专利名称：苏芸金芽孢杆菌分离物在防治芽科害虫上的应用的制作方法
形成孢子的微生物苏芸金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)(B.t.)产生熟知的昆虫毒素。这种毒素是一种蛋白质，指定为δ-内毒素。它是由B.t.产孢细胞(sporulatingcell)合成的。敏感的昆虫幼虫咽下结晶形的毒素后，毒素被昆虫肠汁蛋白酶转化成生物活性部分。最初的靶标是昆虫肠上皮细胞，它们很快被损害。经验证明B.t.毒素的活性非常高，以致于只需要纳克量即可以杀死敏感昆虫。
据报道B.t.的活性谱覆盖鳞翅目类的昆虫，鳞翅目类的昆虫是农业和林业的主要害虫。其活性谱还包括双翅目的昆虫，其中有蚊子和墨蚊。参见deBarjac，H.(InH.deBarjac，D.J.Sutherland(eds.)BacterialControlofMosquitoesandBlackflies，RutgersUniversityPress，Chapter2)。美国专利U.S.4，771，131和4，996，155公开了对鞘翅目甲虫有活性的毒素基因。有关毒素活性的报道已超出了昆虫纲。在美国专利U.S.4，948，734中公开了具有对线虫有活性的B.t.菌株。
蚜虫(半翅目，蚜科)是刺吸式口器的昆虫，它能损害多种重要的植物。当蚜虫大量侵染植物时，植物发生损害。由于蚜虫可通过孤雌生殖进行繁殖，蚜虫的种群能够很快增加。大量的蚜虫有利于真菌的侵染。在蚜虫取食引起损害的同时，蚜虫可成为各种植物病毒病的媒介。
经济上重要的蚜虫包括桃蚜(Myzuspersicae)，蜿豆蚜(Acyrthosiphonpisum)，甘蓝蚜(Brevicorynebrassicae)，棉蚜(Aphisgossypii)，和蚕虫蚜(Aphisfabae)。
本发明涉及具有杀蚜虫性质的苏芸金芽孢杆菌分离物(isolates)。更具体地来说，本发明涉及指定为B.t.PS157C(也称作B.t.MT104)、B.t.PS86A1和B.t.PS75J1的苏芸金芽孢杆菌分离物在环境中防治蚜虫上的应用。
本文是通过实施例的方式，通过它们抗蜿豆蚜(Acyrthosiphonpisum)的活性，来表明本发明的B.t.分离物的杀蚜虫用途。因此，这些分离物可用于防治上述蚜虫和蚜科的其它蚜虫。此外，来源于这些B.t.分离物的δ-内毒素可通过常规的方法(例如离子交换)进行分离，并可通过常规方法配成制剂以防治这些有害昆虫。另外，本发明的来源于B.t.分离物的编码杀蚜虫毒素的基因，可从分离物中克隆，然后用于转化其它宿主，例如原核细胞、真核细胞或植物，上述转化了的宿主可用来防治蚜虫，或，就转基因植物来说，其本身即抗蚜虫。
本文中具体的实例是可从B.t.PS86A1中获得的基因86A1的克隆。利用本发明阐述的方法，本领域技术人员可以辨别其它B.t.杀蚜虫毒素，以及编码上述毒素的基因。
附
图1是显示本发明分离物的碱溶性蛋白质的12%SDS聚丙烯酰胺胶的照片。
附图2是质粒pMYC2320的限制性图谱(restrictionmap)。
SEQIDNO.1是B.t.PS86A1基因的DNA序列。
SEQIDNO.2是被B.T.PS86A1基因编码毒素的氨基酸序列。
SEQIDNO.3是按照本发明的肽序列。
SEQIDNO.4是按照本发明的肽序列。
SEQIDNO.5是按照本发明的肽序列。
SEQIDNO.6是按照本发明的肽序列。
SEQIDNO.7是按照本发明的肽序列。
SEQIDNO.8是86A1的N-末端氨基酸序列。
SEQIDNO.9是从SEQIDNO.3设计的寡核苷酸探针，指定为86A1-A。
SEQIDNO.10是按照本发明的核苷酸序列。
SEQIDNO.11是按照本发明的核苷酸序列。
SEQIDNO.12是按照本发明的核苷酸序列。
SEQIDNO.13是按照本发明的核苷酸序列。
SEQIDNO.14是按照本发明的核苷酸序列。
本发明涉及具有杀蚜虫活性的苏芸金芽孢杆菌分离物。这些分离物含有编码δ-内毒素的基因，该毒素是造成观察到的杀蚜虫活性的原因。因此，本发明涉及杀蚜虫的B.t.分离物，杀蚜虫的B.t.毒素，和编码这些毒素的基因。本发明另外的实施方案涉及用编码杀蚜虫的B.t.毒素的基因转化的重组宿主。在其优选的实施方案中，该转化的宿主是植物，该植物经B.t.基因转化而具有对蚜虫的抗性。本发明还涉及防治蚜虫的方法，所述方法包括使用本发明的分离物、毒素、基因和重组宿主。
本文中具体的实例是指定为B.t.PS157C1、B.t.PS86A1和B.t.PS75J1的分离物。另外的具体实例是指定为86A1的毒素和编码该毒素的基因。在本申请中描述的内容使本领域技术人员能够鉴别出其它具有杀蚜虫活性的毒素(和编码这些毒素的基因)。本发明的毒素除以杀蚜虫为特征外，还具有一种或多种以下特征1.与毒素86A1的高度氨基酸同源性。
2.编码毒素的核苷酸序列，其中核苷酸序列可与本文中公开的探针或基因杂交。
3.编码毒素的核苷酸序列，其中的核苷酸序列可用本文中公开的引物通过PCR扩增。
4.符合本文中提出的通式的氨基酸序列。
5.对毒素86A1引起的抗体的免疫反应性。
本发明的B.t.分离物具有区别于现有已知的B.t.分离物的特征。表1示出了本发明B.t.分离物与两种已知的B.t.株B.t.HD-1和B.t.s.d.的比较
CPB＝马铃薯甲虫;AW＝苜蓿叶象甲;CRW＝南瓜十二星叶甲;RFB＝油菜跳甲此外，所说分离物具有下述通性
菌落形态学-大菌落，暗淡表面，典型B.t.
营养细胞形态学-典型B.t.
本发明的B.t.分离物和其变异体，可用常规的已知培养基和发酵技术培养。完成发酵步骤后，通过现有技术中已知的方法，从发酵液中首先分离出B.t.孢子和结晶来收获细菌。可通过加入表面活性剂，分散剂，惰性载体和有利于处理和施用到具体的靶标害虫的其它成分，将收获的B.t.孢子和结晶配制成可湿性粉剂、液体浓缩物、颗粒剂或其它剂型。制剂和施用方法是本领域公知的，并和市售的品种一起使用。新的B.t.分离物和其变异体可用来防治靶标有害生物。
本发明的培养物保藏在AgriculturalResearchServicePlantCultureCollection(NRRL)，NorthernRegionalResearchCenter，1815NorthUniversityStreet，Peoria，Illinois，61604USA。
培养物收藏号保藏日期B.t.PS75J1NRRLB-187811991.3.7.
