一种海参抗氧化多肽的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种海参抗氧化多肽及其制备方法，该方法以海参肉或海参内脏蛋白为原料，通过对酸性蛋白酶的酶解，分离纯化得到特异性海参抗氧化多肽，其氨基酸全序列为：kvlltflvv。本发明所制得的海参抗氧化多肽弥补了天然抗氧化剂所具有的缺陷，并且消除了公众对人工合成抗氧化剂的忧虑，为开发基于食品源的抗氧化多肽以及探索其在食品、医学上的广泛应用奠定了基础。
【专利说明】一种海参抗氧化多肽
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，提供了一种海参抗氧化多肽。
【背景技术】
[0002] 生物分子的氧化是一个自由基介导的过程，它会对食品和生物系统造成许多不利 的影响。在好氧器官内，与动脉硬化、癌症等多种疾病相关的游离自由基会不可避免地随着 氧代谢的过程而产生。在食品中，营养成分的氧化会产生过氧化物，其不仅会影响食品的营 养价值，造成食品品质下降，严重的甚至还会导致摄入者的身体发生疾病。因此，寻找安全 的抗氧化剂以抑制过氧化物产生一直是生化营养学的研究热点。由于BHT、TBHQ等化学合 成抗氧化剂比天然抗氧化剂具有更好的效果和更便宜的价格，因此其已经被广泛应用于食 品行业中。但是，目前有研究发现合成抗氧化剂对人体肝、脾、肺等器官具有蓄积性致癌作 用，从而引起了人们对其安全性的担忧，并且开始逐渐限制其在食品中的使用。于是人们把 目光转向天然抗氧化剂。a -生育酚是一种被普遍使用的天然抗氧化剂，它能有效保持食品 中油脂的稳定性，但是却不利于食品保存。因此，我们有必要寻找一种其它来源的安全的天 然抗氧化剂。
[0003] 多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，使蛋白质具有一定的生 理功能。在人类的生命活动中，肽在体内的消化吸收优于游离的氨基酸，且有着区别于氨基 酸的体内输送体系。某些短肽在提供人体生长、发育所必需的营养物质的同时，还能够防病 治病，调节人体机能，这些具有生物活性的多肽被称为生物活性肽。研究发现，很多不同来 源的多肽都具有抗氧化能力，如水解酪蛋白、大豆蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、油料种子 蛋白、小麦醇溶蛋白和玉米蛋白等得到的多肽都具有一定的抗氧化性。
[0004] 国内海参加工目前大多停留在初级加工阶段，由于资源利用率低，加工过程产生 的下脚料浪费等原因造成资源浪费，甚至是环境污染。海参肉或海参内脏中含有大量蛋 白质，且其组成均衡，利用现代生物技术对其中的蛋白质资源进行深加工，合理的选用酶类 等，通过工艺优化将使得抗氧化活性肽的研究具有更广阔的前景。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对天然抗氧化剂的不足、以及人工合成抗氧化剂的安全性堪 忧，提供一种海参抗氧化多肽及其制备方法。本发明制得的海参抗氧化多肽抗氧化活性高， 弥补了天然抗氧化剂的缺陷，消除了人们对人工合成抗氧化剂安全性的担忧。
[0006] 为了实现发明目的，本发明采用如下技术方案： 一种海参抗氧化多肽，其氨基酸序列为：kvlltflvv。
[0007] -种制备如上所述的海参抗氧化多肽的方法：以海参肉或海参内脏为原料提取蛋 白，然后对其进行酶解；酶解产物经浓缩除杂得海参多肽溶液，海参多肽溶液再经分离纯 化、冷冻干燥得到海参抗氧化多肽。
[0008] 所述酶解条件为：pH为3. 5、温度50°C、酶解时间为6 h、酶-底物配比为3000U/ g;所述酶为酸性蛋白酶。
[0009] 所述分离纯化的方法包括超滤、SP-Sephadex C-25离子交换色谱、Sephadex G-50 分子筛和RP-HPLC反相高效液相色谱。
[0010] 所述分离纯化的具体步骤为： (1) 首先利用膜过滤系统对海参多肽溶液进行超滤分离，得到不同分子量的多肽组 分； (2) 收集具有最佳抗氧化活性的组分，用SP-Sephadex C-25阳离子交换色谱进行分离， 上样后洗去未吸附组分，再以乙酸-乙酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为0. 5ml/min， 在215nm下进行测量，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性； (3) 收集具有最佳抗氧化活性的组分，用S印hadex G-50凝胶色谱进行分离，洗脱液为 去离子水，流速为0. 5ml/min，在215nm下进行测量，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧 化活性； (4) 收集具有最佳抗氧化活性的组分，利用RP-HPLC反相高效液相色谱进行进一步的 分离，采用乙腈和水的混合液进行梯度洗脱，收集体积比为46 %乙腈和54 %水处的洗脱 峰，得到海参抗氧化多肽； (5) 利用蛋白质固相序列分析仪鉴定多肽的氨基酸序列。
