专利名称：筛选抗骨质疏松症药物的材料和方法
技术领域：
本发明涉及用于鉴别治疗骨质疏松症的治疗药物的方法。本发明涉及分离、克隆并应用核苷酸，所述核酸含有命名为“雷洛昔芬(raloxifene)反应性元件”的新调节元件的哺乳动物转化生长因子β基因的启动子区域。本发明也包括用遗传工程方法加工的含重组表达构建体的真核细胞，其中，将雷洛昔芬反应性元件与报道基因可操作地相连。在所述细胞中，雷洛昔芬反应性元件能够应答用特定化合物进行的治疗而调节报道基因的转录。本发明也涉及鉴别抗骨质疏松症药物的方法，所述药物经雷洛昔芬反应性元件诱导特定基因的转录，但不会特异性诱导与雌激素替代疗法相关的有害或令人讨厌的副作用，如增加患子宫和乳腺癌的危险。本发明的核酸、细胞和方法提供筛选推测的抗骨质疏松药物的来源并将其加以鉴定的有效方法。所述药物的优点在于没有与目前抗-骨质疏松药物相关的令人讨厌的副作用。本发明也诱导骨形成的方法，治疗骨质疏松的方法，治疗骨折的方法，包括施用与雌激素受体结合的、有效诱导雷洛昔芬反应性元件转录的化合物。
在1991年，美国的药物公司花费了约7.9亿美元用于研制鉴定新的治疗药物(药物制造商协会)。该数量之巨大部分是由于必须对成百(如果不是上千)种化合物进行试验，以便鉴定一种不会产生不可接受水平的不令人满意或有害的副作用的有效治疗药物。迫切要求经济地试验大量化合物的方法，以便快速鉴别在治疗疾病中可能有效的那些化合物。目前，还没有这种经济的系统存在。
明显缺乏一种迅速的方法来筛选大量潜在治疗药物的一种疾病是骨损失。骨损失发生于各种各样的患者中，包括经受子宫切除术患者、正在或已经长期施用皮质类固醇者、Cushing氏综合症或性腺发育不全的患者以及绝经后的妇女。
骨损失的机制还不是很清楚，但从实际结果看，这种疾病起因于新的健康骨的形成与旧骨吸收之间的不平衡，造成骨组织的净损失。这种骨损失包括骨矿物质与蛋白质基质成分的减少，并导致明显增加股骨和前臂及脊椎骨的骨折率。这些骨折又导致普遍增加的发病率，身高和活动性的明显丧失，且在许多情况下，增加了并发症引起的死亡率。
未曾遏止的骨损失可以导致骨质疏松症这种消耗性疾病，其主要特征是骨质量减少而骨体积没有减小(减小了密度而扩大了骨空间)，产生多孔性和易折性。在绝经后的妇女中，骨质疏松是一种最普遍的骨疾病，仅在美国就影响约20到25百万妇女。
绝经后骨质疏松的主要特征是由于卵巢停止生产雌激素，而造成骨质量的大量迅速地损失。的确，资料清楚地表明，雌激素具有限制骨质、疏松骨损失发展的能力，并且，在美国和许多其它国家，雌激素替代是绝经后骨质疏松公认的治疗方法。
以低水平施用雌激素时，对骨有好的影响，但长期的雌激素替代疗法已引起各种疾病，包括增加子宫和乳腺癌的危险。这些严重的副作用使得许多妇女拒绝这种治疗方法。其它可减少癌症危险的治疗方法，如孕激素与雌激素的结合施用，使得某些患者有规律地撤退性失血，对于大多数老年妇女是不能接受的。担心这些与雌激素替代疗法有关的明显令人不满的副作用。以及雌激素逆转存在的骨损失的能力有限，提供了一种强动力，促使研制其它可有效治疗骨损失但不引起令人讨厌的副作用的治疗方法。
在骨质疏松治疗中，另一种方法是使用抗雌激素。通常，抗雌激素抑制(拮抗)体内的雌激素活性。抗雌激素与雌激素受体结合，尽管认为抗雌激素与雌激素受体之间的相互作用涉及雌激素结合的受体的不同区域。一些抗雌激素一方面表面为激动剂与拮抗剂特性的药物学特性。另一方面，这些化合物产生某些类似雌激素的效果，同时在表达受体的细胞中，拮抗通常与施用雌激素相同的其它作用。由于某些抗雌激素的这种混合作用，它们发生与雌激素替代疗法相关的相等反作用。
已知表现出上述混合的激动剂/拮抗剂作用的一种抗雌激素是三苯氧胺，一种用于乳腺癌治疗的药物。在降低乳腺肿瘤生长的能力方面，三苯氧胺作为一种雌激素拮抗剂而起作用，在降低健康和患乳腺癌妇女血清胆固醇含量的能力方面，它又作为一种激动剂而起作用(Love等人，Annals Int. Med.，115，860-864(1991))。三苯氧胺也可以增加乳腺癌患者的骨密度(Love等人，N.Eng.J.Med.，326，852-856(1991))。至少有一项研究表明，用三苯氧胺引起的可能的骨密度增加限于腰椎，而在用三苯氧胺治疗的某些乳腺癌患者范围内，报道的是骨损失。此外，已经表明三苯氧胺治疗会增加绝经后妇女的体重(Love等人，Ann.Int.Med.，同上)。
明显地需要改进的抗骨质疏松剂，它可以增加骨密度而不会引起副作用。不幸地是，目前还没有迅速且有效地筛选大量化合物的方法，以鉴定表现所需的抗骨质疏松作用的化合物。由于这种筛选方法在鉴定改进的抗骨质疏松化合物中要消耗大量的时间和钱财，所以非常需要研制一种快速试验大量化合物的方法，以鉴定可能具有抗骨质疏松作用的化合物。
已经肯定，雌激素通过与雌激素受体结合而发挥作用，然后，雌激素/雌激素受体复合物与DNA结合。该激素/受体复合物经这种DNA结合来调节基因表达(Kumar，Cell 55，145-156(1988))。抗雌激素也与雌激素受体结合。尽管这些抗雌激素/受体复合物也与DNA结合，但通常它们不能调节基因表达。雌二醇/雌激素受体复合物和羟三苯氧胺/雌激素受体复合物均在体内与称作雌激素反应性元件的DNA结合区结合(Kumar，Cell出处同上)。
配体/受体复合物的构型是某些争论的问题。然而，最近的研究表明，在与雌二醇结合的雌激素和与4-羟三苯氧胺或ICI 164，384结合的相同雌激素受体间存在构型差异(Klinge等人，J.Ster.Biochem.Mol.Biol.43，249-262(1992))。
在努力合理地找出发展改进的抗骨质疏松药物的问题过程中，研究人员已研究了在骨维持中起作用的已知蛋白质。已知影响骨重建和骨代谢的一种蛋白质是转化生长因子β(TGFβ)。尽管普遍认为是一个单个化合物，但实际上，现在已经知道TGFβ是一个分子家族，包括至少三种异构体TGFβ-1、TGFβ-2和TGFβ-3。(参见Arrick等人，Canc.Res.50，299-303(1990))。本发明人注意到，卵巢切除会引起大鼠骨中TGFβ-3的显著减少(本发明人收集的资料未公开);其他人也注意到关于TGFβ(不特别说明异构体)水平的相同的关系。(参见Finkelman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，12190-12193(1992))。另外，本发明还发现给卵巢切除的大鼠施用雷洛昔芬(一种抗雌激素)，这种大鼠会贮存TGFβ-3浓度，达到等于或高于对照动物中所发现的水平。TGFβ-3水平与雌激素或抗雌激素循环水平之间的直接关系，以及TGFβ(不特别说明异构体)在骨重建和代谢中起显著作用的发现，说明骨质疏松可能是由于体内TGFβ-3的表达降低而引起的。(参见Noda等人，Endocrin.12，2991-2994(1989))。
TGFβ从大量来源中分离出来表现出各种不同作用的发现削弱了TGFβ-3水平的降低会引起骨损失的假设。例如，它抑制间质细胞和上皮细胞的生长，它诱导蛋白多糖、纤维蛋白连接素、纤溶酶原激活剂的生物合成，并且对于成纤维细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞具化学趋向性。(参见Flaumenhaft等人，J.Cell.Bio.120(4)，995-1002(1993))。
此外，抗雌激素如三苯氧胺，或托瑞米芬(toremifene)诱导人胎儿成纤维细胞在没有雌激素受体的情况下分泌TGFβ(没有涉及异构体)。(Colletta等人，Br.J.Cancer.62，405-409(1990))。已经发现TGFβ刺激成骨细胞的骨形成并抑制破骨细胞的形成和破骨细胞的活性。(Mundy，“Clinical Application of TGFβ”，Ciba Fourdation Symposium No.157，137-151，Wiley，Chichester)。TGFβ抑制一种人子宫内膜癌细胞系(Ishikawa)的分裂，但对于另一种上述细胞系(HEC-50)则是促分裂的。Murphy等人，J.Ster.Biochem，Molec.Bio.，41，309-314(1992))。
在乳腺癌活组织检查中，用三苯氧胺进行的3个月的抗雌激素治疗与细胞外TGFβ-1的诱导有关。(Butta等人，Cancer Res.，52，4261-4264(1992))。当将一种人子宫内膜癌细胞系(HEC-50)暴露于雌二醇或某种抗雌激素时，在含1% ctFBS(木炭两次解吸过的FBS)的培养基中生长的所述细胞中发现TGFβ-1mRNA的浓度有所降低。(Gong等人，Canc.Res.52，1704-1709(1992))。
用T-47D和MDA-MB-231细胞系表达TGFβ-2。用雌二醇处理这些细胞系降低了TGFβ-2mRNA的表达，但三苯氧胺没有表现出相同的作用。TGFβ-3在富集骨细胞培养物的成骨细胞中以比TGFβ-1高3到5倍的速率诱导有丝分裂、胶原合成、碱性磷酸酶活性(Arrick等人，Canc.Res.50，299-303(1990))。