B.t.PS86A1NRRLB-184001988.8.16.
B.t.PS157C1(a.k.a.MT104)NRRLB-182401987.7.17E.coliNM522[pMYC2320]NRRLB-187691991.2.14本培养物已在在本专利申请未决期间，由专利和商标委员(CommissionerofPatentandTrademark)指定的按37CFR1.14和35U.S.C.122有资格的个人可获得的条件下保藏。在提交了本申请副本，或其成果的国家，根据外国专利法，需要时可以获得这些保藏物。但是应该清楚的是，不能许可以侵犯政府授予的专利权而实施本发明时利用保藏物。
另外，根据用于微生物保藏的布达佩斯条约(BudapestTreatyfortheDepositeofMicroorganisms)的条款，本培养物保藏物被贮藏并使之可被公众获得，即在最近的完成贮藏样品的要求后至少5年期间，和在任何情况下在贮藏期后至少三十(30)年期间或可发放公开培养物的任何专利的可实施期间将它们必要小心地保藏，以保持它们的生活力和不被污染。当不能提供样品满足按保藏条件的要求时，保藏者有义务更新保藏物。一旦公开培养物的专利被授权，所有对公众利用它们的限制，将不可逆转地消除。
本发明还包括所说分离物的变异体，这些变异体具有全部和部分编码具有杀蚜虫活性的本发明毒素和其它毒素的基因。上述微生物变异体可用本领域技术人员公知的技术分离或制造。例如，UV照射可用来制备宿主微生物的变异体。而且，上述变异体可包括不产生孢子的宿主细胞，该细胞也可用本领域公知的方法制备。例如，通过新分离物的乙基甲烷磺酸酯(盐)(EMS)诱变可获得不产生孢子的突变体。少数不产生孢子的突变体在扩大发酵期间仍保持完整且不发生细胞溶解;这些菌株指定为溶菌负型(-)。通过在振荡的摇瓶培养基中筛选不产生孢子的突变体可鉴别溶菌负型菌株并选择那些在发酵结束时仍保持完整和含有毒素结晶的突变体。溶菌负型菌株适合于细胞固定化方法，该方法产生一种被保护的、被包囊的毒素蛋白质。
为了制备所述不产生孢子突变体的噬菌体抗性变异体，将一等份的噬菌体溶菌产物散布到营养琼脂上并使之干燥。然后将一等份的噬菌体敏感细菌菌株直接平铺在干燥的溶菌产物上，并使之干燥。在30℃温育平面，将该板温育2天，此时，可见大量的菌落生长在琼脂上。取出一些这些菌落，并在营养琼脂平面上继代培养。通过用噬菌体溶菌产物交叉划线，测试这些外表抗性的培养物的抗性，在板上一条噬菌体溶菌产物被划线并使之干燥。推定的抗性培养物此后在噬菌体线上交叉划线。在30℃整夜温育后，在噬菌体交叉划线上的抗性细菌培养物没有显示任何溶菌作用。通过在营养琼脂平板上培养抗性培养物的平板菌苔，再次确定其对噬菌体的抗性。以相同方法培养敏感菌株用作正对照。干燥后，一滴噬菌体溶胞产物放在平板的中央，并使之干燥。在30℃培养24小时后，在噬菌体溶菌产物放置的区域，抗性培养物不显示溶菌作用。
通过本领域公知的方法，采用紫外光和亚硝基胍也可制备所说变异体。
本文中，通过指定为86A1的毒素，具体地例示了本发明的杀蚜虫毒素。本发明还包含具有和86A1相同或类似生物活性的等效毒素(和编码等效毒素的核苷酸序列)。等效毒素可与本文中公开的和权利要求要求的毒素具有氨基酸同源性。典型的氨基酸同源性大于50%，优选的大于75%，更优选的大于90%。在与生物活性有关的毒素的某些关键区域氨基酸同源性会更高，或者氨基酸同源性涉及最终决定生物活性的三维构型的确定。就这一点来说，如果置换在对活性不重要的区域或是不影响分子的三维构型的保守氨基酸置换，则某些氨基酸置换是可接受的和被期望的。例如，氨基酸可为下列类别非极性、无电荷极性、碱性和酸性。只要该置换不从实质上改变化合物的生物活性，一组中的氨基酸被同类的其它氨基酸取代的保守置换就在本发明的范围内。表2提供了属于各类氨基酸的例示实例。
表2氨基酸类别氨基酸实例非极性Ala,Val,Leu,Ile,Pro,Met,Phe,Tep无电荷极性Gly,Ser,Thr,Cys,Tyr,Asn,Gln酸性Asp,Glu碱性Lys,Arg,His在一些情况下，也可进行非保守置换。重要的因素是这些置换必须不能明显降低毒素的生物活性。已经表明如果不改变蛋白质二级结构，相同结构和功能的蛋白质可通过改变氨基酸序列来构建(Kaiser，E.T.和Kezdy，F.J.Science223249-255)。因此，本发明包括本文中描述的不改变蛋白质二级结构的或如果其结构改变，生物活性基本保持的氨基酸序列的变异体。
根据本发明的基因和毒素不仅包括本文中公开的全长序列，也包括这些序列的片断，或融合蛋白质，上述片断和蛋白质能够保持本文中具体例示的毒素的特征的杀蚜虫活性。
本发明的一个方法涉及给出本文中此后称作通式的一般的化学式，它可用来鉴别具有抗蚜虫活性的毒素。通式描述的毒素蛋白质的分子量从大约45kDa至大约65kDa，它们的一级氨基酸结构实际上是下述基本结构，例示如下
1MLBXXXXOBPKHxxxXXXXOXXXXZXKKxxxXZPXXBXXXXXBLLZKXEWOXBXOYBXOZXZLPBUJXXBKXHBXLXXJLXLPXJBXULYJBYXXJKXXX101XWWUXXLXPLBBKXOUJLXXYZBKXOZJXXKKxxZXXJXBUJJBJULXJUXXJJOXXXKOXKJBXOKCXLLLKEOJUYJXOOJXBXXXLXXBLXZXUxxx201xXJBXZBXXBUXXLXXBXXXLXXXXZJXZPXXJELLJKBJXLKXXLEXXLKOEUJLEKKBBXZBXLZPLLZBBBYELLEXOOBXXLXXXBJXLXXXLJXO301UXJLJKJBKLLZBBUZLXOJLJXBXXUZXXOLXBBXKLXZLWXXLXXULXULKXOZXXEBXJXXJXJXLXLELXJOXXXWXXBOXEOXXBXLUZYXXxxx401 (x)naa其中n＝0-100编号是为方便起见，并且仅为大约位置。
采用的符号A=alaG=glyM=metS=serC=cysH=hisN=asnT=thrD=aspI=ileP=proV=valE=gluK=lysQ=glnW=trpF=pheL=leuR=argY=tyrK＝K或RE＝E或DL＝L或IB＝M，L，I，V，或FJ＝K，R，E，或DO＝A或TU＝N或QZ＝G或SX＝除C外的任何天然存在的氨基酸，＊＝任何天然存在的氨基酸X＝除C外，任何天然存在的氨基酸(或任何氨基酸的完全空缺)。
当遇到天然(wild-card)氨基酸的增加时，(X(n)或x(n)其中n＞2)，应避免给出的氨基酸重复，类似地，P.C.E.D.K或R的使用应减少。
在目前的申请中，用具体的毒素86A1例示本式。
