一种高含量egcg的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种高含量EGCG的制备方法，所述高含量EGCG的制备方法采用含EGCG的茶多酚提取物为原料，经过原料前处理、装柱、上柱、洗脱、浓缩、结晶以及提纯等步骤得到粉末状高含量EGCG，其EGCG单体质量分数大于99%。本发明的有益效果为：生产过程中有效避免了使用大量有毒溶剂，生产过程更加环保，溶剂处理量小，操作简单易行，对于难分离的酯型儿茶素EGCG和ECG，可做到一次性分离，分离效果好，分离效率高，提纯物含量高，结晶时间短，产品不易氧化，产品色泽好、纯度高。
【专利说明】—种高含量EGCG的制备方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及天然产物化工【技术领域】，具体来说，涉及一种高含量EGCG的制备方法。
[0003]
【背景技术】
[0004]儿茶素类包括没食子儿茶素(GC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)和表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)。其中，EGCG是绿茶儿茶素类的主要成分，同时也是绿茶茶多酚的主要组成成分，EGCG具有广泛的多种生物活性，强抗氧化活性，能够保护细胞和DNA免受损害。EGCG的这些功效主要源自其对氧自由基的清除能力，即抗氧化能力。EGCG在治疗癌症和心血管疾病方面具有重要作用，它能够干扰癌细胞信号传递，抑制饮食中的致癌物质的活性，而且可作为肿瘤多药耐药性的逆转剂，提高癌细胞对化疗的敏感性，同时减轻药物对心脏的毒性。EGCG还能够阻止油脂过氧化，减少血清中低密度胆固醇、超低密度胆固醇和甘油三酯的含量，抑制病毒，抵御辐射和紫外线，防治皮肤老化和起皱。
[0005]分离纯化茶多酚中EGCG的关键难点在于，茶叶中的多种茶多酚组分的化学结构和性质均十分相似，其中EGCG在分离纯化过程中极易被氧化。而工厂化规模的生产级别要求，既要达到高效的分离、便于工厂操作，又要避免生产过程中EGCG的氧化问题。
[0006]现有的分离纯化EGCG的方法普遍存在方法繁琐、费时、产品纯度不高、溶剂处理困难以及不易普及等缺点。现有方法可参考2010年6月9日公告的中国专利200910273058.2，其公开了一种高含量EGCG儿茶素的工厂化提取方法，其采用KR-100-5C18为柱填料，分别以25%、75%乙醇水溶液为洗脱剂，进行柱层析，按时间或体积收集儿茶素单体EGCG目标液，对目标液进行回收浓缩、结晶得儿茶素EGCG单体，但该发明存在操作繁琐，溶剂处理量大以及结晶方法简单容易导致氧化使色泽加深等问题，不能保证获得质量、色泽好的EGCG产品。同时参考2007年11月21日公告的中国专利200710090211.9，其以茶多酚为原料，经溶解、柱层析、浓缩、结晶得到EGCG单体，但所得EGCG单体含量仅有90%，且溶剂处量量大。
[0007]综上所述，现有方法虽然可以达到一定纯度的EGCG单体的提取，但存在操作繁琐、EGCG易氧化、溶剂处理量大以及提纯物含量低等问题。
[0008]
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种高含量EGCG的制备方法，以克服现有相关技术中EGCG的纯化方法存在的操作繁琐、溶剂处理量大、EGCG的纯化方法易氧化以及提纯物含量低等问题的不足。
[0010]本发明的目的是通过以下技术方案来实现:
一种高含量EGCG的制备方法，包括以下步骤:
步骤1:对预先选择的含有EGCG的茶多酚提取物原料进行溶解处理，溶剂为纯净水，得到茶多酚提取物溶液；