在Sporn等人的J.Cell Bio.，105，1039-1045(1987);Massague，Cell，49，437-438(1987)，和Moses，Cell，63，245-247(1990)中综述了TGFβ的一般特性。这些文献一般性地描述了TGFβ在体外和体内系统中表现的特性。
上述的表达复合模型表明各种TGFβ异构体的表达调节是一个独特复杂的机制。已经克隆并描述了基因TGFβ-1，TGFβ-2和TGFβ-3各自的启动子区(Kin等人，J.Biol.Chem.，264，402-408(1989);Noma等人，Growth Factor，4，247-255(1991);Lafyatis等人，J.Biol.Chem.265，19128-12136(1990))。
已经描述了TGFβ-2和TGFβ-3启动子的特征，并报道它们含cAMP反应性元件、AP-1位点、AP-2位点和SP-1位点。Noma等人指明TGFβ-2启动子活性取决于所研究的启动子区域和诱导测定所选的细胞系。
在国际专利申请No.PCT/US92/00419中描述了至少一种用于筛选大量化合物的生物学活性的方法，该申请在权利要求中要求了转录调节生长因子表达的方法。该专利公开了鉴定化合物的检测方法，所述化合物能够通过人生长激素基因的启动子区、c-ErbB2基因、K-ras序列的启动子和巨细胞病毒的早期启动子和增强子诱导转录。该申请主要是针对确定各种癌基因的调控的问题。
到目前为止，鉴定可能表现抗骨质疏松作用的化合物实际上要求在流行病学研究的基础上随机研究各个化合物，在达到所需效果和其它时间消耗及无效方法方面，利用有关的化合物。由目前筛选方法和所述无效试验的经济花费引起的推延迫切需要经济有效的方法，来鉴别值得进一步研究的潜在的抗骨质疏松药物。
图1描述了TGFβ-1基因的启动子区。
图2描述了TGFβ-2基因的启动子区。
图3描述了TGFβ-3基因的启动子区。
图4描述在存在对照化合物、雌激素、雷洛昔芬、三苯氧胺的情况下，在表达构建体转染的细胞中报道基因的相对表达水平，所述构建体含有与CAT基因可操作连接的TGFβ-1启动子，与CAT基因可操作连接的TGFβ-2启动子，或与CAT基因可操作连接的TGFβ-3启动子。通常，含TGFβ-3构建体的细胞表达最高水平的报道基因，接着是含TGFβ-2构建体和TGFβ-1构建体的细胞。
图5描述存在雌激素，雷洛昔芬和雌激素与雷洛昔芬结合物的情况下，在雌激素反应性元件或部分TGFβ-3启动子的控制下报道基因的诱导。该图说明两种调节序列所表现出的明显不同的调节方式。
图6是一个柱形图，说明存在及缺乏雌激素受体的情况下，在用含部分TGFβ-3启动子序列的表达构建体转染并暴露于对照化合物、雌激素、雷洛昔芬、和雌激素与雷洛昔芬结合物的细胞中，报道基因表达的相对水平。雌激素受体对于由雌激素和抗雌激素诱导报道基因的表达是必需的。
图7描述由实施例Ⅺ中列出的缺失构建体表达的雌激素受体(ER)的各个区域。另外，表示出在用各种ER突变体和含TGFβ-3启动子和荧光素酶基因的表达构建体转染的细胞中，可达到的相对倍数诱导作用。
图8描述存在各种浓度雌二醇、雷洛昔芬、三苯氧胺和ICI 164，384的情况下，在用含有TGFβ-3启动子和CAT基因转染的细胞中，可达到的报道基因的表达水平。概括地说，雷洛昔芬在全部各种浓度下均是最强的诱导剂，接着是ICI 164，384、三苯氧胺，在该系统中，雌激素是最弱的诱导剂。
图9描述存在各种浓度雌二醇和雷洛昔芬的情况下，在用含有部分TGFβ-3启动子和荧光素酶基因的表达构建体转染的CHO细胞中，报道基因的有关表达。概括地说，雷洛昔芬除在低浓度外，都是较强的诱导剂。
图10描述存在各种深度雌二醇和雷洛昔芬的情况下，在用含有TGFβ-3启动子和荧光素酶基因的表达构建体转染的MCF-7细胞中，报道基因的有关表达。在所有浓度下，雷洛昔芬都是较强的诱导剂。
图11代表实施例Ⅹ中估计的化合物的化学结构。
图12表示在用TGFβ-3启动子/CAT表达构建体转染并暴露于实施例Ⅹ所列的各种浓度化合物的MG63细胞中，报道基因表达的相对诱导水平。总之，化合物177366是最强的诱导剂，而98005没有诱导作用。
图13描述用于鉴定41个碱基对的雷洛昔芬反应性元件的部分TGFβ-3启动子，并描述在用质粒转化的细胞中，雷洛昔芬对报道基因表达的有关诱导，所述质粒含有与报道基因可操作相连的TGFβ-3启动子序列被指示部分。尽管用pB-301构建体达到的诱导倍数最高，但雷洛昔芬反应性元件(碱基+35至+75)的存在，对于这些细胞中雷洛昔芬明显诱导的转录显然是必需的。
图14描述对TGFβ-3启动子的分析。按实施例Ⅺ中的说明，描述了主要的转录起始位点和CCCTC-基序。
图15描述存在雌激素受体和各种浓度雌二醇及雷洛昔芬的情况下，在用含有LDLR启动子和荧光素酶基因的表达构建体转染的Hep 2细胞中，报道基因的有关表达。总之，雷洛昔芬是较强的诱导剂。
图16描述存在各种深度雌二醇和雷洛昔芬但没有雌激素受体的情况下，在用含有LDLR启动子和荧光素酶基因的表达构建体转染的Hep 2细胞中，报道基因的有关表达。在等于或低于10-6M的浓度时，任何一种化合物均不表现出诱导作用。高浓度雷洛昔芬诱导一些表达，这表明在所述浓度下的一种不同的、非-ER依赖性诱导机制。
图17是一个流程图，举例说明可按本发明教导完成的步骤顺序，以便评估化合物诱导与本文描述的调控元件可操作连接的报道基因转录的能力。期望在表现出实施例ⅩⅢ所述诱导模式的化合物与能够作为活体内抗骨质疏松药物起作用的所述化合物之间存在一种相互关系。
根据本发明，提供了新颖且有效的筛选化合物的方法，以确定这些化合物是否能够调节来自含有雷洛昔芬反应性元件的启动子的甾类激素-反应性基因的表达。也提供了基本由含有从TGFβ基因启动子区分离的雷洛昔芬反应性元件的核苷酸序列组成的核酸及用其转染的真核细胞。也提供了一种重组表达构建体，含有与报道基因可操作连接的雷洛昔芬反应性元件。也提供了一种治疗骨折的方法，一种治疗骨质疏松症的方法，一种治疗骨折的方法，包括施用一种化合物，当它与雌激素受体结合时，能够诱导从TGFβ基因启动子区开始的雷洛昔芬反应性元件的转录。
本发明涉及新颖且有效的筛选化合物的方法，以确定那些化合物是否能调节由始自含有本文发现并描述的雷洛昔芬反应性元件的哺乳动物启动子甾类激素-反应性基因的表达。本发明包括基本由含上述雷洛昔芬反应性元件的哺乳动物启动子组成的核酸。在优选的实施方案中，含有雷洛昔芬反应性元件的启动子得自人TGFβ-3或TGFβ-2基因的启动子区。
本发明还包括含有启动子的真核表达构建体，所述启动子带有与报道基因可操作相连的雷洛昔芬反应性元件。在优选的实施方案中，报道基因是氯霉素乙酰基转移酶基因或荧光素酶基因。特别优选的是荧光素酶基因。本发明也提供用所述真核表达构建体转染的细胞，当所述细胞暴露于雷洛昔芬或其它抗雌激素化合物时，能表达报道基因。
本发明还包括诱导骨形成的方法，包括施用有效量的一种化合物，当它与雌激素受体结合时，能够从TGFβ-3基因启动子区的雷洛昔芬反应性元件诱导转录。本发明也提供一种治疗骨折的方法，包括施用有效量的一种化合物，当它与雌激素受体结合时，能够从TGFβ-3基因启动子区的雷洛昔芬反应性元件诱导转录。
在第一方面，本发明提供基本由含有雷洛昔芬反应性元件的核苷酸序列组成的核酸，其中所述元件来自哺乳动物，优选的是人的转化生长因子β基因的启动子区。在优选的实施方案中，转化生长因子β基因是从TGFβ-2基因或人TGFβ-3基因。在本发明这一方面进一步优选的实施方案中，所述核酸基本由如本文进一步描述的下列质粒中的TGFβ-3基因的启动子序列组成质粒pB-301(含位置-301到+110的TGFβ-3启动子序列)、pB-221(含位置-221到+110的TGFβ-3启动子序列)、pB-91(含位置-91到+110的TGFβ-3启动子序列)、pB-60(含位置-60到+110的TGFβ-3启动子序列)、pB-47(含位置-47到+110的TGFβ-3启动子序列)、pB-38(含位置-38到+110的TGFβ-3启动子序列)。
在第二方面，本发明提供含有核酸的重组表达构建体，所述核酸基本由含有与报道基因可操作相连的雷洛昔芬反应性元件的核苷酸序列组成，其中，所述元件来自哺乳动物，优选的是人的转化生长因子β基因的启动子区。在优选的实施方案中，转化生长因子β基因是人TGFβ-2基因或人TGFβ-3基因。在优选的实施方案中，报道基因是氯霉素乙酰基转移酶基因或荧光素酶基因。特别优选的是荧光素酶基因。在本发明这一方面进一步优选的实施方案中，所述核酸含有基本由TGFβ-3基因启动子序列组成的启动子序列，所述TGFβ-3基因启动子序列含有如在本文进一步描述并与报道基因可操作相连的质粒pB-301(含位置-301到+110的TGFβ-3启动子序列)、pB-221(含位置-221到+110的TGFβ-3启动子序列)、pB-91(含位置-91到+110的TGFβ-3启动子序列)、pB-60(含位置-60到+110的TGFβ-3启动子序列)、pB-47(含位置-47到+110的TGFβ-3启动子序列)、pB-38(含位置-38到+110的TGFβ-3启动子序列)。