对本领域技术人员来说，可以鉴别并通过几种方法获得编码杀蚜虫剂毒素的基因是显而易见的。具体的基因可从本文中所述的保藏培养物中获得。另外这些基因或它的蛋白质可以由合成构建，例如，采用基因仪(geremachine)，采用通过点突变的常规的方法，可以很容易地构建这些基因的变异体。而且，根据常规方法，采用市售的核酸外切酶或核酸内切酶可以制造这些基因的片断。例如，可用酶(如Bal31)或位点直接诱变，从这些基因的末端系统地切下核苷酸，此外，采用多种其它限制性酶，可获得编码活性片断的基因。可用蛋白酶直接获得这些毒素的活性片断。
采用本文中提供的技术，还可将等效毒素和/或编码这些等效毒素的基因从B.t.分离物和/或DNA文库中找到。有几种获得本发明的天然存在的蚜虫毒素的方法。例如，本文公开的和权利要求中要求的杀蚜虫毒素的抗体可用于从蛋白质混合物中鉴别和分离其它毒素。而且，通过免疫沉淀法和酶联免疫测定(ELISA)，或Western斑点法，这些抗体可用于特异地鉴别具有特征的杀蚜虫活性的等效毒素。本文中公开的毒素或等效毒素或这些毒素的片断的抗体可采用本领域常规的方法很容易地制备。
鉴别本发明毒素和基因的另一种方法是通过使用寡核苷酸探针。这些探针为具有可测标记的核苷酸序列。如本领域中已知的，如果在两种分子之间通过形成强键使探针分子和核苷酸样品杂交(hybridize)，便可以合理地假定探针和样品基本上相同。探针的可测标记提供了用已知方法确定是否发生杂交作用的手段。上述探针分析提供了鉴别本发明杀蚜虫内毒素基因的快速方法。
根据本发明用作探针的核苷酸部分，可采用常规方法用DNA合成器合成。在应用核苷酸片断作探针时，特定的探针是用本领域技术人员已知的任何适当标记物(包括放射活性物和非-放射活性标记物)标记的。典型的放射活性标记物包括32P，125I，35S或其类似物。采用DNA酶和DNA聚合酶。通过常规的缺口翻译反应可从对DNA互补的核苷酸序列样品构建用放射性同位素标记的探针。然后将探针和样品在杂交缓冲液中合并，并保持在适当的温度下直到发生退火，然后，洗涤膜除去外部的产物，留下样品和通常用放射自显影和/或液体闪烁记数检测和记数的键合探针分子。
非放射活性标记物包括配体(例如，上述生物素或甲状腺素)以及酶(如水解酶或过氧化酶)或各种化学发光剂(如萤光素或其衍生物类的荧光化合物)。探针也可在两个末端，用不同类型的标记物分别标记，例如，在所述末端用同位素标记，而在另一末端用生物素标记。
二倍的构型和稳定性依赖于杂交物两者之间的实质上的互补，且，如上所述，可以耐受一定程度的失配。因此本发明探针包括所述序列的突变体(包括单独和复合的)、缺失物、插入物，和它们的组合物，其中所述的突变体、插入物和缺失物形成与兴趣(interest)聚核苷酸靶的稳定杂交。在给出的聚核苷酸序列上以多种方式可生产突变体、插入物、和缺失物，对本领域普通技术人员来说这些方法是已知的。其它方法在以后会逐渐知晓。
已知的方法包括，但不限于(1)合成化学序列或其它的为已知序列的突变体，插入物或缺失物的人工序列;
(2)应用本发明的探针，借助杂交作用获得新序列或探针序列的突变体、插入物或缺失物;
(3)在体外或体内突变、插入或缺失一个供试序列。
注意到从给定探针产生的变异的，插入的和缺失的变体可比起始探针效果好或差是重要的。虽然上述物质在效力上不同，这些变体都在本发明的范围内。
因此，通过本领域技术人员已知的方法可以容易地制备所公开的序列的突变的插入的和缺失的变异体，只要这些变异体具有与探针的基本序列同源性，这些变异体就可以相同方法用作直接探针。在本文中采用的基本序列同源性指足以能使变体具有与起始探针有相同功能的同源性。优选的同源性大于50%;更优选的同源性大于75%，最优选的同源性大于90%。变异体功能的预期能力所需要的同源性程度将依赖于序列的预期应用。本领域技术人员制造设定的改进序列功能或另外提供改进的方法的突变的、插入的和缺失的变体完全在本领域技术人员的能力之内。
根据本发明在快速鉴定杀蚜虫基因中有用的特异核苷酸探针是编码下述氨基酸序列的核苷酸序列“(D，S)DF(N，S)QLY(K，D)VY”(SEQIDNO.3);“(E，K)ELL(E，K)KY”(SEQIDNO.4);“LPGLL-GFVVYEI”(SEQIDNO.5);“DRDVKI(L，I)GM”(SEQIDNO.6)和“(V，I)(L，I)K(T，S)ANDI”(SEQIDNO.7)。由于基因密码冗长，即多于一个的编码核苷酸三联体(密码子)能用于编码用于制造蛋白质的大多数氨基酸，不同的核苷酸序列可编码特定的氨基酸。这样，可通过编码蛋白质或肽的相同的氨基酸序列的等效核苷酸序列制备B.t.毒素和肽的氨基酸序列。因此，本发明包括这样的等效核苷酸序列。逆序列或互补序列也是本发明的一个部分，本领域技术人员可容易地应用它们。
在本文序列表中显示的三个字符的氨基酸码不反映在给定位置的在两个氨基酸之间有选择的上述单一字符的氨基酸序列。因此在序列表中，“xaa”用于指序列内的变异位点，但上述单字符码应指在序列中给定的位置的特定的氨基酸。
本发明的农药制剂可施用于靶标有害生物的环境中，例如，通过喷雾、喷粉、散布施用于植物上、土壤或水中。可采用常规技术的培养基和发酵方法培养本发明的B.t.细胞。在结束发酵循环后，可采用本领域已知的方法首先分离B.t.孢子并从发酵液中分离结晶以收获该细菌。可通过加入有利于操作和施用于特定靶标有害生物的表面活性剂、分散剂、惰性载体和其它成分将收获的B.t.孢子和结晶配制成可湿性粉剂，液体浓缩物，颗粒剂或其它制剂，这些制剂和施用方法是本领域已知的。
将以适当的杀蚜虫制剂形式的杀蚜虫有效量的本文中公开的微生物或毒素施用于靶标有害生物的环境后，可以获得对这些有害生物有效的防治。
根据自然条件和将被防治的害虫的数量，一年施用的次数、温度、湿度、和其它可影响生物杀虫剂的已知因素，杀蚜虫有效量可在大约1至大约12L/ha内变化。确定获得对靶标害虫有效防治的生物杀虫剂的施用量完全在本领域技术人员的技能之内。
δ-内毒素可与其它杀虫蛋白质(包括那些从非苏芸金芽孢杆菌来源获得的)结合以提高对靶标害虫给予完全防治的活性谱。
可以多种方式对B.t.细胞进行配制。通过与多种惰性物质，如无机矿物质(硅酸盐，碳酸盐，硫酸盐，磷酸盐，等等)或植物材料(玉米棒粉，稻壳，胡桃壳，等等)混合做成可湿性粉剂，颗粒剂或粉剂。制剂中可包括喷雾粘着助剂、稳定剂、其它农药助剂或表面活性剂。液体制剂可以是水基质或非水基质，做成泡沫、胶、悬浮液、乳油，等等，可包括流变剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂或聚合物成分。
根据特定制剂的特性，特别是它是否是浓缩物或被直接使用，杀虫剂的浓度变化范围很宽。杀虫剂至少以1%(重量)存在，且可为100%(重量)。干制剂将含有大约1-95%(重量)的杀虫剂，而液体制剂在液相中通常存在大约1-60%(重量)的固体。制剂中一般每mg含有大约102至大约104个细胞，这些制剂将以每公顷大约50mg(液体或干燥物)至1Kg或更多的量给药。
