一种纯化尿促卵泡素的工艺的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种纯化尿促卵泡素的工艺。本发明的技术方案是利用协和树脂、DEAE-Cellulose柱层析、CM-Sepharose柱层析、Aptamer-Sepharose柱层析等工序将尿促卵泡素粗品进行纯化的一种工艺，本发明具有工艺技术简化,产品收率高,生产成本低等优点。
【专利说明】一种纯化尿促卵泡素的工艺
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体地说是一种简单安全从尿促卵泡素粗品中纯化得到其精品的一种方法。
【背景技术】
[0002]尿促卵泡素是由垂体前叶嗜碱性细胞合成、分泌的一类糖蛋白，由有α、β两个亚基组成，α有85个氨基酸，β有115个氨基酸，特异性由β亚基组成，分子量约为33000.尿促卵泡素的主要生理功能是促进卵泡的各种细胞生长、发育，以利于卵母细胞的成熟。尿促卵泡素的作用包括:促进卵泡周期间质细胞分化为内外两层泡膜细胞并合成促黄体生成素受体；促进卵泡颗粒细胞增生和颗粒细胞内的芳香化酶系统活化，使雄激素转化为雌激素；促进卵泡液分泌，使卵泡细胞逐渐增大。尿促卵泡素主要针对排卵障碍引起的不孕症，并广泛应用于人工受精、试管婴儿等辅助生育技术中。目前，尿促卵泡素的提取工艺比较复杂，生产周期长，产品收率不高，导致生产成本大大增加，无法满足市场需求。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是针对现有技术的补足而提供一种尿促卵泡素的提取方法，利用本方法可显著地简化工艺、缩短生产周期、降低耗能、提高产品活性、收率、纯度。
[0004]本发明的具体提取方法，敖阔以下流程；将粗品通过粗品提取，协和树脂、DEAE-Cellulose 柱层析、CM-Sepharose 柱层析、Aptamer-Sepharose 柱层析、去热原工序纯化得到高纯度尿促卵泡素。
[0005]所述的制备方法步骤为:
(I)粗品提取:在8_12°C条件下，将粗制品干粉按1:30比例投入乙酸钱粗提取液中，搅拌2小时，离心，取上清液，离心渣按1:20比例加乙酸铵粗提取液，搅拌1.5小时，离心取上清液，合并两次上清液，按1:2倍比例加95%乙醇，搅拌半小时，静止12-16小时；去上清液，沉淀物用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，沉淀物真空干燥得粗提品。
[0006](2)协和工序:在8_12°C条件下，将粗提品溶于100倍量的醋酸钠缓冲液，搅拌溶解，离心取上清液；沉淀物用50倍量醋酸钠缓冲液溶解，离心，取上清液，；合并上清液，加入粗品干粉10倍量的协和树脂，搅拌2小时，离心弃去上清液；沉淀物用醋酸钠缓冲液洗涤至280nm0D值小于0.25为止；按树脂的8倍量加入乙酸铵洗脱液，搅拌洗脱2小时，离心得上清液；再按树脂的6倍量加入乙酸铵洗脱液，搅拌洗脱2小时，离心得上清液，弃去树脂；合并两次上清液，加入6倍量(V/V)的95%乙醇，搅拌30分钟，静置12-16小时；去上清液，沉淀物用无水乙醇脱水两次，离心去上清液，沉淀物置真空干燥箱中真空内干燥得协和品。
[0007](3) DEAE-Cellulose柱层析工序:在8-10°C条件下，将协和品溶于100倍的Tris-HCl缓冲液(SB)中，搅拌使其溶解；以50_60ml/min的流速上样；上样结束后，用SB洗涤至峰回落到接近基线；用含0.5mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱至峰回落到接近基线；用含I mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱，收集洗脱活性峰；量出收集液体积，加入5倍量95%乙醇，搅拌沉淀12-16小时；弃去上清液，离心，弃上清液；用无水乙醇洗涤，研磨，离心弃去上清液，重复二次；将沉淀物置真空干燥箱内干燥，干燥后得DE层析品。
[0008](4)CM-Sepharose柱层析工序:在8_10°C条件下，将DE层析品溶于100倍的醋酸钠缓冲液中，搅拌溶解；，以50-60ml/min的流速上样；上样结束后，用醋酸钠缓冲液洗涤至峰回落到接近基线；用含0.lmol/L NaCl的磷酸钠缓冲液洗脱至峰回落到接近基线；用含0.5mol/L NaCl的磷酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱活性峰；量出收集液体积，加入5倍量乙醇，沉淀12-16小时；弃上清液，离心弃上清液；用无水乙醇洗涤，研磨，离心弃去上清液，重复二次；将沉淀物置干燥箱内干燥，干燥后得CM层析品。