另一方面，本发明的重组表达构建体能够在用上述构建体转染的真核细胞中表达由所述构建体编码的报道基因。在优选的实施方案中，所述真核细胞还表达一个雌激素受体蛋白或其突变衍生物。在特别优选的实施方案中，通过用雷洛昔芬或本文定义的其它抗-雌激素化合物处理所述细胞，能够诱导由本发明重组表达构建体所携带的报道基因的表达。
本发明第三方面提供将本发明重组表达构建体导入其中的真核细胞。在优选的实施方案中，所述真核细胞是用本发明重组表达构建体转染的细胞。在优选的实施方案中，本发明的真核细胞表达雌激素受体或其突变衍生物。在特别优选的实施方案中，通过用雷洛昔芬或本文所定义的其它抗-雌激素化合物处理所述细胞，能够诱导报道基因在所述细胞中的表达。
本发明也提供筛选多种化合物的方法，以鉴别可作为抗骨质疏松药物的那些化合物。本发明该实施方案的一个方面是提供筛选多种化合物的方法，以鉴别可作为抗骨质疏松药物的那些化合物。由本发明这一方面提供的方法包括从多种化合物中鉴别能从哺乳动物启动子雷洛昔芬-反应性元件诱导转录的化合物，它是一种特异性的转录诱导剂，不能从哺乳动物启动子雌激素反应性元件诱导转录，并且是一种抗雌激素或非雌激素化合物。由该实施方案提供的方法还包括步骤(a)检测化合物诱导从哺乳动物启动子雷洛昔芬反应性元件转录的能力;(b)检测化合物缺乏从没有雷洛昔芬反应性元件的哺乳动物启动子诱导转录的能力;(c)检测化合物不能从雌激素反应性启动子诱导转录的能力;和(d)检测化合物在存在雌激素的情况下，抑制雌激素诱导的从雌激素反应性启动子转录的能力。
在优选的实施方案中，(a)部分的检测还包括确定所述化合物诱导与含有雷洛昔芬反应性元件的哺乳动物启动子可操作相连的报道基因表达的能力的步骤。在另一优选的实施方案中，(b)部分的检测还包括确定所述化合物不能诱导与哺乳动物启动子可操作相连的报道基因表达的能力的步骤，其中，所述启动子不含有雷洛昔芬反应性元件。本发明这一方面的另一优选的实施方案提供(c)部分的检测还包括确定所述化合物不能诱导与雌激素反应哺乳动物启动子可操作相连的报道基因表达的能力的步骤。在最后优选的实施方案中，本发明提供的(d)部分的检测还包括确定所述化合物在雌激素存在情况下，抑制与雌激素反应哺乳动物启动子可操作相连的报道基因的雌激素依赖性诱导表达的能力的步骤。
在本发明这一方面特别优选的实施方案中，雷洛昔芬反应性哺乳动物启动子分离自哺乳动物优选的是人的转化生长因子β基因。最优选的实施方案是，其中转化生长因子β基因是人的TGFβ-2基因或人TGFβ-3基因。在其它优选的实施方案中，报道基因是氯霉素乙酰基转移酶基因或荧光素酶基因。在本发明这一方面其它优选的实施方案中，雷洛昔芬反应性启动子序列基本上由TGFβ-3基因的启动子序列组成，所述启动子序列含有质粒pB-301(含位置-301到+110的TGFβ-3启动子序列);pB-221(含位置-221到+110的TGFβ-3启动子序列)、pB-91(含位置-91到+110的TGFβ-3启动子序列)、pB-60(含位置-60到+110的TGFβ-3启动子序列)、pB-47(含位置-47到+110的TGFβ-3启动子序列)、pB-38(含位置-38到+110的TGFβ-3启动子序列)。它们如本文将进一步描述的，并可操作地与报道基因相连。
从对特定优选的实施方案和权利要求的更详细描述中，可使本发明具体优选的实施方案变得清楚明白。
本说明书包括许多缩写。本文所用的“TGFβ”指转化生长因子β(不涉及异构体)。TGFβ-1、TGFβ-2和TGFβ-3具有本领域确定的意思，即代表转化生长因子β基因的三种已知的异构体。本文所用的缩写“CAT”表示氯霉素乙酰基COA转移酶。“雌二醇”是一种雌激素，本文有时缩写为E2。本文所用的缩写“ER”表示雌激素受体蛋白质。
本文所用的术语“雷洛昔芬反应性元件”指含有哺乳动物TGFβ基因启动子区核酸的核苷酸序列。所述启动子区能够诱导在暴露于雷洛昔芬和雌激素受体蛋白的宿主细胞中与雷洛昔芬反应性元件可操作相连的任何结构基因的转录。雷洛昔芬反应性元件包括，但不限于含有如在本文中进一步描述的下列质粒的TGFβ启动子序列的核苷酸序列和与那些具有与之基本相同生物学活性的核酸，所述质粒为质粒pB-301(含位置-301到+110的TGFβ-3启动子序列)、pB-221(含位置-221到+110的TGFβ-3启动子序列)、pB-91(含位置-91到+110的TGFβ-3启动子序列)、pB-60(含位置-60到+110的TGFβ-3启动子序列)、pB-47(含位置-47到+110的TGFβ-3启动子序列)、pB-38(含位置-38到+110的TGFβ-3启动子序列)。该定义包括在TGFβ基因启动子区的天然等位基因变异体。可以从任何种哺乳动物TGFβ启动子，但最好是人的，得到分离的本发明雷洛昔芬反应性元件。
本文所用的抗雌激素包括全部和部分雌激素拮抗剂。本文描述的实施例中所用的所有雌二醇是17β-雌二醇。
术语“有效量”指化合物的量，当给哺乳动物施用时，所述化合物与雌激素受体结合，能够诱导雷洛昔芬反应性元件的转录。根据具体的环境，包括施用的化合物、施用途径、被治疗的具体条件以及类似的考虑来确定所施用化合物的具体剂量。
术语“有效地”指当在本文描述的体外检测中测试所述化合物时(参见实施例Ⅴ、Ⅵ、Ⅹ和ⅩⅣ)，化合物以低于或等于10nM(1×10-8M)的最小有效浓度与雌激素受体结合，诱导从雷洛昔芬反应性元件的转录。
根据其距离、核苷酸数、从基因的主要转录起始位点(在图1-3中将该起始位点作为+1)开始来鉴别所有部分的启动子序列。数字前的负号(-)表示5′到起始位点的核苷酸序列，数字前的正号表示3′到起始位点的核苷酸。用SEQ ID NO 1-3中标明的数字鉴别这些序列，并且与图1-3的数字对应。
从本公开的角度，可以用化学合成法、体外扩增[包括但不限于聚合酶链反应(PCR)]或从天然产生的来源(如哺乳动物细胞培养物、来自所述细胞的基因组DNA或所述DNA的文库)或将这些方法结合起来得到编码本发明雷洛昔芬反应性元件的DNA。
可以将雷洛昔芬反应性元件有效地与报道基因可操作相连并通过使用适当的载体、构建体及本领域熟知的方法，如DNA介导的基因转移方法(包括但不限于转染、电穿孔和病毒介导的感染)瞬时或稳定地转化适当的宿主细胞。本文所用的术语“重组表达构建体”是指能够直接表达与本发明雷洛昔芬反应性元件可操作相连的报道基因的DNA构建体。
当DNA区彼此在功能上有关时，它们是可操作相连的。例如，如果一个启动子能控制一个编码序列的转录，则它与该序列是可操作相连的;如果可将一个核糖体结合位点定位以便进行翻译，则它与编码序列是可操作相连的。
可以用标准方法，如酶活性测定、比色法、化学发光法、样品中存在的放射性、ELISA、抗体结合、放射免疫或本领域专业人员已知的定量方法将编码结构蛋白的报道基因定量，可根据所选的宿主和所选的转化方法改变所用的报道基因。有用的报道基因包括但不限于氯霉素乙酰基转移酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或任何其它可确定数量的蛋白质产品。在本发明优选的实施方案中，报道基因是荧光素酶。
转染细胞是用经重组DNA技术生产的雷洛昔芬反应性元件-报道基因重组表达构建体转染的细胞。已经用重组雷洛昔芬反应性元件-报道基因表达构建体转染的细胞(作为所述细胞的特征或由于雌激素受体编码表达构建体的共转染)将在适当的环境下(即暴露于一种抗雌激素或其它诱导剂)表达报道基因的基因产物。例如，适用于本发明的一个优选的细胞系MCF-7，能够表达雌激素受体。对于所述细胞系，单独用重组雷洛昔芬反应性元件-报道基因表达构建体转染，可以产生适用于本发明的细胞。另外，MG63细胞以雷洛昔芬-依赖性方式表达报道基因，仅当雷洛昔芬反应性元件-报道基因表达载体和雌激素受体表达载体的共转染时。
由多细胞生物得到的细胞培养物是适于表达雷洛昔芬反应性元件-报道基因表达构建体的宿主。理论上讲，可以使用任何天然表达雌激素受体或经遗传工程方法修饰的表达雌激素(或其部分受体)的高等真核细胞。如在实施例中所说明的，哺乳动物细胞是优选的。在细胞培养物中繁殖所述细胞已成为一种常规方法。(参见Tissue Culture，Academic Press，Kruse & Patterson，编辑(1973))。有用的宿主细胞的实例是MCF-7、MG63、HeLa、RL95.2、Hep G2和CHO细胞(所有的均可从美国典型培养物收集中心，Rockville，Maryland得到)。根据本发明的目的。使用MCF-7细胞系是特别优选的，由于该细胞系可以表达雌激素受体。
按下文实施例所述，可以用表达雌激素受体或部分受体并含有雷洛昔芬反应性元件-报道基因表达构建体的宿主细胞评估化合物通过雷洛昔芬反应性元件诱导转录的能力。在本发明优选的实施方案中，如果存在化合物比没有化合物的情况下，报道基因的表达可增加2倍，就认为该化合物经调节元件(包括但不限于从TGFβ启动子或其缺失构建体得到的核酸)可诱导转录。在不太优选的实施方案中，如果化合物诱导的转录比对照高50%，则认为化合物是转录诱导剂。然而，总之，上述可检测的诱导足以表明由化学化合物生产的诱导。