[0011] 步骤（1)中所述的多肽组分包括分子量彡3000 Da，1500-3000 Da，彡1500 Da的 组分。
[0012] 步骤（2)中所述的乙酸-乙酸钠缓冲液浓度为0. 02mol/L、pH4. 5,含0?0. 35mol/ L NaCl。
[0013] 步骤（4)中分离时所用色谱柱为Gemini 5 ii C18,上样量为IOOii L，流速为Iml/ min，检测波长为215nm。
[0014] 步骤（4)中梯度洗脱为：洗脱液自含体积比为10%乙腈和90%水的混合液开始，至 体积比为90%乙腈和10%水的混合液结束。
[0015] 本发明立足于寻找一种天然高效的抗氧化剂，以海参蛋白为出发点，通过酸性蛋 白酶的切割条件控制，切割为具有特定的肽链长度和结构域组成的活性多肽，而使抗氧化 活性得以高效实现。
[0016] 本发明改变了现有抗氧化剂的提取与运用的思路和方法，消除了人工合成抗氧化 剂所可能引起的副作用，所提取得到的海参抗氧化多肽是天然抗氧化剂，可以取代传统的 合成抗氧化剂；并且本发明还改善了我国对海参蛋白利用率偏低的情况，既可解决大量海 参资源的高效利用问题，又能解除消费者对抗氧化剂在食品安全方面的顾虑，对科技、经济 和食品工业的发展具有深远意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为海参抗氧化多肽的RP-HPLC图谱，C峰为海参抗氧化多肽的色谱峰； 图2为纯化的海参抗氧化多肽清除DPPH自由基的"量-效"关系曲线。
[0018] 图3为纯化的海参抗氧化多肽清除ABTS自由基的"量-效"关系曲线。
[0019] 图4为纯化的海参抗氧化多肽抑制Fe2+诱导卵黄脂蛋白多不饱和脂肪酸过氧化反 应的"量-效"关系曲线。
【具体实施方式】
[0020] 海参抗氧化多肽的制备方法，具体步骤如下： (1) 海参蛋白的提取 海参蛋白质提取工艺条件为： 将海参或海参内脏清洗3-5次，浸提pH为7.0,提取温度为40-80 °C，料液比为 1:4-1:8 (重量比)，提取时间为2-6 h，离心IOOOOg 20分钟，收集上清液，经过滤、浓缩和冷 冻干燥后得到海参蛋白。 (2) 海参蛋白的酶解 酶购自上海生物试剂公司（中国?上海)。
[0021] 采用酸性蛋白酶酶解海参蛋白，蛋白浓度为30mg/ml，酶解条件取pH为3. 5、温度 50°C、酶解时间为6h、酶与底物比为（3000U/g)，用2M HCl调节pH稳定，水解6h后，沸水浴 中灭酶15min，然后迅速冷却至室温，置于离心机中，以4000r/min离心15min，取上清液备 用。
[0022] (3 )酶解产物的浓缩、除杂 利用纳滤系统对蛋白酶解液进行浓缩后，加入4倍体积乙醇沉降大分子蛋白质， 12000r/min离心20min得上清液即为海参多肽溶液。
[0023] (4)酶解产物的分离 利用膜过滤系统对海参多肽溶液进行超滤分离，利用分子量截留范围不同的超滤膜对 酶解产物进行分离，得到不同分子量的多肽，包括彡3000 Da，1500-3000 Da，彡1500 Da等 组分。
[0024] (5)酶解产物的纯化 将得到的酶解产物分为3个分子量范围不同的组分，分别为分子量大于3000Da的组 分、分子量介于1500Da和3000Da的组分、分子量小于1500Da的组分；收集具有最佳抗氧化 活性的组分，再经过SP-Sephadex C-25阳离子交换色谱(长20cm，直径I. 6cm)进行分离， 以含0?0? 35mol/L NaCl的0? 02mol/L、pH4. 5乙酸-乙酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱， 流速为〇. 5ml/min ;收集具有最佳抗氧化活性的组分，再用Sephadex G-50 (长100cm，直径 2. 6cm)凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0. 5ml/min，洗脱峰在215nm下进行 测量；收集具有最佳抗氧化活性洗脱峰对应的组分，利用RP-HPLC反相高效液相色谱进行 再进一步的分离，所用色谱柱为Gemini C18,上样量为IOOiiL,流速为lml/min，检测 波长为215nm。洗脱液自含10%乙腈和90%水（v/v)的混合液开始，至90%乙腈和10%水 (v/v)的混合液结束，进行梯度洗脱，收集46 %乙腈和54 %水（v/v)处的洗脱峰对应的组 分，得到本发明的高纯度的海参抗氧化多肽。
