一种青鱼IFN-γ基因及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种青鱼IFN-γ基因及应用。一种分离的青鱼IFN-γ基因，其序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示，本发明应用荧光定量PCR检测了IFN-γ基因在Poly I:C诱导后的表达变化。发现在肾、脾、鳃、头肾和皮肤组织中，Poly I:C能显著诱导IFN-γ的表达，通过转染重组质粒到草鱼CIK细胞，在体外成功表达青鱼IFN-γ。将青鱼IFN-γ基因的开放阅读框序列连接到真核表达载体pcDNA3.1（+）上制备成DNA疫苗注射入青鱼体内，能显著增强鱼体对病毒的感染预防能力。
【专利说明】_种青鱼IFN-Y基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种青鱼IFN-γ基因及应用。 技术背景
[0002] 干扰素（IFN)是一类能够诱导脊椎动物细胞进入抗病毒状态的分泌型细胞因子， 根据基因、蛋白结构及功能性质的不同，分为I型、II型和III干扰素。与I型和III干扰素不 同，脊椎动物的II型干扰素迄今为止仅发现INF- γ。IFN- γ主要由NK细胞、激活T淋巴细 胞、巨噬细胞和神经元细胞等特定细胞产生。在天然免疫中，细胞内病原体感染引起单核吞 噬细胞和抗原提呈细胞分泌IL-12和IL-18, IL-12和IL-18刺激NK细胞分泌IFN-γ，然 后IFN-γ诱导巨噬细胞产生毒性物质如活性氧中间物和活性氮中间物，清除胞内病原体； IFN-γ也可通过诱导宿主细胞合成大量抗病毒蛋白如2' -5'寡聚腺苷酸合成酶、dsRNA依 赖蛋白激酶（PKR)、G结合蛋白和腺苷脱氨酶，建立起抗病毒状态。IFN-γ还调节T细胞增 殖和分化、介导白细胞聚集、增强抗原提呈，在细胞介导的适应性免疫反应中起更重要的作 用。最近几年来，IFN-γ基因序列已经在几种鱼中被克隆到，包括斑马鱼、河豚鱼、虹鳟、大 西洋鲑、斑点叉尾鮰、金鱼、鲤鱼等。
[0003] 青鱼（Mylopharyngodon piceus)是中国主要淡水养殖的经济鱼类，本发明对青鱼 IFN-γ基因进行克隆和序列分析，并在草鱼CIK细胞中表达，旨在为研宄青鱼IFNy基因的 组织结构、遗传进化特点、表达调控规律及其在抗病毒免疫中对其他细胞因子的调控作用 奠定了基础。
【发明内容】
[0004] 本发明公开了一种青鱼IFN-γ基因，其序列为SEQ ID NO. 1所述，编码的氨基酸 序列为SEQ ID NO. 2所示，在天然免疫中青鱼IFN-γ能调节部分免疫基因表达。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供了一种青鱼IFN-γ基因在制备提高淡水鱼免疫力 药物中的应用。优选用于青鱼，将该制备为DNA疫苗，用于青鱼，可明显提高青鱼的免疫力。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0007] -种青鱼IFN-γ基因，通过以下步骤制备得到：
[0008] 按Trizol (Invitrogen)说明书提取总青鱼组织RNA。将各组织的总RNA分别用 Dnase I (Takara)处理后，利用反转录试剂盒SMART PCR cDNA Synthesis Kit(Clontech) 进行反转录合成cDNA第一链。
[0009] 根据已知硬骨鱼类IFN-γ序列设计简并引物JBl-F和JB1-R。扩增得到中间片 段后，再按 SMARTer RACE cDNA Amplification kit(Clontech)分别设计正向（RACE1-3F， RACE2-3F)和反向（RACE1-5R，RACE2-5R)的巢式引物，经两轮PCR反应扩增其3'和5' 端片段。反应条件为：94°C 5min ;94°C 30s，65?72°C 45s，运行5循环；94°C 30s，65? 72°C 45s，运行 5 循环；94°C 30s，65 ?72°C 30s，72°C 45s，运行 27 循环；72°C lOmin。将第 一轮PCR扩增产物用无菌水稀释50倍后取I μ L稀释液做为第二轮PCR反应的模板，反应 条件为：94°C 5min ;94°C 30s，60 ?70°C 30s，72°C 45s，运行 35 循环；72°C lOmin。。目的产 物经I. 2%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收纯化，测序结果拼接后，即得到青鱼IFN-γ基因， 其序列为SEQID NO. 1所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO. 2所示，开放阅读框为549bp，编码 182个氨基酸。
[0010]
【权利要求】
1. 一种分离的青鱼IFN-Y蛋白，其序列为SEQ ID NO. 2所示。
2. 权利要求1所述蛋白对应的核苷酸序列。
3. 根据权利要求2所述的核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO. 1所示。
4. 权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的基因在制备提高淡水鱼免疫力药物中的 应用。
5. 根据权利要求4的应用，所述的淡水鱼为青鱼。
【文档编号】C07K14/57GK104479004SQ201410707864
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】周勇, 曾令兵, 范玉顶 申请人:中国水产科学研究院长江水产研究所