本发明新分离物包含的毒素基因可以引入到很多种类的微生物宿主中。毒素基因的直接或间接地表达导致在细胞内产生和保存杀虫剂。用适合的宿主(例如假单胞菌)可将微生物施用到蚜虫将要繁殖的地点，结果是防治了蚜虫。
可在延长细胞中生成的毒素的活性的条件下处理毒素基因寄生的微生物。只要不对毒素的性质有有害的影响，或不减少细胞保护毒素的能力，就可通过化学或物理方法，或通过化学和/或物理方法的结合处理微生物细胞(例如，含有B.t.毒素基因的细胞)。化学试剂的例子是卤化剂，特别是元素编号为17-80的卤素。特别是，在温和条件下以足够的时间使用碘可获得所需结果。其它的适合的技术包括用醛类(如甲醛和戊二醛)、抗传染剂(如氯化苄基二甲基烷基铵和氯化十六烷基吡啶鎓)、醇类(如异丙醇和乙醇)、多种组织固定剂(如路尔戈碘液，布英固定剂和Helly′s固定液)(见Humason，GretchenL.，AnimalTissueTechniques，W.H.FreemanandCompany，1967)或物理(热)和化学试剂结合处理，这些处理使得当细胞给药于宿主动物时，能够保持和延长在细胞中产生毒素的活性。物理方法的例子为短波辐射(如γ-射线和x-射线)、冷冻、UV照射、冻干等等。然后将处理过的细胞施用到靶标有害生物的环境中。所得产物能够保持B.t.毒素的活性。
在允许基因的稳定保持和表达的条件下，可用多种方法将表达毒素的B.t.基因引入到微生物宿主中，这些方法是本领域技术人员已知的。
下述是说明实施本发明的方法的实施例，包括最佳方式。这些实施例不构成对本发明的限制。除非另外指明，所有百分比以重量计，且所有溶剂混合物的比例以体积计。
实施例1-培养B.t.分离物B.t.分离物，或它们的突变体的继代培养可用下述培养基、胨、葡萄糖、盐培养基接种。
Bacto胨7.5g/l葡萄糖1.0g/lKH2PO43.4g/lK2HPO44.35g/l盐溶液5.0ml/lCaCl2溶液 5.0ml/l
pH7.2盐溶液(100ml)MgSO4·7H2O 2.46gMnSO4·H2O 0.04gZnSO4·7H2O 0.28gFeSO4·7H2O 0.40gCaCl2溶液(100ml)CaCl2·2H2O 3.66g过滤消毒的盐溶液和CaCl2溶液在接种时加入到高压消毒过和煮过的肉汤培养基中。在200rpm旋转振荡器上，在30℃温育烧瓶64小时。通过离心(7.14Kg 20min)收集类芽孢包合的菌体(parasporal inclusion bodies)、孢子和细胞碎片。
通过本领域已知的方法，上述方法可容易地扩大到大的发酵罐中。
从上述发酵获得的B.t.孢子和/或结晶可用本领域已知的方法分离。经常使用的方法是将分离技术(如离心)用于收获的发酵液上。
实施例2-N-末端测序用溴化钠(28-38%)等密度梯度离心(M.A.Pfannenstiel等人FEMSMicrobiol.，Lett.21∶39)部分纯化类芽孢包含的菌体。通过Westerblotting技术(H.Towbin等人Proc.Natl，Acad，Sci.USA76∶4350)将部分纯化的蛋白质结合到Immobilon-P，PVDF膜上(Millipore，Bedford，MA)。通过常规的埃德曼反应用自动配对气相测序仪(M.W.Hunkapiller等人Meth.Enzymol.91∶399)确定N-末端氨基酸序列。获得的序列如下述NH2-MIIDSKTTLPRHSLIHTIKL-CO2H(SEQ ID NO.8).从这个序列设计了下述寡核苷酸探针5′ATGATTGATTCTAAAACAACATTACCAAGACATTCT/ATTAATT/ACATACT/AATT/AAA3′(SEQIDNO.9)此探针指定为86A1-A。
实施例3-来源于苏芸金芽孢杆菌PS86A1菌株的编码新毒素的基因的分子克隆从生长至在600nm下光密度为1.0的PS86A1细胞制备完整的细胞DNA，通过离心使细胞成小球，并再悬浮于原生质体缓冲液(在0.3M蔗糖中的20mg/ml溶菌酶，25mMTris-Cl，pH8.0，25mMEDTA)中。在37℃温育1小时后，通过冷冻和融化两个循环使原生质体溶解。加入9倍体积0.1MNacl、0.1%SDS、0.1MTris-Cl溶液使完全溶解。用苯酚∶氯仿(1∶1)提取澄清溶胞产物两次，用两体积的乙醇沉淀核酸，并离心成小球。该小球再悬浮于100mMTris-Cl，1mMEDTA(TE)，pH8.0的溶液中，加入RNAse至最终浓度为50μg/ml，在37℃培养1小时后，分别用苯酚∶氯仿(1∶1)和TE-饱和的氯仿提取溶液各一次。加入1/10体积的3MNaOAc和两体积的乙醇使DNA从水相中沉淀。通过离心使DNA成小球，用70%乙醇洗涤，干燥，并再悬浮于TE中。
通过常规的PS86A1 DNA与指定为86A1-A的32P-标记寡核苷酸探针的Southern blots杂交法进行限制性片断长度多型性(Restriction fragment Length polymorphism)(RFLP)分析。
如所示的探针在四个位置混合。杂交带包括近似3.6kbpHindⅢ的片断和近似9.3kbpEcoRV的片断。
从用Sau3A部分消化的PS86A1DNA构建基因文库。通过琼脂糖胶电泳分离部分限制性消化物。6.6至23kbp大小的DNA片断从胶中被切断，并被从胶切片上电洗脱，在Elutip-D离子交换柱上纯化后，用乙醇收集沉淀。Sau3A插入物连接到BamHI-消化的LambdaGem-11(Promega，Madison，WI)上。将重组的噬菌体填充和平辅在大肠杆菌E.ColiKW251细胞(Promega)上。用放射性标记的86A1-A寡核苷酸探针通过杂交作用筛选噬斑。杂交噬菌体被噬斑纯化并通过常规方法侵染E.coliKW251细胞液体培养物以分离噬菌体DNA(Maniatis等人MolecularCloning.ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY)。对亚克隆来说用EcoRI和SalI消化制备量的DNA，并在琼脂糖胶上电泳。从胶上切断含有毒素基因的接近2.9kbp的带，从胶片上电洗脱该带，用上述的离子交换色谱纯化。将纯化的DNA插入物连接到EcoRI+SalI-消化的pHTBlueⅡ(一种包含pBlueScriptS/K(Stratagene，SanDiego，(A)的E.coli/B.t.穿梭载体)上，并从存在的B.t.质粒(D.Lereclus等人FEMSMicrobiol，Lett。60∶211-218)开始复制，将结合混合物用于转化冷冻的感受态E.coliNM522细胞(ATCC47000)。转化体接种在含有α-氨苄青霉素，异丙基-(β)-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-(β)-D-半乳糖苷(XGAL)的LB琼脂上(Maniatis等人，supra)。通过碱溶菌作用(Maniatis等人，supra)从推断的重组体纯化质粒，通过在琼脂糖胶上的EcoRI和SalI消化物的电泳分析这些质粒。所期望的质粒构建体(pMYC2320)含有本发明的毒素基因。参见图2。该基因的DNA序列在SEQIDNO.1中示出。被此基因表达的毒素在SEQIDNO.2中示出。