[0025] (6)抗氧化多肽的氨基酸序列测定 利用蛋白质固相序列分析仪（Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co-MA， U.S.A) 测定本发明的抗氧化多肽的氨基酸全序列为 kvlltflvv。
[0026] ( 7 )抗氧化活性的测试 i DPPH自由基清除能力的测定 利用DPPH (l，l-Diphenyl-2-picryl_hydrazyl)自由基清除率测定法研究抗氧化多 肽。配制浓度为I X 10_5m〇l/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。将2mL，0. ImM的DPPH无水 乙醇溶液加入到含有2mL不同酶解样品的洁净试管中，混匀。室温下放置30min后，于517 nm处测定吸光度，吸光值越小，表明自由基清除能力越强。 情除率(。。>=[I-(ArAj)A:,) X 100。0
[0027] 式中，Atl为2 mL，0. ImM的DPPH无水乙醇溶液+2mL的样品溶剂，空白对照；Ai为 2mL，0. ImM的DPPH无水乙醇溶液+2mL的样品；Aj为2mL的无水乙醇+2 mL的样品。
[0028] ii ABTS自由基清除活性的测定 以去离子水将ABTS溶解，使ABTS浓度达到7mmol/L，加入过硫酸钾，使过硫酸钾的浓 度为2. 45 mmol/L。之后将该溶液在室温下置于暗处过夜12?16h。将生成的ABTS自由 基溶液用磷酸缓冲液（？83,0.2 111〇1/1，？117.4)稀释，使其在73411111下的吸光值为0.70。取 0. Iml酶解液与2. 9ml ABTS自由基液混合，摇匀30s，暗处反应10 min，然后在734nm下测 定反应液的吸光值。以蒸馏水代替水解液作空白。 精除率。)=(A:,- A:) A:, X 1 〇〇。0
[0029] 式中，Atl为2. 9 mL ABTS试剂与0. I mL蒸馏水混合液的吸光值；Aj为2. 9 mL ABTS 试剂与0. I mL酶解液混合液的吸光值。
[0030] iii抗脂质体过氧化活性的测定 用等体积新鲜的鸡蛋卵黄和磷酸缓冲液（pH7.4,0. lmol/L)混合，使用前稀释25 倍并用磁力搅拌机搅拌均匀。在试管中分别加入2.4ml卵黄稀释液、2.4ml 25mmol/L FeSO4 ? H20、200 ii L水解液样品，混匀后在37°C下水浴4h，加入0. 8ml 50%三氯乙酸和2ml TBA，混勻后在95°C恒温30min。冷却至室温后，8000r/min离心20min，取上清液于532nm 下测定吸光值。以蒸馏水代替水解液作为空白。 抑制率(D a)= ((A:,- A〇A:i〕X 1 〇〇°。
[0031] 式中，Aci为空自对照组的吸光度▲为样品组的吸光度。
[0032] 为了进一步了解本
【发明内容】
、特点及功效，兹例举以下实施例，但本发明不限于以 下实施例。
[0033] 实施例1 称取5.0克海参蛋白用去离子水溶解并定容至250ml，然后用2mol/L HCl将其pH调 节至3. 0。先将该溶液水浴加热到50°C，接着再按照酶-底物配比为3000U/g的比例加入 相应量的酶，酶解时间为6小时。接着在沸水浴中灭酶15分钟，冷却后再4000rpm离心15 分钟。收集上清液备用。
[0034] 将上清液利用膜过滤系统对海参多肽溶液进行超滤分离，利用分子量截留范围不 同的超滤膜对酶解产物进行分离，得到彡3000 Da，1500-3000 Da，彡1500 Da的不同组分， 测定其抗氧化活性。测定结果为：分子量小于1500Da的组分具有最好的抗氧化活性。
[0035] 收集分子量小于1500Da的组分，用SP-S印hadex C-25阳离子交换色谱(长20cm， 直径I. 6cm)进行再进一步的分离，以含0. 25mol/L NaCl的0. 02mol/L、pH4. 5乙酸-乙酸 钠缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为〇. 5ml/min，洗脱峰在215nm下进行测量，收集各峰对 应的组分并测定抗氧化活性。
