂盒反 转录合成cDNA的第一链；
[0020] 根据所得保守区序列设计MYLl基因的5'特异外侧和特异内侧引物；
[0021] 以5'特异外侧和5'通用外侧引物进行第一轮PCR扩增；
[0022] 以Y特异内侧和Y通用内侧引物进行第二轮PCR扩增；
[0023] 内侧PCR产物经克隆测序得到MYLl基因 cDNA序列的Y端序列；
[0024] (5)全长序列拼接及克隆测序验证：
[0025] 根据重叠区域对上述步骤获得的cDNA的保守区、5'和3'所得序列进行拼接，获 得MYLl基因的全长cDNA序列；设计两端序列为上下游引物，PCR扩增并克隆测序得到MYLl 基因的全长cDNA序列，由于5'端序列的差异，最终获得了可变剪接体MYLla和MYLlb，其 中MYLla的cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示；MYLlb 的cDNA序列如SEQ ID NO. 3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0026] 之后发明人利用qRT-PCR法测定MYLl基因在小尾寒羊的心、肝、肌肉等组织间 的表达量，并最终发现MYLla和MYLlb在背最长肌中的表达量最高，显著高于其他组织 (p〈0. 05)，表明该基因具有调控骨骼肌生长的功能。
[0027] 综上所述，本发明提供了一种可以调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYLl基因，其包括 两种cDNA可变剪接体。应用该基因可以通过对该基因的表达调控进行操作，为实现培育生 长速度快的绵羊品种奠定基础，具有重要的现实意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1为本发明中小尾寒羊MYLl基因 cDNA保守区扩增图，
[0029] 图中M为DL2000分子量标准；另一条为MYLl基因 cDNA的保守区序列；
[0030] 图2为本发明中小尾寒羊MYLl基因3'端扩增图，
[0031] 图中M为DL2000分子量标准；另一条为MYLl基因 cDNA的3'端序列；
[0032] 图3为本发明中小尾寒羊MYLl基因 Y RACE扩增图，
[0033] 图中M为DL2000分子量标准；另一个电泳道中上面的一条为MYLlb的5'端序列， 下面的一条为MYLla的Y端序列；
[0034] 图4为本发明中小尾寒羊MYLl基因 cDNA全长序列扩增图，
[0035] 图中M为DL2000分子量标准；另两条分别为MYLla和MYLlb的全长cDNA序列；
[0036] 图5为本发明中MYLla在小尾寒羊不同组织间的表达水平柱状图，
[0037] 图中a、b表示小尾寒羊各组织间的差异显著性（p〈0.05) ;MYLla主要在背最长肌 中表达；
[0038] 图6为本发明中MYLlb在小尾寒羊不同组织间的表达水平柱状图，
[0039] 图中a、b和c表不小尾寒羊各组织间的差异显著性（p〈0. 05) ;MYLlb在背最长肌 中的表达量显著高于其他组织。
【具体实施方式】
[0040] 以下结合附图对本发明的上述
【发明内容】
作进一步的详细描述。应理解，这些实施 例仅为了说明本发明而不是为了限制本发明的保护范围。
[0041] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的实验条 件或常规方法，如Sambrook等编著的分子克隆实验手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件。
[0042] 实施例I :背最长肌组织总RNA的提取及反转录
[0043] 取小尾寒羊背最长肌约20g，使用康为世纪公司的总RNA提取试剂盒（No. CW0580)提取肌肉组织的总RNA ;将提取的RNA采用Roche公司的cDNA反转录试剂盒 (No. 05081955001)反转录合成cDNA第一链，-20°C保存备用。
[0044] 实施例2 :cDNA保守区序列的克隆与测序
[0045] (1)引物的设计：从NCBI上下载人、猪、牛、鼠等各物种MYLl基因的cDNA序列， 以DNAMN 6. 0软件进行比对获得保守区序列，设计该基因 cDNA的保守区引物为：Fl : TGAATTCAAGGAGGCATTTCTCC，如 SEQ ID NO. 5 所示，和 F2 :AAGGATGTTCTTTGACCC，如 SEQ ID NO. 6所示；
[0046] (2) PCR扩增：以实施例1获得的cDNA第一链为模板，采用TIANGEN的PCR MasterMix试剂盒（KT201)进行PCR扩增；50μ 1扩增体系中包含：PCR MasterMix 25μ 1 ; Fl(10X)2y I ;F2(10X)2y I ;cDNA 第一链 2μ 1。扩增条件为：94°C，5min ;(94°C 30s， 52°C 30s，72°C lmin)35cycles ;72°C，10min。扩增结果见附图 I ;
[0047] (3)扩增条带的回收：PCR扩增产物经I %琼脂糖的TAE凝胶进行电泳凝，切取相 应条带；采用AxyPr印DNA凝胶回收试剂盒（#0691)对PCR产物进行纯化回收；