通过electroporation将质粒pMY(2320引入到acrystalliferous(Cry-)B.t.宿主中(B.t.HD-1 cryB，A.I.Aronson，Purdue University，West Lafayette，IN)。通过SDS-PAGE分析证实近似58kDa的蛋白质的表达。
本文中公开的限制性酶可从BoehringerMannheim，Indianapolis，IN或NewEnglandBiolabs，Beverly.MA购买。根据供应商提供的说明使用酶。
采用已知的常规方法可从转化的宿主微生物除去含有B.t.毒素基因的质粒pMY2320。例如，可用纯净胞溶物等分密度梯度等方法处理E.coliNM522(pMYC2320)，以除去pMYC2320。
实施例4采用基因寡核苷酸引物的蚜虫活性基因的进一步克隆从新的杀蚜虫的B.t.分离物中得到的编码杀蚜虫毒素的基因可通过采用下述特异寡核苷酸引物用常规的聚合物链反应的方法，从菌株的DNA获得1.正引物(forwardprimer)“TGATTTT(T或A)(C或A)TCAATTATAT(A或G)A(G或T)GTTTAT”(SEQIDNO.10)可与和探针“AAGAGTTA(C或T)TA(A或G)A(G或A)AAAGTA”(SEQIDNO.11)、探针“TTAGGACCATT(A或G)(C或T)T(T或A)GGATTTGTTGT(A或T)AAAAT(C或T)(T或A)TAGGAATG”(SEQIDNO.13)互补的引物一起使用，以分别产生近似于440、540和650bp的扩增片断。
2.正引物“TT(A或C)TTAAA(A或T)C(A或T)GCTAATGATATT”(SEQIDNO.14)可与和SEQIDNO.11、SEQIDNO.12和SEQIDNO.13互补的引物一起使用以分别产生近似于360、460、和570bp的扩增片断。
3.正引物SEQINNO11可与和SEQIDNO.12和SEQIDNO.13互补的引物一起使用，以分别产生近似于100和215bp的扩增片断。
所说大小的扩增DNA片断可被放射性标记和用作探针以克隆实施例3中的全部基因。
应当注意到上面列出的每一个引物(SEQIDNOS.10-14)也可用作上述编码杀蚜虫毒素的基因的探针。
实施例5-B.t.分离物抗蜿豆蚜(Acyrthosiphonpisum)的活性本发明的苏芸金芽孢杆菌分离物是通过喷施被离心浓缩的发酵液干粉而进行测试的。包括水和生物量(孢子，结晶δ-内毒素，细胞碎片和生长介质)的小球与常规载体，防腐剂和表面活性剂混合。含25%生物量的粉末用Yamato喷粉干燥器(由YamatoScientificCo.Ltd.Tokyo，Japan销售)制造。
用家蝇幼虫生测实验(Campbell，D.P.，Dieball，D.E.和Brackett，J.M.，1987，RapidHPLCassayfortheβ-exotoxinofBacillusthuringiensis，J.Agric.FoodChem.35∶156-158)测试所有发液液中β-内毒素的存在。只有经测试无β-内毒素的分离物才用于抗蚜虫试验。将25mg粉末混合进5ml10%蔗糖溶液中，制备供试喷雾干粉的悬浮液，然后用声波处理混合物8分钟以生成悬浮液。
将2ml悬浮液置于含有带有parafilm M薄片底的金属环的贮存槽中，将含有大约30只雌蜿豆蚜(Acyrthosiphon pisum)的平皿放在薄片的下边，将蚜虫在糖溶液中饲养24hrs，然后转移到蜿豆苗上。4天后测定死亡率(表3)。每个测定重复三次。表3表示在5000ppm时苏芸金芽孢杆菌分离物对蜿豆蚜(Acyrthosiphonpisum)的毒性。
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实施例6-毒素基因插入到植物中本发明的一个方面是用编码杀蚜虫毒素基因转化植物，经转化的植物能抗线虫的攻击。
采用本领域已知的多种方法，可将本文中公开的编码杀蚜虫毒素基因插入到植物细胞中。例如包含在大肠杆菌中的复制系统的大量克隆载体和可选择转化细胞的标记物可用于将外来基插入到高等植物中。这些载体包括，例如，pBR322，pUC系列，M13mp系列，pACYC184，等。因此，编码B.t.毒素的序列可在适合的限制位点插入到载体中。所得质粒用于转化到大肠杆菌中。将大肠杆菌细胞在适合的营养培养基上培养，此后收获并溶菌。回收质粒。序列分析、限制性分析、电泳、和其它生化一分子生物学方法是一般采用的分析方法。每一操作后，使用的DNA序列可被分开并连接到下一个DNA序列上，可以在相同或其它的质粒中。克隆每个质粒序列。根据将所需要的基因插入到植物中的方法，其它DNA序列可以是必需的。如果，例如，Ti或Ri质粒用于转化植物细胞则至少在Ti或Ri质粒T-DNA的右边缘(border)但常常在右和左边缘就不得不作为被插入基因的侧面部位被连接。
应用T-DNA转化植物细胞已经充分研究过并在EP120516中，Hoekema(1985)在TheBinaryPlantVectorSystem，OffsetdurkkerijkantersB.V.，Alblasserdam，Chapter5;Fraley等人，Crit.Rev.PlantSci.4∶1-46;和An等人(1985)EMBOJ4∶277-287。中有详细描述。
一旦插入的DNA整合到染色体组中，它在那里就相对稳定，而且，作为一条规律，它不再出来。它通常含有转化植物细胞对杀虫剂或抗生素，如卡那霉素，G418，博莱霉素，潮霉素，或尤其对氯霉素有抗性的选择性标记。单个使用的标记相应地可以选择转移细胞而不是不含有插入DNA的细胞。
可以采用大量技术将DNA插入到植物宿主细胞中。这些技术包括采用根癌病土壤杆菌或发根病土壤杆菌作为转化剂的用T-DNA的转化、融合、注入、或electroporation以及其它可能的方法。如果土壤杆菌用作转化，将被插入的DNA就得克隆到的特定质粒上，即或是进入中间载体或是进入二元载体(binaryvector)。由于其序列与T-DNA中的序列同源，通过同源重组，中间载体可整合进入Ti或Ri质粒中，Ti或Ri质粒也含有T-DNA转移必须的vir区域。在土壤杆菌中中间载体不能复制其自身。采用辅助质粒(连接)的手段，中间载体可转移到根癌病土壤杆菌中。在大肠杆菌和土壤杆菌中，二元载体可复制其自身。它们包含选择标记基因和连接物或聚连接物，它们被T-DNA右和左边缘形成框架，它们可被直接转化到土壤杆菌中(Holsters等人mol.Gen.Genet.163181-187)。用作宿主细胞的土壤杆菌将包含带有vir区域的质粒。转移T-DNA到植物细胞中时，vir区域是必需的。可包括其它T-DNA。如此转化的细菌用于植物细胞的转化，植物外植体可很好地与根癌病土壤杆菌或发根病土壤杆菌-起培养，以将DNA转移进入植物细胞中。整个植物可在可以含有用于选择的抗生素或杀生物剂的适合的培养基中从浸染的植物体(例如，叶片、茎节、根、还有原生质体和悬浮培养的细胞)再生。然后可测试如此获得的植物中插入的DNA的存在。在注入或electroporation的情况下，没有对质粒的特别的要求。使用一般的质粒，如，例如，pUC衍生物也是可能的。