在本发明具体筛选方法的实践中(见实施例ⅩⅢ)，由于质粒pB-301表现出对雷洛昔芬的高水平反应性，所以使用该质粒是优选的。其它实施方案使用含有包括位置-38到+75 TGFβ-3启动子区的构建体。在本发明所有操作实施方案中，将雷洛昔芬反应性元件以能够转录的方式与报道基因可操作相连，由于该元件对于允许本文描述的雷洛昔芬反应诱导是必需的。
完成本发明筛选方法步骤的顺序可以改变，在某些情况下，有些步骤可以取消。下列实施例是本发明说明性的具体的实施方案和其各种用途。它们仅仅用于解释目的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1构建报道质粒A.phTG12、pTGF-1和pB-499作为开发用于筛选用效抗骨质疏松药物的细胞系的第一步，首先是从A. Roberts，National Institutes of Health，Laboratory of Chemoprevention(NIH/NCI，Bethesda，MD)得到一系列编码氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)(Gorma等人，Molec.Cell.Biol.，2，1044-1051(1982))的报道质粒，其中的CAT基因经操作连接至TGFβ-1、TGFβ-2和TGFβ-3基因的启动子序列上。这些质粒分别被命名为phTG12(TGFβ-1)、pTGF-1(TGFβ-2)和pB-499(TGFβ-3)。编码上述启动子的每个序列可见于下列文献，即Kim等人，J. Biol. Chem.，264，402-408(1989))(TGFβ-1);Noma等人，Growth Factor，4，247-255(1991)(TGFβ-2)和Lafyatis等人，J.Biol.Chem.，265，19128-19136(1990)(TGFβ-3)。TGFβ-1的启动子序列已被递交到GenBank/EMBL数据库，入藏登记号为JO 4431。TGFβ-1、TGFβ-2和TGFβ-3启动子序列分别示于图1、图2和图3中，并分别以SEQ IC NO∶1、SEQ IC NO∶2和SEQ ID NO∶3表示。
另外，利用常规的克隆技术(参见Sambrook，Fritsch，and Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，2d ed.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Horbor，New York，下文称为Sambrook等人)将每一TGFβ启动子亚克隆到一个商售的CAT构建体(例如，以pCAT为基础的CAT构建体，Promega，Madison，WI)中即可生产经操作与每一TGFβ启动子序列相连的含CAT的报道质粒。
为了鉴定应答抗雌激素雷洛昔芬的TGFβ-3基因启动子区，分析了由含有部分TGFβ-3基因启动子序列的构建体指导下的CAT报道基因的表达。从A.Roberts获得六个TGFβ-3启动子缺失/CAT报道构建体。这些质粒的命名及每一质粒中所含启动子区的范围如下pB-301 -301-+110(对应于图3和SEQ ID NO∶3中的1896-2306)pB-221 -221-+110(对应于图3和SEQ ID NO∶3中的1976-2306)pB-91 -91-+110(对应于图3和SEQ ID NO∶3中的2106-2306)pB-60 -60-+110(对应于图3和SEQ ID NO∶3中的2137-2306)
pB-47 -47-+110(对应于图3和SEQ ID NO∶3中的2150-2306)pB-38 -38-+110(对应于图3和SEQ ID NO∶3中的2159-2306)如下所述构建另外两个TGFβ-3启动子缺失构建体。其中的第一个构建体含有对应于启动子序列中-38-+75位的人TGFβ-3启动子区序列，这段序列相当于图3和SEQ ID NO∶3中的2159-2271(参见Lafyatis等人，出处同上)。第二个启动子缺失构建体包含对应于启动子序列中-38-+35位的人TGFβ-3启动子区序列，这段序列相当于图3和SEQ ID NO∶3中的2159-2231。在本领域中完善建立的手段将用于鉴定自转录起始位点的距离开始需被鉴定的所有启动子序列。
上述质粒的制备过程如下，利用DNA/RNA合成仪(Model 394，Applied Biosytems Inc.，Foster City，CA)根据制造商的说明在β-氰乙基磷酰胺糖醇合成条件下合成对应于每一质粒所需的TGFβ-3启动子序列长度的寡核苷酸。利用常规方法(Sambrook et al.，出处同上)合成，纯化和混合用于每个质粒构建体的寡核苷酸互补对，并使之退火形成对应于合适TGFβ-3启动子序列的双链DNA。合成HindⅢ和XbaⅠ限制性酶识别位点分别在序列的3′和5′端作为适宜的突出末端。然后将双链启动子序列连接到经HindⅢ/XbaⅠ消化的CAT报道质粒pB-301上，并在标准条件下于细菌中增殖。以此产生的含TGFβ-3启动子-38-+75区的报道质粒称为pTGFβ+75CAT，而含有TGFβ-3启动子的-38-+35区的质粒被称为pTGFβ+35CAT。这些质粒如下面的实施例Ⅴ所述用于CAT检测中。
B.含有TGFβ-3启动子缺失构建体的荧光素报道质粒及不含启动子区的对照质粒pTGFβ-301LUC、pTGFβ-38LUC、pTGFβ+75LUC、pTGFβ+35LUC和pLUC构建四种含有在TGFβ-3启动子序列的转录调控下被表达的荧光素酶基因(REF)及其改变的缺失之衍生物的质粒。质粒pTGFβ-301LUC的制备是通过用HindⅢ消化pB-301，然后用细菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段(Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN)进行处理使HindⅢ消化产生的突出末端平端化。用XbaⅠ消化，释放出对应于-301-+110位的TGFβ-3启动子部分。该片段被亚克隆入SamⅠ/XbaⅠ消化的pSP73(Promega)中，产生穿梭载体pSPTGFβ-301。
在细菌体内进行扩增后，用NdeⅠ和HindⅢ消化被分离和纯化的pSPTGFβ-301的制备物，在经0.8%琼脂糖凝胶(BRL-Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)电泳分开后分离含启动子序列的片段。用NdeⅠ/HindⅢ消化含荧光素酶的构建体pLDLRLUC10(如1993年3月3日申请、申请号为08/018，985的美国专利申请所描述，并被进一步描述于下文的C部分中)，并在经琼脂糖凝胶电泳后纯化。然后混合、连接这些分离的片段，并用于转化细菌(Sambrook等人，出处同上)。
通过BamHⅠ/XbaⅠ双酶切的消化作用分别从pB-38、pTGFβ+75CAT和pTGFβ+35CAT中首先切除TGFβ-3的启动子序列构建质粒pTGFβ-38LUC、pTGFβ+75LUC和pTGFβ+35LUC。用NheⅠ/BamHⅠ消化制备以pGL2为基础的含荧光素酶的质粒(或“pGL2LUC”)(Promega)并通过将适宜的TGFβ-3启动子序列连接入含荧光素酶的质粒而制备每一种重组质粒。这些质粒将被用于下面的实施例Ⅵ中所述的荧光素酶检测中。
含有荧光素酶基因但不携带TGFβ-3基因部分的对照质粒是通过用限制性酶XbaⅠ和HindⅢ消化pTGFβ+75LUC质粒DNA来构建的。在标准条件下(Sambrook et al.，出处同上)通过加入所有四种dNTP的Klenow酶反应将凸出的末端填平。在生产商建议的条件下将上述的平末端与T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim)连接。
C.含LDLR启动子的报道质粒pLDLRLUC101993年3月3日申请、申请号为08/018，985的美国专利申请(下文称为985申请)描述了质粒pLDLRLUC10。下面将详细地描述该质粒的构建过程用聚合酶链反应扩增人LDL受体启动子的1546 bp序列。反应混合物含有下列每一种合成的寡核苷酸20pmol5′-GCGCCATATGAGTCTTAACTGCCAAAAATTCTTATCATCAAT-3′(SEQ ID NO∶4)5′-AAGCAAGCTTTCGCAGCCTCTGCCAGGCAGTGTCCCGACCCGGA-3′(SEQ ID MO∶5)和1μg由腺癌细胞系P3UCLA纯化的人基因组DNA、dATP、dGTP、dCTP和TTP各200μM、2.5U Taq DNA聚合酶、10mM Tris-HCl pH9.3、50mM KCl、15mM MgCl2和0.1%明胶，终体积100μl，上述混合物进行由96℃ 15秒、55℃ 30秒和72℃ 1秒组成的循环共30次。反应物在1%琼脂糖凝胶上电泳、分离1546 bp条带，用HindⅢ和NdeⅠ消化。该片段与预先也用HindⅢ和NdeⅠ消化过的质粒pSP72(Promega)连接。所得的载体pNLDLRP用NdeⅠ和HindⅢ消化，消化物在1%琼脂糖凝胶上电泳，从中再次分离1546 bp的LDL受体序列。