步骤2:将硅胶加入适量预先配制的1% (体积分数)乙醇水溶液中，所述硅胶与1%乙醇水溶液充分混合均匀后，加入预先配置的层析柱中；
步骤3:采用湿法上柱，将步骤I所得到的茶多酚提取物溶液加入至所述层析柱中，所述茶多酚提取物溶液吸附于所述层析柱中的硅胶上；
步骤4:利用预先配制的1%乙醇水溶液对经过步骤3处理的层析柱中的硅胶进行洗脱，并且，在该1%乙醇水溶液流至所述层析柱中的硅胶表面时，利用预先配制10-20% (体积分数)乙醇水溶液继续洗脱所述层析柱中的硅胶；
步骤5:在所述10-20%乙醇水溶液流至所述层析柱柱口时，收集洗脱液，并在收集4-6个所述层析柱体积的洗脱液的情况下，停止对所述层析柱进行洗脱；
步骤6:对步骤5得到的所述洗脱液进行减压浓缩处理，其体积浓缩至原体积的3%，在所得到的浓缩液中加入预先配制的有机酸，并对加入有机酸后的混合液进行结晶处理，其中，所述混合液中有机酸的浓度为0.1-1.0% (质量浓度)；
步骤7:对步骤6所得到的结晶进行冲洗、过滤、冷冻和干燥，得到粉末状高含量EGCG，其EGCG单体质量分数大于99% (HPLC法测定:High Performance LiquidChromatography,高效液相色谱法)。
[0011]进一步的，所述步骤I中，溶解处理的方式为超声或加热，所述超声或加热时间均为30min，所述加热温度为60°C。
[0012]进一步的，所述步骤2中，1%乙醇水溶液与硅胶的体积比为1:3。
[0013]进一步的，所述步骤2中，采用的硅胶为C18反向硅胶，其目数为100目。
[0014]进一步的，所述步骤2中，硅胶与1%乙醇水溶液充分混合的湿视密度为0.75kg/L0
[0015]进一步的，所述步骤3中，茶多酹提取物溶液与娃胶的吸附时间为30min-60min。
[0016]进一步的，所述步骤4中，1%乙醇水溶液的体积是所述步骤3中茶多酚提取物溶液体积的1-2倍。
[0017]进一步的，所述步骤6中，有机酸为柠檬酸、草酸和酒石酸中的至少一种。
[0018]进一步的，所述步骤6中，结晶方法采用热饱和溶液低温结晶法，结晶温度为4°C。
[0019]本发明的有益效果为:生产过程中有效避免了使用大量有毒溶剂，生产过程更加环保，溶剂处理量小，操作简单易行，对于难分离的酯型儿茶素EGCG和ECG，可做到一次性分离，分离效果好，分离效率高，提纯物含量高，结晶时间短，产品不易氧化，产品色泽好、纯度高。
[0020]
【具体实施方式】
[0021]对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0022]实施例1:
根据本发明实施例1的一种高含量EGCG的制备方法，包括以下步骤:
步骤1:以含有EGCG 90%的茶多酚提取物为原料，投料质量为2千克，将含有EGCG 90%的茶多酚提取物原料进行溶解处理，溶剂为纯净水，得到茶多酚提取物溶液，所述溶解处理方式为超声或加热，所述超声或加热时间均为30min，所述加热温度为60°C ；
步骤2:将C18反向硅胶加入1%乙醇水溶液中，所述反向硅胶是在正相硅胶的基础上进行化学反应，把OH取代为0R，其中R是碳链的硅胶，C18反相硅胶即为含碳数值为18的反相硅胶，所述C18反相硅胶的目数为100目，所述C18反相硅胶的加入量视层析柱的规格而定，所述C18反相硅胶的柱体积为47 L，所述C18反向硅胶与1%乙醇水溶液充分混合，混合后的湿视密度为0.75kg/L，1%乙醇水溶液与C18反向硅胶的体积比为1:3，将充分混合C18反向硅胶的1%乙醇水溶液加入预先配置的层析柱中，反复加压使C18反相硅胶堆积更稳固；