转化细胞以一般方式在植物内生长，它们可形成芽胞细胞，并把转化的特征带入后代植物。这些植物可以正常方式生长，并可与具有相同的可遗传转化因子或其它遗传因子的植物杂交，所得杂交个体具有相应的表型性质。
实施例7-新的苏芸金芽孢杆菌基因克隆到昆虫病毒中已知大量病毒侵染昆虫。这些病毒包括，例如，杆状病毒和昆虫痘病毒。在本发明中的一个实施方案中，如本文中所述的art-活性基因，可与昆虫病毒染色体组在一起，由此提高病毒的致病性，构建含有B.t.毒素基因的昆虫病毒的方法是已知的且本领域技术人员容易实施，这些方法在，例如Merryweather等人，(Merryweather，A.T.，U.Weyer，M.P.G.Harris，M.Hirst，T.Booth，R.D.PosseeJ.Gen.Virol.711535-1544)和Martens等人(Martens，J.W.M.，G.Honee，D.Zuidema，J.W.M.vanLent，B.Visser，J.M.VlakAppl.EnvironmentalMicrobiol.56(9)2764-2770)中描述。
应该清楚的是本文中的实施例和实施方案仅用于说明的目的，且由此提示的本领域技术人员对它的多种很小的修改或变化将包含在本申请的精神和范围以及附加的权利要求的范围内。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人Payne，JewelM.
Carnon，RaymondJ.C.
Schnepf，H.ErnestSchwab，GeorgeE.
(ⅱ)发明名称苏芸金芽孢杆菌分离物和这一来源的毒素在防治蚜科害虫上的应用(ⅲ)序列号14(ⅳ)通讯地址(A)通讯人DavidR.Saliwanchik(B)街2421N.W.第41街，A-1套(C)城市Cainesville(D)州Florida(E)国家USA(F)ZIP32606(ⅴ)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBMPC相容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentInRelease＃1.0，Version＃1.25
(ⅵ)目前申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类号(ⅷ)代理人/机构资料(A)姓名Saliwanchik，DavidR.
(B)登记号31.794(C)参考/摘要号M/S205.
(ⅸ)电讯资料(A)电活(904)375-8100(B)电传(904)372-5800(2)SEQIDNO1资料(ⅰ)序列特征(A)长度1425个碱基对(B)类型核苷酸(C)股(STRANDEDNESS)双(d)拓扑结构(TOPOLOGY)线性(ⅱ)分子类型DNA(染色体组的)(ⅲ)假设(HYPOTHETICAL)无(ⅳ)反义链无(ⅵ)来源(A)生物苏芸金芽孢杆菌(C)单独分离物PS86A1(ⅶ)中间体来源
(A)大肠杆菌NM522[pMYC2320](ⅸ)特征(A)名称/关键词mat肽(B)位置1…1425(ⅹⅰ)序列说明SEQIDNO1
(2)SEQIDNO2资料(ⅰ)序列特征(A)长度475个氨基酸(B)类型氨基酸
(C)股单(d)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅲ)假设有(ⅳ)反义链无(ⅵ)来源(A)生物体苏芸金芽孢杆菌(B)单独分离物，PS86A1(ⅸ)特征(A)名称/关键词蛋白质(B)位置1..475(ⅹⅰ)序列说明SEQIDNO2
(2)SEQIDNO3资料(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸(C)胶单(d)拓扑结构线性
(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列说明SEQIDNO3XaaAspPheXaaGlnLeuTyrXaaValTyr1510(2)SEQIDNO4资料(ⅰ)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)胶单(d)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列说明SEQIDNO4XaaGluLeuLeuXaaLysVal15(2)SEQIDNO5资料(ⅰ)序列特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(C)胶单(d)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列说明SEQIDNO5LeuGlyProLeuLeuGlyPheValValTyrGluIle1510
(2)SEQIDNO6资料(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)胶单(d)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列说明SEQIDNO6AspArgAspValLysIleXaaGlyMet15(2)SEQIDNO7资料(ⅰ)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)胶单(d)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列说明SEQIDNO7XaaXaaLysXaaAlaAsnAspIle15(2)SEQIDNO8资料(ⅰ)序列特征(A)长度20个氨基酸(B)类型氨基酸