是用HindⅢ和BglⅡ消化质粒pSV2-珠蛋白，然后连接一个NruⅠ-XhoⅠ接头到载体中构建质粒载体pSV2。质粒pSV2珠蛋白公开于US4，775，624中，该专利文献并入本文作为参考。上述接头含有下列顺序5′-AGCTTCGCGACTCGAGA-3′(SEQ ID NO∶6)5′-GATCTCTCCAGTCGCGA-3′(SEQ ID NO∶7)所得的载体被命名为pSV2-H NXB，因为它含有一个BamHⅠ位点、一个NruⅠ位点、一个XhoⅠ位点和一个BglⅡ位点。将含有荧火虫荧光素酶基因(REF)的质粒pAlc4(NRRL B-18783)的HindⅢ-BglⅡ片段连接入质粒pSV2-HNXB的HindⅢ-BglⅡ位点。
分离上述的1546 bp片段，并克隆入含有荧火虫荧光素酶报道基因和已被NdeⅠ完全消化和由HindⅢ部分消化的载体pSV2中。所得载体pLDLRLUC10含有指导荧火虫荧光素酶基因表达的人LDL受体启动子、氨苄青霉素抗性标志基因和复制起点。
实施例Ⅱ人雌激素受体表达质粒含雌激素受体的哺乳动物表达构建体pCMVER和pRSV-ER得自B.S.Katzenellenbogen，Department of Physiology and Biophysics，University of Illinois(Urbana-Champaign，IL)，也可参见Reese and Katzenellenbogen，J.Biol Chem.，266，10880-10887(1990)。这些质粒被用于如下文实施例Ⅶ所述的表达检测中。
实施例Ⅲ构建含雌激素反应性元件/荧光素酶基因的质粒设计并合成对应于来自非洲蟾蜍卵黄蛋白原的雌激素反应性元件(ERE)的互补寡核苷酸(相当于-341位--310位)[Metzger et al.，Nature，334，31-36(1988)]，然后退火，形成基本如实施例Ⅰ所述雌激素反应性元件的双链区。合成含有XhoⅠ限制性酶识别位点的序列以用于侧接ERE序列，所说的元件具有下列核苷酸序列(分别如SEQ ID NO∶8和SEQ ID NO∶9所示)5′-TCG-AGA-AAA-GTC-AGG-TCA-CAG-TGA-CCT-GAT-CAA-AC-3′3′-CT-TTT-CAG-TCC-AGT-GTC-ACT-GGA-CTA-GTT-TGA-GCT-5′双链ERE被亚克隆入经XhoⅠ消化的pGL12基质粒(Promega)中，藉此，荧光素酶基因被置于ERE的转录影响之下，该质粒命名为pGL2ERELUC并被用于如下所述(实施例Ⅵ)的进一步实验中。
实施例ⅣDNA转染A.细胞培养在由Dulbecco改良的Eagle培养基和F12培养基(两者以3∶1的比例混合，得自GIBCO，Grand Island，NY)组成的培养基(称为3∶1培养基)中培养哺乳动物细胞，所说培养基不含酚红，含10%胎牛血清(FBS;Hyclone，Logan，UT)。细胞以4天的间隔传代。转染的前一天，通过将细胞与1ml 0.05%胰蛋白酶/5.3mM乙二胺四乙酸四钠(GIBCO)的溶液在室温下一起保温5分钟来处理细胞，然后以1×106细胞/10cm培养皿的密度将细胞接种于含10%用活性炭解吸过的FBS(csFBS;Hyclone)的3∶1培养基中。
B.TGFβ构建体和人ER构建体瞬时的共同转染利用ProFection哺乳动物转染系统(Promega)在MG63(人骨肉瘤)细胞中进行共同转染实验。将10μg含TGFβ启动子的报道质粒DNA与5μg含人雌激素受体(ERE)的表达质粒(pRSV-ER或pCMV-ER，得自B.S.Katzenellenbogen Department of Physiology and Biophysics，University of Illinois，也可参见Reese and Katzenellenbogen，J.Biol Chem.，266，10880-10887，1990)或pRSV(对照)质粒混合，共同被沉淀，然后转染入10cm培养皿中的2-4×106个细胞中。在细胞与DNA沉淀物于37℃一起保温15小时后，通过用Dulbecco磷酸缓冲盐液(D-PBS;GIBCO)洗涤细胞两次以除去DNA沉淀物。用含10%csFBS的新鲜3∶1培养基再次培养细胞。在适当时候加入待测其调节报道基因表达的能力的化合物，并根据下文所述进行测定。
C.TGFβ构建体和人ER构建体稳定的共同转染用MCF-7细胞进行转染实验，使得被转染的质粒序列稳定地整和到受体细胞的基因组中。在这些实验中，将含有TGFβ启动子的质粒DNA与编码可选择标志的DNA混合。例如，将60μg含TGFβ启动子的质粒DNA(pTGFβ-301LUC、pGL2LUC或pGL2ERELUC)与60μg pSV2HYG衍生的、含潮霉素抗性基因的质粒pSV2HYGtB(进一步描述于1992年9月29日申请、申请号为07/953，633的美国专利申请中，该文献并入本文作为参考混合，并利用上述ProFection系统(Promega)转染2×106个MCF-7细胞。37℃培养过夜后，如上所述从细胞中洗去沉淀物。然后将细胞用含10% FBS的新鲜3∶1培养基在37℃重新培养48小时，此时的细胞一般达到了融合。如上所述用胰蛋白酶处理细胞，再将每个培养皿中的内容物装入两个10cm培养皿的含10%FBS 3∶1培养基中。通过在添加了200μg/ml潮霉素B(Calbiochem-Novabiochem，LaJolla，CA)的培养基中培养细胞来选择潮霉素抗性。每两天用添加了潮霉素B的新鲜培养基更换上述选择培养基，但不扰乱细胞的选择实验过程。于选择培养基中生长约14天后可见克隆的菌落。分离这类克隆，并用无菌吸移管管尖移至24孔细胞培养板(Flow Laboratories，Mclean，VA)的各孔中。这种克隆在选择培养基中生长并维持。
为了鉴定已用含荧光素酶基因的质粒序列成功地进行了共转染的潮霉素抗性克隆，用聚合酶链反应(PCR)检测转染体DNA中的荧光素酶cDNA衍生的DNA序列。合成相当于荧光素酶cDNA序列的355-373位(有意义引物)和929-911位(反义引物)的寡核苷酸PCR引物。在基本上如生产商所述的条件下利用Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 9600进行PCR共35次循环，每个PCR循环包括94℃ 45秒、55℃ 45秒和72℃ 2分钟。
将含荧光素酶的潮霉素抗性克隆与如上所述的雌激素或raloxifene一起保温，通过测定存在于细胞提取物中的酶活性量分析对报道基因表达的影响。为了测定荧光素酶，在含有0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.8)/1% Triton X-100(Boehringer Mannheim)/2mM EDTA和1mM二硫苏糖醇(DTT，Boehringer Mannheim)的白细胞裂解剂中裂解细胞，并用由Analytical Luminescence Laboratory(San Diego，CA)改良的最佳未增强的荧光素酶测定方案进行检测。然后将这类用TGFβ报道基因构建体稳定转染的细胞的克隆用于如下所述(实施例ⅩⅢ)的新型抗骨质疏松筛选测定法中。
实施例Ⅴ分析由雌激素和抗雌激素激活的TGFβ启动子介导的转录现有技术已知，用雌激素和三苯氧胺可以不同程度地诱导TGFβ-1、TGFβ-2和TGFβ-3基因的表达(参见背景技术及相关技术部分)。利用上述含有TGFβ启动子的质粒可在下述一系列体外表达测定中描述所说可诱导性的程度和方式的特征。
利用ProFection系统(Promega)以pRSVER质粒与phTG12或pTGF-1或pB2-499一起瞬时地共转染MG63细胞的培养物，对于每个被转染的培养物而言，滴加含DNA的磷酸钙培养物至每一培养皿中，并在培养基中充分混匀。培养基的pH值要精确地维持在pH7.2-7.4。被转染的培养物在5% CO2中于37℃培养过夜。之后，通过从所有培养物的培养皿中吸出培养基随后再用D-PBS洗各皿两次而去除沉淀物。对于每个被共转染的细胞系，用含有10% csFBS和下列成分之一的10ml新鲜培养基替换缓冲液a.10μl乙醇(激素载体)＝对照;
b.溶于乙醇浓度为10-4M的10μl 17β-雌二醇(Sigma)(“estradiol”);
c.溶于乙醇浓度为10-4M的10μl雷洛昔芬(Eli Lilly Laboritories);
d.溶于乙醇浓度为10-4M的10μl三苯氧胺(Sigma)。