[0048] (4)回收产物与载体连接：载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8 ;根据扩增产物回 收后凝胶电泳情况将回收产物稀释至标准浓度，依PMD18-T载体试剂盒说明书（No. 6011) 进行连接反应。
[0049] (5)连接产物的转化：取适量连接产物，依TIANGEN公司的大肠杆菌感受态细胞 DH5a (CB101)使用说明进行转化及细菌的培养操作；
[0050] (6)菌液PCR鉴定：吸取1?2 μ 1菌液作模板，依据（2)中PCR扩增体系和条件 进行扩增，1 %琼脂糖凝胶电泳检测目的条带；
[0051] (7)克隆产物的测序分析：如果凝胶检测含有目的条带且较纯，则吸取Iml菌液测 序分析，得到长为719bp的一条保守区目标序列。
[0052] 实施例3 :cDNA 3'端序列的克隆与测序
[0053] 采用降落巢式PCR法克隆cDNA序列的3'端，具体步骤如下：
[0054] (1)引物的设计与合成：根据实施例2所得MYLl基因 cDNA保守区的测序结果， 设计两条上游嵌套式引物,3 ' GSP :TGATGGCAGGTCAGGAAGAC，如SEQ ID NO. 7所示，和 3' NGSP:GAACACCCATGACTAACTGTCC，如 SEQ IDN0. 8 所示；并合成两条下游：V 通用引物， 3，-UP:GACTCGAGTCGATCGA，如 SEQ ID N0.9K*jP01igodT-AP:GACTCGAGTCGATCGA(T)18， 如 SEQ ID NO. 10 所示。
[0055] (2)反转录合成cDNA第一链：取IOOpg?1μ g实施例1中提取的RNA，加入 OligodT-AP为反转录引物反转录合成cDNA第一链；
[0056] (3)夕卜侧PCR扩增：以3 ' GSP和OligodT-AP为上下游引物，依实施例2中PCR 反应试剂盒体系进行，扩增程序为：98°C，30s ;(98°C，10s ;70°C，30s ;72°C，30s)3cycles ; (98 °C,l〇s ；68 〇C,30s；72 °C, 30s)4cycles ； (98 °C,l〇s ；66 〇C,30s；72 °C, 30s) 5cycles ； (98 °C, IOs ；64 °C, 30s ；72 °C, 30s) 6cycles ； (98 °C, IOs ；62 °C, 30s ；72 °C, 30s) 8cycles ； (98〇C, IOs ；60°C, 30s ；72〇C, 30s) IOcycles ；72〇C, IOmin ；4°C ；
[0057] (4)内侧PCR扩增：以:V NGSP和:V -UP为上下游引物，步骤⑶的扩增产物稀 释30倍为模板，依上述步骤（3)中反应条件和扩增程序进行目的条带的扩增，扩增结果见 附图2;
[0058] (5)PCR产物的克隆测序：扩增条带的回收、与载体连接、连接产物的转化及测序 同实施例2,得到长为274bp的一条序列。
[0059] 实施例4 :cDNA 5'端序列的克隆与测序 [0060] 采用5' RACE法克隆5'端序列，步骤如下：
[0061] (1)引物的设计与合成：根据实施例3所得MYLl基因 cDNA保守区的测序结果， 设计两条下游嵌套式引物,5 ^ GSP :CACGCAGACCCTCAACAAAG，如SEQ ID NO. 11所示，和 5/NGSP:GCCATCACCTGTTCTGTCATAC，如SEQIDN0·12所示 ；并合成两条上游5/通用引 *，5,-0uterPrimer :CATGGCTACATGCTGACAGCCTAjnSEQIDN0.13K*jP5，-Inner Primer :CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG，如 SEQ ID NO. 14 所示。
[0062] (2)mRNA的去磷酸化处理
[0063] ①配制去磷酸反应液：
[0064]
【权利要求】
1. 一种调控小尾寒羊骨骼肌生长的MYL1基因，其特征在于：包括两种cDNA可变剪接 体MYLla和MYLlb，其中MYLla的cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，其编码的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2所示；MYLlb的cDNA序列如SEQ ID NO. 3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
2. 根据权利要求1所述的MYL1基因，其特征在于：其来源于小尾寒羊的肌球蛋白轻链 1〇
3. 权利要求1所述的调控骨骼肌生长的MYL1基因，在绵羊育种中的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：通过对MYL1基因的调控实现培育生长速 度快的绵羊育种。
【文档编号】C07K14/47GK104263733SQ201410473379
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】王建民, 张春兰, 王桂芝, 纪志宾, 候磊, 秦孜娟 申请人:山东农业大学