(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅵ)来源(A)生物体苏芸金芽孢杆菌(B)菌株PS86A1(ⅹⅰ)序列说明SEQIDNO8MetIleIleAspSerLysThrThrLeuPro1510ArgHisSerLeuIleHisThrIleLysLeu1520(2)SEQIDNO9资料(ⅰ)序列特征(A)长度53个碱基(B)类型氨基酸(C)胶单(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(染色体组的)(ⅵ)来源(A)生物体苏芸金芽孢杆菌(B)菌株PS86A1(ⅹⅰ)序列说明SEQIDNO9ATGATTGATTCTAAAACAACATTACCAAGACATTCWTTAATWCATACWATWAA53(2)SEQIDNO10资料
(ⅰ)序列特征(A)长度28个碱基(B)类型氨基酸(C)胶单(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(合成的)(ⅹⅰ)序列说明SEQIDNO10TGATTTTWMTCAATTATATRAKGTTTAT(2)SEQIDNO11资料(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基(B)类型氨基酸(C)胶单(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(合成的)(ⅹⅰ)序列说明SEQIDNO11AAGAGTTAYTARARAAAGTA(2)SEQIDNO12资料(ⅰ)序列特征(A)长度35个碱基(B)类型氨基酸(C)胶单(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(合成的)
(ⅹⅰ)序列说明SEQIDNO12TTAGGACCATTRYTWGGATTTGTTGTWTATGAAAT(2)SEQIDNO13资料(ⅰ)序列特征(A)长度27个碱基(B)类型氨基酸(C)胶单(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(合成的)(ⅹⅰ)序列说明SEQIDNO13GAYAGAGATGTWAAAATYWTAGGAATG(2)SEQIDNO14资料(ⅰ)序列特征(A)长度23个碱基(B)类型氨基酸(C)胶单(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(合成的)(ⅹⅰ)序列说明SEQIDNO14TTMTTAAAWCWGCTAATGATATT
权利要求
1.一种防治蚜科害虫的方法，包括使所述害虫与蚜虫防治有效量的选自B.t.PS157C1、B.t.PS86a1、B.t.PS75J1的苏芸金芽孢杆菌的分离物、以及它们的变异体、或所述分离物的毒素结晶或孢子接触。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的微生物是苏芸金芽孢杆菌PS157C1。
3.根据权利要求1的方法，其中所述的微生物是苏芸金芽孢杆菌PS86A1。
4.根据权利要求1的方法，其中所述的微生物是苏芸金芽孢杆菌PS75J1。
5.根据权利要求1的方法，其中所述的害虫是蜿豆蚜(Acyrthosiphonpisum)。
6.一种编码有抗蚜虫活性的毒素的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列是从选自B.t.PS157C1、B.t.PS86A1、B.t.PS75J1的苏芸金芽孢杆菌的分离物，和它们的变异体获得的。
7.一种编码对蚜虫有毒性但不防治线虫的毒素蛋白质的核苷酸序列，其中所述的毒素至少具有以下一种特征(a)所述毒素的氨基酸序列符合通式;(b)所述毒素的氨基酸序列与蛋白质86A1的氨基酸序列至少50%同源;(c)编码所述毒素的DNA与编码全部或部分蛋白质86A1的DNA杂交;(d)编码所述毒素的DNA与选自SEQIDNOS，10-14和编码SEQIDNOS.3-7的DNA的探针杂交;(e)编码所述毒素的一部分核苷酸序列，可用与(ⅰ)正引物SEQIDNO.10或SEQIDNO.14和与SEQIDNO.11，SEQIDNO.12或SEQIDNO.13互补的反引物(reverseprimer);(ⅱ)正引物SEQIDNO.11和与SEQIDNO.12或SEQIDNO.13互补的反引物的聚合酶链反应，从苏芸金芽孢杆菌菌株扩增;(f)所述毒素与抗体是免疫反应性的。所说抗体同选自毒素157C1，75J1和86A1的蛋白质发生免疫反应。
8.根据权利要求7的核苷酸序列，其中所述毒素符合所说通式。
9.根据权利要求7的核苷酸序列，其中编码所述毒素的DNA与编码全部或部分蛋白质86A1的DNA杂交。
10.根据权利要求7的核苷酸序列，其中编码所述毒素的DNA与选自SEQIDNOS.10-14和编码SEQIDNOS.3-7的DNA的探针杂交。
11.根据权利要求7的核苷酸序列，其中编码所述毒素的一部分核苷酸序列，可用与(ⅰ)正引物SEQIDNO.10或SEQIDNO.14和与SEQIDNO.11，SEQIDNO.12或SEQIDNO.13互补的反引物;或(ⅱ)正引物SEQIDNO.11和与SEQIDNO.12或SEQIDNO.13互补的反引物的聚合酶链反应，从苏芸金芽孢杆菌菌株扩增;
12.根据权利要求11的核苷酸序列，其中所述的正引物是SEQIDNO.10并且(a)所述的反引物是与SEQID.NO.11互补的，并产生大约440bp的聚合酶链反应片断;(b)所述的反引物是与SEQIDNO.12互补的，并产生大约540bp的聚合酶链反应片断;(c)所述的反引物是与SEQIDNO.13互补的，并产生大约650bp的聚合酶链反应片断。
13.根据权利要求11的核苷酸序列，其中所述的正引物是SEQIDNO.14，当该引物与和SEQIDNOS.11、12或13互补的反引物一起使用时，分别产生大约360，460，和570bp的聚合酶链反应片断。
14.根据权利要求11的核苷酸序列，其中所述的正引物是SEQIDNO.11，当该引物与和SEQIDNOS.12或13互补的反引物一起使用时，分别产生大约100和215bp的聚合酶链反应片断。
15.根据权利要求7的核苷酸序列，其中所述毒素与抗体是免疫反应性的，所说抗体同选自毒素157C1、75J1和86A1的蛋白质发生免疫反应。
16.一种由从苏芸金芽孢杆菌分离物和它的变异体获得的核苷酸序列编码的毒素，其中所说的苏芸金芽孢杆菌分离物选自B.t.PS157C1、B.t.PS86A1、B.t.PS75J1，其中所述毒素是抗蚜虫活性的。
17.对蚜虫有毒性但不防治线虫的基本上纯的毒素蛋白质，且它至少具有以下特征之一(a)所述毒素的氨基酸序列符合通式(b)所述毒素的氨基酸序列与蛋白质86A1的氨基酸序列至少50%同源;(c)编码所述毒素的DNA与编码全部或部分蛋白质86A1的DNA杂交;(d)编码所述毒素的DNA与选自SEQINNOS10-14和编码SEQIDNOS.3-7的DNA的探针杂交;(e)编码所述毒素的一部分核苷酸序列，可用与(ⅰ)正引物SEQIDNO.10或SEQIDNO.14和与SEQIDNO.11、SEQIDNO.12或SEQIDNO.13互补反引物;(ⅱ)正引物SEQIDNO.11和与SEQIDNO.12或SEQIDNO.13互补的反引物的聚合醚链反应，从苏芸金芽孢杆菌菌株扩增;(f)所述毒素与抗体是免疫反应性的，所说抗体同选自毒素157C1，75J1和86A1的蛋白质发生免疫反应。