在与上述激素制备物(或载体对照)一起孵育24小时后，用D-PBS洗细胞两次。然后用rubber policeman和1ml D-PBS将细胞从培养皿中刮下。在台式离心机(MicroMax Model，IEC，Newark，NY)中以8，000rpm离心两分钟收集细胞。去掉上清细胞团丸重悬于150μl 0.25M Tris-HCl溶液(pH7.8)。通过在干冰/乙醇浴中冷冻和在37℃水浴中融化的三次循环来裂解细胞，每个循环历时3分钟。被裂解的细胞制备物在4℃下以15，000rpm离心5分钟，除去细胞碎片。将含有可溶性细胞裂解物的上清液移至新的一套试管中，以测定氯霉素乙酰转移酶(CAT)活性。
在对这类细胞裂解物进行测定之前，用商售测定剂(BioRad Laboratories，Richmond，CA)首先确定每一裂解物中的蛋白质含量。含100μg总蛋白的每一细胞裂解物与CAT测定缓冲液
-氯霉素)混合15小时。经此保温后，通过用900μl乙酸乙酯强烈地抽提反应混合物而中止反应。以14，000rpm短暂离心1分钟分离出有机相和水相，将大约800μl有机相移至一套新的试管中。蒸发乙酸乙酯以浓缩CAT催化的反应产物。
用95∶5(V/V)氯仿/甲醇混合物作为上行缓冲液，借助薄层色谱分辨乙酰化和未乙酰化的氯霉素。用Batascope 603印迹分析仪(Betagen，Intelligenetics Inc，Mountain View，CA)检测被分辨的每种氯霉素的放射活性。计算乙酰化的量相对于总量的百分比，得到每种被测转染体的相对CAT活性(本文所表示的全部CAT活性均是以此为基础计算的)。每一测定进行两次。
用MG63转染细胞系进行上述实验所得的结果示于图4中。有代表性实验的结果列表显示如下 Fold induction是在与对照进行比较的基础上计算出来的。
这些实验表明，CAT报道基因的转录是由雌激素和抗雌激素雷洛昔芬和三苯氧胺诱导的，雷洛昔芬表现出的效力强于雌激素，尤其反映在对TGFβ-3启动子的诱导作用上。相反，用于该实验的TGFβ-1启动子区(-1032-+727位)没有对雌二醇或雷洛昔芬产生应答。
实施例Ⅵ雌激素和雷洛昔芬对TGFβ-3启动子和卵黄蛋白原启动子的ERE的不同诱导作用前文实施例中所得结果表明，TGFβ-3启动子对雌激素和“抗雌激素”化合物如雷洛昔芬和三苯氧胺都具有转录反应性，并且由雷洛昔芬诱导的转录其程度相对要大于应答雌激素所产生的转录诱导作用。该实施例说明编码非洲蟾蜍蛋白卵黄原的基因在体内以完全相反的方式应答，也就是说，卵黄蛋白原基因的转录受到雌激素的强烈诱导，而仅仅受到雷洛昔芬的微弱诱导。此外，当同时给予雷洛昔芬和雌激素两种化合物时，雷洛昔芬强烈地拮抗雌激素诱导的产生卵黄蛋白原的诱导作用。此结果表明在上述实施例Ⅵ中所测定的报道质粒中指导报道基因转录的TGFβ启动子序列包含一个新的雷洛昔芬反应性元件，其特征在于有一个独特的雌激素及抗雌激素反应性方式。
利用前文实施例所述的报道基因测定系统进一步研究了上述雌激素和抗雌激素反应性方式。如实施例Ⅳ所述，用pB-301和pRSVER瞬时地共转染MG63细胞培养物。用浓度在10-9M-10-5M之间10倍增长变化的雌二醇和雷洛昔芬处理上述瞬时转染的培养物以检测报道基因表达的转录激活。通过测定10-8M雷洛昔芬对报道基因应答相同于单用雌激素时的系列浓度的雌激素的诱导作用的影响，也检测了雌激素和雷洛昔芬的联合作用，这些测定基本上如实施例Ⅴ进行。
用经pGL2ERELUC和pRSVER瞬时转染的MG63细胞培养物完成了类似的测定。但在这些测定中，与雌激素联用的雷洛昔芬的用量是变化的，以致于雷洛昔芬浓度是混合物中雌激素浓度的20倍(即10-9M雌激素/2×10-8雷洛昔芬;10-8雌激素/2×10-7M雷洛昔芬等)。
用各种激素含量和各种激素组合处理转染的细胞，然后用D-PBS洗两次。细胞在与200μl白细胞裂解剂(如实施例Ⅵ所述)一起于4℃保温20分钟后被裂解，用rubber policeman刮下移至微型离心机管中。细胞裂解物以14，000rpm离心1分钟除去细胞碎片。然后检测细胞提取物(上清液部分)的蛋白含量和荧光素酶活性。
荧光素酶的测定过程如下。加50μl每一细胞提取物至微量滴定板各孔的100μl试剂A缓冲液(含4.0mM A7P/15mM MgSO4/30mM麦黄酮(tricine)缓冲液(pH7.8)/10mM DTT)中。再向各孔加入100μl 1mM D(-)荧光素(溶于0.1M KPO4pH7.8，Boehringer Mannheim)，用ML3000微量滴定板发光计测量所产生的光量(条件为整合闪点模式、高增益、整合窗＝10秒，22℃)。荧光素酶活性被计算为总的光产量比上各细胞裂解物样品中的蛋白质含量。
这些检测结果制表显示如下
上述实验结果如图5所示。
这些结果清楚地说明在TGFβ基因启动子中存在一个对抗雌激素具有反应性的独特启动子区。当雷洛昔芬作为由基因(如卵黄蛋白原基因)的含ERE启动子启始的转录的有效拮抗剂时，本文发现它在诱导由TGFβ-3启动子开始的转录中充当超级激动剂。令人感兴趣的是，在低浓度时，雷洛昔芬与雌激素协同诱导本发明报道质粒中TGFβ-3启动子的转录，这表明被雷洛昔芬诱导的基因转录可以由新的机制所介导。
实施例Ⅶ用雌激素和抗雌激素激活TGFβ-3的雌激素受体依赖性基因现有技术已经知道雌激素与抗雌激素两者影响TGFβ产生的能力依赖于雌激素受体(ER)的表达，但尚不清楚在哪一级水平(即转录、翻译或翻译后)上产生上述影响。因此，利用本发明含TGFβ启动子的构建体进行了一系列实验，以研究所推定的报道基因表达的诱导作用对ER表达的依赖性，ER表达的缺乏实际上削弱了TGFβ-3的表达，无论是否存在雌二醇或雷洛昔芬。通过应用突变的ER蛋白已经确定ER分子的不同结构区负责雌激素和雷洛昔芬的诱导作用。
A.TGFβ-3的ER依赖性诱导作用如实施例Ⅳ所述制备用于共转染的NG63细胞培养物，用pB2-499和pRSVER共转染其中的一份培养物，另一份培养物用pB2-499和pRSV载体质粒(对照)共转染。然后，基本如实施例Ⅴ所述测定了下列化合物通过TGFβ-3基因的雷洛昔芬反应性元件诱导转录的能力(a)乙醇;
(b)17β-雌二醇(10-7M);
(c)雷洛昔芬(2×10-6M);
(d)17β-雌二醇(10-7M)和雷洛昔芬(2×10-6M)一个上述实验的结果列于下表中，而薄层色谱所产生的代表性实例如图6所示。
上述结果清楚地表明，ER的表达对于应答雌激素、抗雌激素及其结合，TGFβ-3基因启动子介导的报道基因表达的诱导作用是需要的。
B.分析诱导TGFβ-3启动子所需的ER蛋白结构区现有技术已经公开ER蛋白质中称为“E”的区域为结合雌激素所必需，而“C”区为结合DNA所需(参见kumar et al.，EMBO J.9，2231-2236，1986)。同样也很清楚地知道，“C”区为含ERE基因的ER激活所需，而“E”区为雌激素依赖的诱导性所需。
为了确定ER中涉及诱导TGFβ-3启动子转录的区域，如实施例Ⅳ所述制备用于共转染的MG63细胞培养物。用pTGFβ-301LUC和下列含有各种ER缺失突变体的表达质粒之一的混合物转染细胞a.pCMV-ER
b.pCMV-ER△A/Bc.pCMV-ER△B/C/Dd.pCMV-ER△E/Fe.pCMV-ER1-530f.pCMV-ERL540Q参见Reese & Katzenellenbogen，J.Biol Chem.，266，10880-10887，1990，图7中进一步说明了这些质粒中各缺失的范围。
用载体(10μl乙醇)或10-7M雷洛昔芬处理其转染的细胞，以检测上述突变ER介导雷洛昔芬诱导的TGFβ-3激活的能力。雷洛昔芬诱导的荧光素酶活性在基础活性值上的增加被计算为在如图7所示的各种突变ER形式存在下由雷洛昔芬产生的倍数诱导作用。
一个上述实验的结果示于下表中 上述结果表明，激素结合区(“即雌激素受体分子的“E”区)是必需的，并足以介导雷洛昔芬刺激的、本发明报道质粒中报道基因的TGFβ-3启动子介导的转录。ER分子的“C”区似乎不为上述过程所需。这一结果进一步支持了ER的激活基因转录新机制可牵涉TGFβ启动子转录的观点。
实施例Ⅷ雌激素和抗雌激素对TGFβ-3启动子的激活已经发现雌激素和抗雌激素化合物对TGFβ启动子介导的基因表达的转录激活作用是浓度依赖性。如实施例Ⅴ所述用pB-301和pRSVER瞬时地共转染MG63细胞培养物。这类转染细胞培养物被分成四组，每组十二份，四组培养物中的每一组都用于检测一种雌激素或抗雌激素化合物分别诱导TGFβ-3启动子转录的能力。对于每一组的十二份培养物而言，在有从10-9M-10-5M的六种浓度以10倍增加的特定雌激素或抗雌激素存在的复制培养物以及仅用载体处理的，套复制培养物(每个实验性处理共十二份培养物)中进行检测。如上所述，将激素溶解于乙醇中并用于培养物，所测试的四种雌激素和抗雌激素如下a.17β-雌二醇(Sigma Chemical Corp.，St.Louis，MO);
b.雷洛昔芬(Eli Lilly，Indianapolis，IN);
c.三苯氧胺(Sigma)d.ICI 164，384(描述于1988年7月20日发行的欧洲专利EP138504中)。
在用激素处理(或对照)24小时后，如实施例Ⅴ所述洗涤、收集、裂解细胞，并检测CAT活性。一个上述实验的结果列表显示如下，并示于图8中。