[0036] 将分离出来的抗氧化活性最明显的组分峰用S印adex G-50凝胶过滤色谱(长 20cm，直径I. 6cm)再进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0. 5ml/min，洗脱峰在215nm下进 行测量。收集各峰并测定抗氧化活性。
[0037] 将分离出来的最好的抗氧化活性组分利用RP-HPLC反相高效液相色谱进行再进 一步的分离，所用色谱柱为Gemini C18,上样量为IOOiiL,流速为lml/min，检测波长 为215nm。洗脱液自含10%乙腈和90%水（v/v)的混合液开始，至90%乙腈和10%水（v/v) 的混合液结束，进行梯度洗脱，收集46 %乙腈和54 %水（v/v)处的洗脱峰，得到本发明的 高纯度的特异性抗氧化多肽，如图1所示。C峰为该抗氧化多肽的色谱峰，得到高纯度的海 参抗氧化多肽。
[0038] 纯化后的海参抗氧化多肽具有很强的抗氧化能力，由图2、图3和图4可以看出，它 具有较强的清除DPPH自由基、ABTS自由基以及抑制脂质过氧化反应的能力。
[0039] 利用蛋白质固相测序仪（Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co-MA， U.S.A) 测定纯化后的抗氧化多肽的氨基酸序列。得到其氨基酸全序列为：kvlltflw。
[0040] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【权利要求】
1. 一种海参抗氧化多肽，其特征在于：所述海参抗氧化多肽的氨基酸序列为： kvlltflvv〇
2. -种制备如权利要求1所述的海参抗氧化多肽的方法，其特征在于：以海参肉或海 参内脏为原料提取蛋白，然后对其进行酶解；酶解产物经浓缩除杂得海参多肽溶液，海参多 肽溶液再经分离纯化、冷冻干燥得到海参抗氧化多肽。
3. 根据权利要求2所述的海参抗氧化多肽的制备方法，其特征在于：所述酶解条件为： pH为3. 5、温度50°C、酶解时间为6 h、酶-底物配比为3000U/g ;所述酶为酸性蛋白酶。
4. 根据权利要求2所述的海参抗氧化多肽的制备方法，其特征在于：所述分离纯化的 方法包括超滤、SP-Sephadex C-25离子交换色谱、Sephadex G-50分子筛和RP-HPLC反相高 效液相色谱。
5. 根据权利要求2所述的海参抗氧化多肽的制备方法，其特征在于：所述分离纯化的 具体步骤为： (1)首先利用膜过滤系统对海参多肽溶液进行超滤分离，得到不同分子量的多肽组 分； (2 )收集具有最佳抗氧化活性的组分，用SP-Sephadex C-25阳离子交换色谱进行分离， 上样后洗去未吸附组分，再以乙酸-乙酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为0. 5ml/min， 在215nm下进行测量，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧化活性； (3) 收集具有最佳抗氧化活性的组分，用S印hadex G-50凝胶色谱进行分离，洗脱液为 去离子水，流速为0. 5ml/min，在215nm下进行测量，测定各吸收峰对应的洗脱组分的抗氧 化活性； (4) 收集具有最佳抗氧化活性的组分，利用RP-HPLC反相高效液相色谱进行进一步的 分离，采用乙腈和水的混合液进行梯度洗脱，收集体积比为46 %乙腈和54 %水处的洗脱 峰，得到海参抗氧化多肽； (5) 利用蛋白质固相序列分析仪鉴定多肽的氨基酸序列。
6. 根据权利要求5所述的海参抗氧化多肽的制备方法，其特征在于：步骤（1)中所述的 多肽组分包括分子量彡3000 Da，1500-3000 Da，彡1500 Da的组分。
7. 根据权利要求5所述的海参抗氧化多肽的制备方法，其特征在于：步骤（2)中所述的 乙酸-乙酸钠缓冲液浓度为0. 02mol/L、pH4. 5,含0?0. 35mol/L NaCl。
8. 根据权利要求5所述的海参抗氧化多肽的制备方法，其特征在于：步骤（4)中分离时 所用色谱柱为Gemini 5 ii C18,上样量为100 ii L，流速为lml/min，检测波长为215nm。
9. 根据权利要求5所述的海参抗氧化多肽的制备方法，其特征在于：步骤（4)中梯度 洗脱为：洗脱液自含体积比为10%乙腈和90%水的混合液开始，至体积比为90%乙腈和10% 水的混合液结束。
【文档编号】C07K1/20GK104356201SQ201410614617
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】汪少芸, 李灵, 赵立娜, 邵彪 申请人:福州大学