18.根据权利要求17的毒素，其中所述毒素符合所说通式。
19.根据权利要求17的毒素，其中编码所述毒素的DNA与编码全部或部分蛋白质86A1的DNA杂交。
20.根据权利要求17的毒素，其中编码所述毒素的DNA与选自SEQIDNO.10-14和编码SEQIDNOS.3-7的DNA的探针杂交。
21.根据权利要求17的毒素，其中编码所述毒素的一部分核苷酸序列可用与(ⅰ)正引物SEQIDNO.10或SEQIDNO.14和与SEQIDNO.11、SEQIDNO.12或SEQIDNO.13互补反引物ⅱ)正引物SEQIDNO.11和与SEQIDNO.12或与SEQIDNO.13互补的反引物的聚合醚链反应，从苏芸金芽孢杆菌菌株扩增;
22.根据权利要求21的毒素，其中所述的正引物是SEQIDNO.10并且(a)所述反引物是与SEQIDNO.11互补的，且产生大约440bp的聚合酶链反应片断;(b)所述的反引物是与SEQIDNO.12互补的，且产生大约540bp的聚合酶链反应片断;(c)所述的反引物是与SEQIDNO.13互补的，且产生大约650bp的聚合酶链反应片断。
23.根据权利要求21的毒素，其中所述的正引物是SEQIDNO.14，当该引物与和SEQIDNOS11、12或13互补的反引物一起使用时，分别产生大约360，460，和570bp的聚合酶链反应片断。
24.根据权利要求21的毒素，其中所述的正引物是SEQIDNO.11当该引物与和SEQIDNOS.12或13互补的反引物一起使用时，分别产生大约100和215bp的聚合酶链反应片断。
25.根据权利要求17的毒素，其中所述毒素与抗体是免疫反应性的，该抗体与选自毒素157C1，75J1和86A1的蛋白质发生免疫反应。
26.一种防治蚜科害虫的方法，其中包括使含有基本纯化的毒素蛋白质的组合物与所述害虫接触，所述毒素蛋白质是对蚜虫有毒性的，该毒素至少具有以下特征之一(a)所述毒素的氨基酸序列符合通式;(b)所述毒素的氨基酸序列与蛋白质86A1的氨基酸序列至少50%同源;(c)编码所述毒素的DNA与编码全部或部分蛋白质86A1的DNA杂交;(d)编码所述毒素的DNA与选自SEQIDNOS.10-14和编码SEQIDNOS.3-7的DNA的探针杂交;(e)编码所述毒素的一部分核苷酸序列可采用与(ⅰ)正引物SEQIDNO.10或SEQIDNO.14和与SEQIDNO11SEQIDNO.12或SEQIDNO.13互补的反引物;(ⅱ)正引物SEQIDNO.11和与SEQIDNO.12或SEQIDNO.13互补的反引物的聚合醚链反应，从苏芸金芽孢杆菌菌株扩增;(f)所述毒素与抗体是免疫反应性的，所说抗体同选自毒素157C1，75J1和86A1的蛋白质发生免疫反应。
27.根据权利要求26的方法，其中所述毒素符合通式。
28.根据权利要求26的方法，其中编码所述毒素的DNA与编码全部或部分蛋白质86A1的DNA杂交。
29.根据权利要求26的方法，其中编码所述毒素的DNA与选自SEQIDNOS.10-14和编码SEQIDNOS.3-7的DNA的探针杂交。
30.根据权利要求26的方法，其中编码所述毒素的一部分核苷酸序列，可用与(a)正引物SEQIDNO.10或SEQIDNO.14和与SEQIDNO.11，SEQIDNO.12或SEQIDNO.13互补的反引物;或(b)正引物SEQIDNO.11和与SEQIDNO.12或SEQIDNO.13互补的反引物的聚合酶链反应从苏芸金芽孢杆菌扩增。
31.根据权利要求30的方法，其中所述的正引物是SEQIDNO.10并且(a)所述的反引物是与SEQIDNO.11互补的，并产生大约440bp的聚合酶反应片断;(b)所述的反引物是与SEQIDNO.12互补的，并产生大约540bp的聚合酶链反应片断;(c)所述的反引物是与SEQIDNO.13互补的，并产生大约650bp的聚合酶链反应片断。
32.根据权利要求30的方法，其中所述的正引物是SEQIDNO.14，当该引物与和SEQIDNO.11、12或13互补的反引物一起使用时分别产生大约360，460，和570bp的聚合酶链反应片断。
33.根据权利要求30的方法，其中所述的正引物是SEQIDNO.11，当该引物与和SEQIDnO.12或13互补的反引物一起使用时分别产生大约100和215bp的聚合酶链反应片断。
34.根据权利要求26的方法，其中的所述的毒素是与抗体免疫反应性的，该抗体与选自毒素157C1、75J1和86A1的蛋白质发生免疫反应。
35.一种用从苏芸金芽孢杆菌分离物和它们的变异体获得的核苷酸序列转化的选自植物、微生物、杆状病毒和昆虫痘病毒的宿主，所说的苏芸金芽孢杆菌分离物选自B.t.PS157C1、B.t.PS86A1、B.t.PS75J1，其中所述核苷酸序列编码的蛋白质对蚜虫有毒性，但不防治线虫。
36.一种用编码对蚜虫有毒性，但不防治线虫的毒素蛋白质的核苷酸序列转化的选自植物、微生物、杆状病毒和昆虫痘病毒的宿主，其中所述的毒素具有至少一种以下特征(a)所述毒素的氨基酸序列符合通式;(b)所述毒素的氨基酸序列与蛋白质86A1的氨基酸序列至少50%同源;(c)编码所述毒素的DNA与编码全部或部分蛋白质86A1的DNA杂交;(d)编码所述毒素的DNA与选自SEQIDNOS.10-14和编码SEQIDNOS.3-7的DNA的探针杂交;(e)编码所述毒素的一部分核苷酸序列，可采用与(ⅰ)正引物SEQIDNO.10或SEQIDNO.14和与SEQIDNO.11、SEQIDNO.12或SEQDNO.13互补的反引物;(ⅱ)正引物SEQIDNO.11和与SEQIDNO.12或SEQIDNO>13互补的反引物的聚合酶链反应，从苏芸金芽孢杆菌扩增;(f)所述毒素与抗体是免疫反应性的，所说抗体同选自毒素157C1、75J1和86A1的蛋白质发生免疫反应。
全文摘要
本发明涉及有抗蚜虫活性的指定为B.t.PS157C1、B.t.PS86A1和B.t.PS75J1的苏芸金芽胞杆菌分离物。因此，这些分离物或它们的变异体可用于防治上述害虫。另外，编码新加δ-内毒素的基因可从这些分离物中除去并转移至其它宿主微生物或植物中。微生物宿主中的δ-内毒素的表达导致对昆虫的防治，其中经转化的植物变得对蚜虫有抗性。
文档编号C07K16/00GK1085387SQ9311831
公开日1994年4月20日 申请日期1993年8月24日 优先权日1992年8月24日
发明者J·M·佩恩, R·J·C·肯农, H·E·施内普夫, G·E·施瓦布 申请人:迈可根公司