尽管所有的雌激素和抗雌激素都影响TGFβ-3启动子的活性，但每种化合物均显示出其各自独特的剂量-反应曲线。雷洛昔芬是迄今最有效的激活剂，对报道基因的转录有超过20倍的诱导作用，并且其ED50在纳摩尔浓度水平。与此相反，雌二醇仅表现出对报道基因表达4倍的诱导作用，其ED50比雷洛昔芬的高出二个数量级。三苯氧胺只在高浓度(即大于微摩尔)时激活TGFβ-3启动子。ICI 164，384的ED50为10-7M，但该化合物在高浓度(10-5M)时似乎只有很小的活性。这些结果表明在TGFβ-3基因的启动子区发现了称为雷洛昔芬反应性元件(RRE)的新元件。该元件在雌激素和抗雌激素两者存在下诱导转录，并且上述化合物中的每一种都有一个转录激活的特征性剂量-反应图。
实施例Ⅸ雷洛昔芬在CHO和MCF-7细胞中介导的TGFβ-3启动子的转录激活已在各种细胞系中证明雷洛昔芬诱导TGFβ-3启动子转录的能力不同于雌激素介导的诱导作用。
A.在CHO细胞中TGFβ-3的激活作用如实施例Ⅳ所述用pB-301和pRSVER瞬时地共转染CHO细胞培养物，并用于测定雷洛昔芬和雌二醇通过雷洛昔芬反应性元件诱导转录的能力。在同样的实验中用10-9M-10-5M10倍递增的六种浓度的雌二醇或雷洛昔芬处理十二份瞬间转染的培养物(以及只用载体作对照的十二分培养物)。如上所述，将激素溶于乙醇中，并用于培养基中的培养物。
与激素制备物(或对照物)一起保温24小时后，如实施例Ⅴ所述洗涤、收集、裂解细胞，并检测CAT活性。其结果列表显示如下，并如图9所示。
这些结果表明，当在CHO细胞中进行检测时，先前观察到的TGFβ-3启动子对雌激素和雷洛昔芬的反应性依然存在。
B.TGFβ-3在MCF-7细胞中的激活如实施例Ⅳ所述用pTGFβ-301LUC瞬时地转染MCF-7细胞的培养物。这些培养用于检测雷洛昔芬和雌二醇在这一细胞类型中诱导转录的能力。用0M、10-9M、10-8M、10-7M、10-6M和10-5M六种浓度之一的雌二醇或雷洛昔芬处理培养物。如前所述将激素溶解于乙醇中，并用于培养基中的培养物。
用激素制备物(或载体对照)处理24小时后，按照实施例Ⅵ的方法洗涤、收集、裂解细胞，并测定LUC活性。该实验的结果列表显示如下，而这类系列实验的结果总结于图10中。
(荧光素酶活性以成千的单位表示)在人子宫内膜癌细胞(RL59.2)、人宫颈癌细胞(Hela)和猴肾细胞(COS-1)(ATCC，Rockville，MD)中进行类似的实验。发现在雌激素和雷洛昔芬所有测试的细胞类型中诱导由TGFβ-3启动子开始的转录(在诱导作用的大小上不同)。这些结果表明雌激素和雷洛昔芬介导的对从TGFβ-3启动子开始的报道基因转录的诱导作用并不限于特定的细胞类型中。然而，在不同细胞中表现出的不同诱导水平可能说明在这些细胞中涉及调节作用的其它因子的充分性。用荧光素酶和CAT作为报道基因所发现的TGFβ-3启动子对雷洛昔芬和雌激素具有反应性的事实表明，该调节作用是从TGFβ-3启动子开始的基因表达的共同特征。
实施例Ⅹ用雷洛昔芬及相关化合物比较性诱导由TGFβ-3启动子开始的报道基因的表达现有技术已知抗雌激素化合物能够以剂量依赖性方式诱导TGFβ基因的表达[Knabbe等人，Am.J.Clin.Onc.，14(Suppl.2)，S15-S20(1991)]。而且，如上述实施例Ⅷ所示，已发现雷洛昔芬和三苯氧胺能够以剂量依赖性方式诱导TGFβ-3基因的表达。
为了使化合物通过TGFβ-3启动子的雷洛昔芬反应性元件产生的诱导转录的能力与其已知的在切除卵巢的大鼠中所证实的亲子宫能力相关联，进行了本实施例中所述的多个实验。测试了七种在结构上与雷洛昔芬相关的化合物通过TGFβ-3启动子的雷洛昔芬反应性元件诱导转录的能力。可以由其从亲子宫性(LY112676、LY81099和LY13314)至抗亲子宫性(LY113526、LY139482和LY177366)的体内活性谱来分辨所说的化合物，还包括一种已知在体内呈惰性的化合物(LY98005)。
上述化合物的IUPAC名称和权利要求中要求了上述化合物的美国专利如下
上述化合物描述在图11中。
测定雷洛昔芬、LY81099、LY98005、LY112676、LY113526、LY13314、LY139482和LY177366(Eli Lilly and Company，Indianapolis，Indiana)，比较其在不同浓度时诱导始自TGFβ-3基因启动子的转录的能力。用0M、10-9M、10-8M、10-7M、10-6M和10-5M的上述化合物如实施例Ⅵ所述处理经pB-301和pRSVER瞬时共转染的MG63细胞培养物。实验结果以下列表格形式表明，并描述于图12中。
显示出体内亲子宫特性的化合物(即雌激素类化合物)的ED50值大约为10-7M，并且对始自TGFβ-3启动子的报道基因表达具有相对较低的倍数诱导作用，这非常类似于雌激素在实施例Ⅷ中所反映出的情形。与之相反，类似于雷洛昔芬的体内作用情况的化合物表明ED50值为10-9M和比雌激素性化合物相对大的倍数诱导作用。有关雷洛昔芬的体内数据已在1992年7月28日申请的美国专利申请(申请号为07/920，933)中给出，该文献并入本文作为参考。总之，产生雌激素样体内特性的化合物比产生抗雌激素样体内特性的化合物表现出明显小的通过TGFβ-3启动子的转录诱导作用。
这些实验结果证明了本文所述的含报道基因表达质粒作为鉴定潜在抗骨质疏松药物的筛选技术的应用，因为那些具有雷洛昔芬样诱导作用情形和ED50的化合物比在该测定中具有较低诱导作用情形和较高ED50的雌激素样化合物显示出相对更低的亲子宫作用。
实施例Ⅺ雷洛昔芬反应性元件定位于TGFβ-3启动子中的+35至+75区至少人TGFβ-3基因启动子中的一部分雷洛昔芬反应性元件大概定位地+35至+75位的特定41个核苷酸序列。发现该序列对于介导雷洛昔芬诱导的上述TGFβ报道基因表达构建体中报道基因表达的转录激活作用所必需的。
A.通过对体外制备的TGFβ-3启动子缺失突变体进行功能性分析来鉴定雷洛昔芬反应性元件如实施例Ⅰ所述，制备用pCMVER和多种TGFβ-3启动子缺失报道构建体之一(包括pB-499、pB-301、pB-221、pB-91、pB-60、pB-47、pTGFβ-38LUC、pTGFβ+75LUC、pTGFβ+35LUC和pLUC)瞬时共转染MG63细胞培养物。然后用乙醇(作为对照)或10-6M雷洛昔芬处理上述培养物，计算每一TGFβ-3启动子缺失构建体用雷洛昔芬处理后诱导报道基因表达的程度相对于单用载体处理所得到的诱导程度，列表显示如下，并描绘于图13中
这些结果将至少一部分雷洛昔芬反应性元件定位于TGFβ-3启动子序列的+35至+75位。
B.雷洛昔芬反应性元件的核苷酸序列TGFβ-3启动子从-38至+110位的核苷酸序列描绘在图14中。以上发现的雷洛昔芬序列是图中以略图形式描绘的序列。空心箭头表示主要的转录起始位点(+1)。两个黑箭头表示两个小的转录起始位点。“TATA”序列示以明框。推定的CCCTC基序用推定的雷洛昔芬反应性元件序列下一系列的水平箭头表示。参见Lobanenkov et al，Omogene，5，1743-1753，1990。
由对TGFβ-3的分析可得出两个结论。其一，在TGFβ-3启动子区发现没有与ERE同源的回文序列。这个发现与在实施例Ⅶ中所表明的不需要ER的DNA结合活性的结果相一致。其二，ER介导的TGFβ-3的雷洛昔芬激活很可能需要能够结合至雷洛昔芬反应性元件上的其它因子。一个很好的这类蛋白质的候选物是由Lobanenkov等人鉴定的，涉及c-myc基因调节的CTCF因子。这些结果使得可以鉴别作为在其启动子中具有雷洛昔芬反应性元件的潜在雷洛昔芬可调基因的其它基因。而且，这类基因可用于鉴别具有用于实施例ⅩⅢ所述筛选程序中的雷洛昔芬反应性元件活性的遗传元件。
本发明的雷洛昔芬反应性元件用于检索GenBank序列库。在该元件及下列基因的元件间发现了显著的同源性GenBank/EMBL 数据库入藏登记号 基因X56595 鸡Ⅵ型胶原蛋白_-2X55373 人ETS-2启动子区M30137 人ETS-2(5′侧翼)D10231 小鼠葡萄糖运输因子(增强子2)M12731 小鼠N-myc原癌基因M13945 小鼠pim-1原癌基因S63281 R.norvegicus N-myc基因X16995 小鼠N10基因M94152 大鼠腺苷受体M20131 大鼠细胞色素p450ⅡE1M34111 大鼠PTHrPJ05097 大鼠P物质受体M64236 大鼠P物质受体上述结果支持该元件作为一个能在各种组织和细胞类型中介导体内多向性生理作用的分离的和重要的调节单位存在。
实施例Ⅻ雌激素和雷洛昔芬诱导LDL受体启动子激活LDL受体表达在调节血清LDL-胆固醇摄入过程中起重要作用。已知雌激素在体内诱导LDL受体的信使RNA(Ma等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，792-796，1986)。如本实施例所示，ER介导雌激素对LDL受体启动子序列的激活作用。雷洛昔芬也诱导LDL受体启动子，但这种诱导作用是ER非依赖性的。