[0009](5)Aptamer-Sepharose柱层析工序:在8_10°C条件下，将CM层析品溶于50倍的0.01mol/L磷酸钠缓冲液pH8.0 (SB)中，搅拌使其溶解、；以50_60ml/min的流速上样；上样结束后，用SB洗涤至峰回落到接近基线；用含0.lmol/L NaCl柠檬酸钠缓冲液(PH5.0)洗脱至峰回落到接近基线；用含0.5mol/L NaCl柠檬酸钠缓冲液(PH5.0)洗脱，收集洗脱活性峰；量出收集液体积，加入5倍量95%乙醇，沉淀12-16小时；弃去上清液，离心弃去上清液；用无水乙醇洗涤，研磨，离心弃上清液，重复二次；将沉淀物干燥，干燥后得AS层析品；
(6)去热原:将AS层析品溶解于纯化水中，加入乙醇和乙酸铵，加入0.2mol/L磷酸钠溶液，搅拌，加入0.3mol/L醋酸钙，用5mol/L氢氧化钠溶液调节PH至8.3-8.7，离心，弃沉淀物，上清液用5mol/L盐酸溶液调pH至6.5-7.0，加入5倍量95%乙醇，沉淀析出，离心干燥，得成品。
【具体实施方式】
[0010]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0011]实施例1
(I)粗品提取:在8-12°C条件下，将1g粗制品干粉投入300ml乙酸铵粗提取液中，搅拌2小时，离心，取上清液，离心渣按1:20比例加乙酸铵粗提取液，搅拌1.5小时，离心取上清液，合并两次上清液，按1:2倍比例加95%乙醇，搅拌半小时，静止12-16小时；去上清液，沉淀物用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，沉淀物真空干燥得粗提品8.2g。
[0012](2)协和工序:在8-12°C条件下，将粗提品溶于820ml醋酸钠缓冲液，搅拌溶解，离心取上清液；沉淀物用50倍量醋酸钠缓冲液溶解，离心，取上清液，合并上清液，加入粗品干粉82g协和树脂，搅拌2小时，离心弃去上清液；沉淀物用醋酸钠缓冲液洗涤至280nm0D值小于0.25为止；按树脂的8倍量加入乙酸铵洗脱液，搅拌洗脱2小时，离心得上清液；再按树脂的6倍量加入乙酸铵洗脱液，搅拌洗脱2小时，离心得上清液，弃去树脂；合并两次上清液约，加入6倍量(V/V)的95%乙醇，搅拌30分钟，静置12-16小时；去上清液，沉淀物用无水乙醇脱水两次，离心去上清液，沉淀物置真空干燥箱中真空内干燥得协和品5.3g。
[0013](3) DEAE-Cellulose柱层析工序:在8_10 °C条件下，将协和品溶于530mlTris-HCl缓冲液(SB)中，搅拌使其溶解；以50_60ml/min的流速上样；上样结束后，用SB洗涤至峰回落到接近基线；用含0.5mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱至峰回落到接近基线；用含I mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱，收集洗脱活性峰；量出收集液体积，加入5倍量95%乙醇，搅拌沉淀12-16小时；弃去上清液，离心，弃上清液；用无水乙醇洗涤，研磨，离心弃去上清液，重复二次；将沉淀物置真空干燥箱内干燥，干燥后得DE层析品3.3g。
[0014](4) CM-Sepharose柱层析工序:在8_10°C条件下，将DE层析品溶于330ml醋酸钠缓冲液中，搅拌溶解，以50-60ml/min的流速上样；上样结束后，用醋酸钠缓冲液洗涤至峰回落到接近基线；用含0.lmol/L NaCl的磷酸钠缓冲液洗脱至峰回落到接近基线；用含
0.5mol/L NaCl的磷酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱活性峰；量出收集液体积，加入5倍量乙醇，沉淀12-16小时；弃上清液，离心弃上清液；用无水乙醇洗涤，研磨，离心弃去上清液，重复二次；将沉淀物置干燥箱内干燥，干燥后得CM层析品2.0g。
[0015](5) Aptamer-Sepharose柱层析工序:在8_10°C条件下，将CM层析品溶于10ml的0.01mol/L磷酸钠缓冲液pH8.0 (SB)中，搅拌使其溶解；以50_60ml/min的流速上样；上样结束后，用SB洗涤至峰回落到接近基线；用含0.lmol/L NaCl柠檬酸钠缓冲液(PH5.0)洗脱至峰回落到接近基线；用含0.5mol/L NaCl柠檬酸钠缓冲液(PH5.0)洗脱，收集洗脱活性峰；量出收集液体积，加入5倍量95%乙醇，沉淀12-16小时；弃去上清液，离心弃去上清液；用无水乙醇洗涤，研磨，离心弃上清液，重复二次；将沉淀物干燥，干燥后得AS层析品412mg。
[0016](6)去热原:将AS层析品溶解于纯化水中，加入乙醇和乙酸铵，加入0.2mol/L磷酸钠溶液，搅拌，加入0.3mol/L醋酸妈，用5mol/L氢氧化钠溶液调节PH至8.3-8.7，离心，弃沉淀物，上清液用5mol/L盐酸溶液调pH至6.5-7.0，加入5倍量95%乙醇，沉淀析出，离心干燥，得到比活为12856国际单位/mg蛋白的尿促卵泡素397mg，其中卵泡刺激素的生物效价为11442 IU/mgo