步骤3:采用湿法上柱，将步骤I所得到的茶多酚提取物溶液加入至所述层析柱中，所述茶多酚提取物溶液吸附于所述层析柱中的C18反相硅胶上，其吸附时间为30min-60min ；步骤4:利用预先配制的1%乙醇水溶液对经过步骤3处理的层析柱中的C18反相硅胶进行洗脱，所述1%乙醇水溶液的体积是茶多酚提取物溶液体积的I倍，此部分洗脱液不收集，洗脱过程可除去部分非酯型儿茶素、部分色数以及多糖等极性较大的杂质，当1%乙醇水溶液流至C18反相硅胶表面5cm时，利用预先配制的20%乙醇水溶液继续洗脱所述层析柱中的C18反相娃胶；
步骤5:在所述20%乙醇水溶液流至层析柱口时，开始收集洗脱液，并在收集4个所述层析柱柱体积的洗脱液情况下，停止对所述层析柱进行洗脱，洗脱液收集量为188 L；
步骤6:将步骤5中收集到的4个柱体积的洗脱液，通过减压浓缩锅或单效蒸发器进行减压浓缩，其体积浓缩至原体积的3%，得到6升浓缩液，在所得到的浓缩液中加入预先配制的有机酸，所述有机酸为柠檬酸，并对加入柠檬酸后的混合液进行结晶处理，其中，所述混合液中柠檬酸质量浓度为0.1%，采用热饱和溶液低温结晶法结晶，其结晶温度为4°C，静置 72h ；
步骤7:将步骤6中得到的结晶物用适量纯净水冲洗、离心机过滤，然后通过冷冻干燥机冷冻干燥，得到粉末状的EGCG，其质量为1.4千克，其EGCG单体含量大于99%。
[0023]实施例2:
根据本发明实施例2的一种高含量EGCG的制备方法，包括以下步骤:
步骤1:以含有EGCG 60%的茶多酚提取物为原料，即低含量茶多酚提取物，选择低含量茶多酚提取物作为原料，避免了直接从天然植物中提取的繁琐工艺，最大程度的控制了成本，同时更加体现了本工艺的优越性。投料质量为2千克，将低含量茶多酚提取物进行溶解处理，溶剂为纯净水，得到茶多酚提取物溶液，所述溶解处理方式为超声或加热，所述超声或加热时间均为30min，所述加热温度为60°C ；
步骤2:将C18反向硅胶加入1%乙醇水溶液中，所述反向硅胶是在正相硅胶的基础上进行化学反应，把OH取代为0R，其中R是碳链的硅胶，C18反相硅胶即为含碳数值为18的反相硅胶，所述C18反相硅胶的目数为100目，所述C18反相硅胶的加入量视层析柱的规格而定，所述C18反相硅胶的柱体积为47 L，所述C18反向硅胶与1%乙醇水溶液充分混合，混合后的湿视密度为0.75kg/L，1%乙醇水溶液与C18反向硅胶的体积比为1:3，将充分混合C18反向硅胶的1%乙醇水溶液加入预先配置的层析柱中，反复加压使C18反相硅胶堆积更稳固；
步骤3:采用湿法上柱，将步骤I所得到的茶多酚提取物溶液加入至所述层析柱中，所述茶多酚提取物溶液吸附于所述层析柱中的C18反相硅胶上，其吸附时间为30min-60min ；步骤4:利用预先配制的1%乙醇水溶液对经过步骤3处理的层析柱中的C18反相硅胶进行洗脱，所述1%乙醇水溶液的体积是茶多酚提取物溶液体积的I倍，此部分洗脱液不收集，洗脱过程可除去部分非酯型儿茶素、部分色数以及多糖等极性较大的杂质，当1%乙醇水溶液流至C18反相硅胶表面5cm时，利用预先配制的15%乙醇水溶液继续洗脱所述层析柱中的C18反相娃胶；
步骤5:在所述15%乙醇水溶液流至层析柱口时，开始收集洗脱液，并在收集5个所述层析柱柱体积的洗脱液情况下，停止对所述层析柱进行洗脱，洗脱液收集量为235升；
步骤6:将步骤5中收集到的5个柱体积的洗脱液，通过减压浓缩锅或单效蒸发器进行减压浓缩，其体积浓缩至原体积的3%，得到7升浓缩液，在所得到的浓缩液中加入预先配制的有机酸，所述有机酸为柠檬酸，并对加入柠檬酸后的混合液进行结晶处理，其中所述混合液中柠檬酸质量浓度为1%，采用热饱和溶液低温结晶法结晶，结晶温度为4°C，静置168h ；步骤7:将步骤6中得到的结晶物用适量纯净水冲洗、离心机过滤，然后通过冷冻干燥机冷冻干燥，得到粉末状的EGCG，其质量为0.5千克，其EGCG单体含量大于99%。
[0024]具体实施过程中，上述高含量EGCG的制备方法不仅限于实验室实施，也能够在工厂化生产中实施，实施过程需将所涉及的物料质量及所需溶剂的体积按照比例进行扩大，由于该制备方法处理溶剂量小，纯化效率高，因此，在工厂化生产中，排除设备故障等因素，所述高含量EGCG的日产量可达吨级。