[0017]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
【权利要求】
1.一种纯化尿促卵泡素的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: (I)粗品提取:在8-12°C条件下，将粗制品干粉投入乙酸铵粗提取液，搅拌，离心，取上清液，离心渣投入乙酸铵粗提取液，搅拌，离心取上清液，合并两次上清液，按1:2(V/V)倍比例加95%乙醇，搅拌，沉淀；去上清液，沉淀物用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，沉淀物真空干燥得粗提品；(2)协和工序:在8-12°C条件下，将粗提品溶于I醋酸钠缓冲液，搅拌溶解，离心取上清液；沉淀物用醋酸钠缓冲液溶解，离心，取上清液，合并上清液，加入协和树脂，搅拌2小时，离心弃去上清液；沉淀物用醋酸钠缓冲液洗涤至280nm0D值小于0.25为止；加入乙酸铵洗脱液，搅拌洗脱，离心得上清液；加入乙酸铵洗脱液，搅拌洗脱，离心得上清液，弃去树脂；合并两次上清液，加入6倍量(V/V)的95%乙醇，搅拌30分钟，静置12-16小时；去上清液，沉淀物用无水乙醇脱水两次，离心去上清液，沉淀物置真空干燥箱中真空内干燥得协和品；(3) DEAE-Cellulose柱层析工序:在8_10°C条件下，将协和品溶Tris-HCl缓冲液(SB)中，搅拌溶解；上样，上样结束后，用SB洗涤至峰回落到接近基线；用含0.5mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱至峰回落到接近基线；用含I mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液洗脱，收集洗脱活性峰；向收集液加入95%乙醇，搅拌沉淀12-16小时；弃去上清液，离心，弃上清液；用无水乙醇洗涤，研磨，离心弃去上清液，重复二次；将沉淀物置真空干燥箱内干燥，干燥后得DE层析品；(4) CM-Sepharose柱层析工序:在8_10°C条件下，将DE层析品溶于醋酸钠缓冲液中，搅拌溶解；上样，上样结束后，用醋酸钠缓冲液洗涤至峰回落到接近基线；用含0.lmol/L NaCl的磷酸钠缓冲液洗脱至峰回落到接近基线；用含0.5mol/L NaCl的磷酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱活性峰；向收集液加入乙醇，沉淀12-16小时；弃上清液，离心弃上清液；用无水乙醇洗涤，研磨，离心弃去上清液，重复二次；将沉淀物置干燥箱内干燥，干燥后得CM层析品；(5)Aptamer-Sepharose柱层析工序:在8_10°C条件下，将CM层析品溶于磷酸钠缓冲液(SB)中，搅拌使其溶解；上样，上样结束后，用SB洗涤至峰回落到接近基线；用含0.lmol/L NaCl柠檬酸钠缓冲液(PH5.0)洗脱至峰回落到接近基线；用含0.5mol/L NaCl柠檬酸钠缓冲液(PH5.0)洗脱，收集洗脱活性峰；向收集液加入95%乙醇，沉淀12-16小时；弃去上清液，离心弃去上清液；用无水乙醇洗涤，研磨，离心弃上清液，重复二次；将沉淀物干燥，干燥后得AS层析品； (6)去热原:将AS层析品溶解于纯化水中，加入乙醇和乙酸铵，加入0.2mol/L磷酸钠溶液，搅拌，加入0.3mol/L醋酸钙，用5mol/L氢氧化钠溶液调节PH至8.3-8.7，离心，弃沉淀物，上清液用5mol/L盐酸溶液调pH至6.5-7.0，加入5倍量95%乙醇，沉淀析出，离心干燥，得成品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(I)中，粗品与乙酸铵的比例为1:30(kg/V)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(3)中，Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH 值为 8.0。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(4)中，0.lmol/L NaCl的磷酸钠缓冲液和0.5mol/L NaCl的磷酸钠缓冲液的pH值为8.0。
【文档编号】C07K1/16GK104497129SQ201410807959
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月23日 优先权日:2014年12月23日
【发明者】刘乃山, 刘君, 刘翠珍 申请人:青岛康原药业有限公司