[0025]综上所述，借助于本发明的上述技术方案，生产过程中有效避免了使用大量有毒溶剂，生产过程更加环保，溶剂处理量小，操作简单易行，对于难分离的酯型儿茶素EGCG和ECG，可做到一次性分离，分离效果好，分离效率高，提纯物含量高，结晶时间短，产品不易氧化，产品色泽好、纯度高。
[0026]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种高含量EGCG的制备方法，其特征在于，包括: 步骤1:对预先选择的含有EGCG的茶多酚提取物原料进行溶解处理，溶剂为纯净水，得到茶多酚提取物溶液； 步骤2:将硅胶加入适量的预先配制的1%乙醇水溶液中，充分混合均匀后，加入预先配置的层析柱； 步骤3:将步骤I所得到的茶多酚提取物溶液加入至所述层析柱中，所述茶多酚提取物溶液吸附于所述层析柱中的硅胶上； 步骤4:利用预先配制的1%乙醇水溶液，对经过步骤3处理的层析柱中的硅胶进行洗脱，并且，在该1%乙醇水溶液流至所述层析柱中的硅胶表面时，利用预先配制的10-20%乙醇水溶液继续洗脱所述层析柱中的硅胶； 步骤5:在所述10-20%乙醇水溶液流至所述层析柱柱口时，收集洗脱液，并在收集4-6个所述层析柱柱体积的洗脱液情况下，停止对所述层析柱进行洗脱； 步骤6:对步骤5得到的所述洗脱液进行减压浓缩处理，在所得到的浓缩液中加入预先配制的有机酸，并对加入有机酸后的混合液进行结晶处理，其中，所述混合液中有机酸质量浓度为0.1-1.0% ； 步骤7:对步骤6所得到的结晶进行冲洗、过滤、冷冻和干燥，制得粉末状高含量EGCG，其EGCG单体质量百分数大于99%。
2.根据权利要求1所述的高含量EGCG的制备方法，其特征在于，所述步骤I中溶解处理的方式为超声或加热，所述超声或加热时间均为30分钟，所述加热温度为60°C。
3.根据权利要求2所述的高含量EGCG的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，1%乙醇水溶液与硅胶的体积比为1:3。
4.根据权利要求3所述的高含量EGCG的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，采用的娃胶为C18反向娃胶,其目数为100目。
5.根据权利要求4所述的高含量EGCG的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，硅胶与1%乙醇水溶液充分混合的湿视密度为0.75kg/L。
6.根据权利要求5所述的高含量EGCG的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，茶多酚提取物溶液与硅胶的吸附时间为30-60分钟。
7.根据权利要求6所述的高含量EGCG的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，1%乙醇水溶液的体积是所述步骤3中茶多酚提取物溶液体积的1-2倍。
8.根据权利要求7所述的高含量EGCG的制备方法，其特征在于，所述步骤6中有机酸为柠檬酸、草酸和酒石酸中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的高含量EGCG的制备方法，其特征在于，所述步骤6中，结晶方法采用热饱和溶液低温结晶法，结晶温度为4°C。
【文档编号】C07D311/62GK104356105SQ201410562697
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月22日 优先权日:2014年10月22日
【发明者】王辉 申请人:北京康育博尔生物科技有限公司