A.雌激素和抗雌激素在ER存在下诱导LDLR-LUC产生如实施例Ⅳ所述，用pLDLRLUC10和pRSVER共转染ATCC HepG2细胞株。在实施例Ⅵ所述条件下将上述细胞与雌二醇和雷洛昔芬接触。其结果制表显示如下，系列实验的结果描绘于图15中。
B.没有ER时雌激素和抗雌激素诱导的LDLR-LUC的产生如实施例Ⅳ所述，用pLDLRLUC10和pRSV载体质粒共转染ATCCH2pG2细胞株。在实施例Ⅵ所述条件下将上述细胞与雌二醇和雷洛昔芬接触。其结果制表显示如下，有代表性的系列实施结果示于图16中。
上述结果表示雷洛昔芬和雌激素两者都具有诱导LDL受体表达的能力。该结果提供了一种用雌激素和雷洛昔芬在动物模型中和人体中降低血脂的解释。
实施例ⅩⅢ筛选潜在抗骨质疏松药物的方法在上述实施例的基础上设计了用荧光素酶作为报道基因的测定法以筛选潜在的抗骨质疏松的药物。
利用实施例Ⅳ中所述方法用pTGFβ-301LUC、pGL2LUC或pGL2ERELUC稳定地转染MCF-7细胞培养物。然后将细胞用于图17所描述的有创造性的方法中。
步骤1.用于筛选测定中的第一步是确定化合物诱导自TGFβ-3启动子开始转录的能力用经pTGFβ-301LUC稳定转染的MCF-7细胞、基本按实施例Ⅸ所述方法进行测定。细胞培养和测定条件要适合96孔微量滴定板形式。以产生大约50%融合的密度接种细胞至96孔板中。测试化合物选自各种来源，包括药物研究记录、化学生产商的产品目录以及天然存在的来源，如发酵提取物。在含有测试化合物的生长培养基(如实施例Ⅳ所述)中培养细胞约24小时。然后在板中原位裂解细胞，裂解物进行定量蛋白测定和荧光素酶活性测定。诱导荧光素酶活性增加2倍以上的化合物被认为能够用于进一步的试验中。
步骤2.用如步骤1所述鉴定的化合物对已用pGL2LUC稳定转染的细胞培养物进行测定，以确定这类化合物是普通的转录诱导剂。当这类普通的转录诱导剂缺乏作为雷洛昔芬反应性元件依赖性基因表达的调节子的潜在抗骨质疏松药物所需的转录诱导特异性时，这类普通的诱导剂被排除于进一步的试验之外。
步骤3.具有作为潜在抗骨质疏松所需转录诱导特异性(即能在pTGFβ-301LUC细胞中诱导转录诱导作用而不在用pGL2LUC转染的细胞中诱导转录)的化合物是雷洛昔芬反应性元件依赖性基因表达的调节子，对其进行测定以明确这类化合物是否诱导始自雌激素反应性元件的转录。如实施例Ⅵ所述，在存在和缺乏雌二醇的情况下测定用pGL2ERELUC稳定转染的细胞。在缺乏雌激素的情况下能激活pGL2ERELUC的化合物不具备进一步测试的资格，因为这些化合物在缺乏雌激素的情况下能够诱导始自雌激素反应性元件的转录表明了在体内具有潜在的雌激素性活性。
步骤4.进一步测试完全符合步骤1-3标准的化合物，以确定这类化合物是抗雌激素类的，或是非雌激素类/非抗雌激素类的。为此，在雌二醇存在的情况下在用pGL2ERELUC稳定转染的细胞中测试化合物。在该测定中所产生的对雌激素诱导的荧光素酶活性的抑制作用表明这类化合物具有抗雌激素性活性。抗雌激素性和非雌激素性化合物将由其剂量-反应方式和ED50值来描述特征。可以进行进一步的实验以确定这类化合物的剂量-反应类型，并将其与已知的抗雌激素(如雷洛昔芬)进行比较。参见实施例Ⅹ。
根据上述筛选方案，可以应用常规测定法，尤其是涉及适宜动物模型系统的体内测定法进一步描述如本文所述鉴定的化合物的抗雌激素性特征。由本测定法鉴定的化合物可有利地和迅速地实现对具有所需抗骨质疏松特性的抗雌激素类化合物的开发。
实施例ⅩⅣ体外和体内活性间的相互关系进行下面的实验以确定体外测定和绝经后骨质疏松体内模型间的相互关系。体外测定检测测试化合物通过TGFβ-3启动子的雷洛昔芬反应性元件诱导转录的能力。体内模型检测除去卵巢的大鼠中骨(股骨)质密度的改变。下面的化合物将用于这些实验中。
如US4，133，814(1979年1月9日出版)所述制备上述化合物，该文献并入本文作为参考。
测定雷洛昔芬、088074、156678、171147和309503(Eli Lilly and Company)，以确定在小于10nM的浓度下[即最小有效浓度(MEC)＜10nM]对始自TGFβ-3基因启动子的转录产生2倍诱导作用的能力(如由荧光素酶活性所测)。转染前一天，用0.05%胰蛋白酶/5.3mM乙二胺四乙酸(EDTA)四钠的溶液处理Hela细胞，产生单个细胞悬液。计数拆开的融合细胞，并稀释至1×106细胞/ml的浓度。将3×106细胞和3∶1培养基加至t-150烧瓶中，培养过夜。第二天，从细胞中除去培养基，代之以新鲜培养基(25ml)。利用ProFection哺乳动物转染系统(Promega)用pTGFβ-301LUC(10μg)、pCMVER(1μg)和pRSVβgal(1μg)瞬时共转染细胞。将pTGFβ-301LUC(940μg)、pCMVER(94μg)和pRSVβgal(94μg)Cacl2(5.704ml)和无核酸酶的水(47ml)与2XHEPES(47ml)混合，同时摇晃，制得转染液。所得溶液于室温保温30分钟。将该转染液(3ml)加至各烧瓶中。
细胞与转染液保温过夜后，去除培养基，用无Ca/Mg的磷酸盐缓冲液(10ml，GIBCO)洗每个烧瓶。洗过的细胞用胰蛋白酶处理以分散细胞。用新鲜培养基3ml处理分散的细胞。经离心和除去培养基及胰蛋白酶制得细胞团丸。将细胞重悬于大约20ml培养基中计数。稀释细胞至浓度为5×105细胞/ml。然后，5×104细胞(100μl)加至96孔板的各孔中，细胞培养过夜。
将测试化合物溶解于二甲亚砜，并初步稀释到1∶1000。该稀释过程的完成是通过将2μl药物溶液加至深孔微量滴定板的1000μl培养基中(1∶500稀释)，然后再将100μl稀释的药物溶液加入板中已有的100μl培养基中(1∶2稀释)。对于每一种化合物筛选，如前所述将化合物稀释1∶1000，再进一步稀释1∶100。此外，用8个稀释度的剂量-反应曲线测定最低有效浓度。化合物与细胞在96孔板中保温过夜。
从细胞中除去培养基，用无Ca/Mg的磷酸盐缓冲液(200μl)洗各孔。去掉盐溶液，用60μl裂解液(100mM KPO4、0.2% Triton X-100，1mM DTT pH7.8)裂解细胞。所得溶液用于测定荧光素酶或β-半乳糖苷酶活性。荧光素酶活性测定基本如实施例Ⅵ所述，除了荧光素溶液含有100mg荧光素、9ml 1M N-甘氨酰甘氨酸、36ml 40mM EGTA、720ml 1M DTT、5.4ml 1M MgSO4和310ml水外。这些实验的结果制成表Ⅻ显示
a.“+”表示测试化合物对标准化的荧光素酶活性产生2倍的诱导作用，ED50＜10mMb.“+”表示骨质密度经统计学处理高于去除卵巢的动物还测试了上述化合物维持切除卵巢大鼠中骨质密度的能力。75天龄雌性Sprague Dawley大鼠(重量范围225-275g)得自Charles River Laboratories(Portage，MI)。将其分成3组饲养，并可随意取食(钙含量大约1%)和水。室温维持在22.2℃±1.7℃，最小相对湿度为40%。室内光周期为12小时明亮12小时黑暗。
得到大鼠一周后，在麻醉下[44mg/kg克他命和5mg/kg甲苯噻嗪(Butler，Indianapolis，IN)肌内给药]对大鼠进行双侧卵巢切除术。术后当天动物清醒之后开始用载体或测试化合物进行处理。溶于0.5ml 1%羧甲基纤维素(CMC)中的口服剂量经管饲法施用。手术时及其后的每周称重，以根据改变的体重调整剂量。平行于作为阴性和阳性对照的各实验组评价施用载体或被处理且行卵巢切除术(ovex)大量及未行卵巢切除(完整的)大鼠。
每天对大鼠进行处理，历时35天(6只大鼠/治疗组)，第36天用断头术将其处死。35天的时间周期足以使得骨密度最大程度降低(如本文所测)。切除右侧股骨，在距髌骨沟1mm的远侧干骺端用单光子吸光测定法进行扫描。光密度计检测的结果表示了作为骨质含量指标的骨密度和髋度的计算值。一般说来，行卵巢切除术的大鼠与完整的载体处理对照相比其股骨密度降低约25%这些实验结果示于表Ⅻ。
这些实验结果表明，能有效诱导始自TGFβ-3基因启动子区的雷洛昔芬反应性元件转录的化合物(如雷洛昔芬、156678和171147)也表现出能在行卵巢切除术的大鼠中保持骨密度。
不能诱导雷洛昔芬反应性元件转录的化合物(如088074和309503)也不能对行卵巢切除术动物的骨质密度的丧失表现出统计学意义上的显著保护作用。
应该理解，前面公开的内容着重于本发明的某些具体实施方案，对其作出的所有改良或等价改变都落入如所附权利要求所述的本发明精神或范围之内。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人Yang，Na N(ⅱ)发明题目筛选抗骨质疏松药物的材料和方法(ⅲ)序列数目9(ⅳ)通讯地址(A)收信人Eli Lilly and Company(B)街道Lilly Corporate Center(C)城市Indianapolis(D)州IN(E)国家U.S.A(F)邮政编码46285(ⅴ)计算机可读形式(A)介质类型Diskette-3.50英寸，1.44 Mb储存(B)计算机IBM兼容(C)操作系统MS-DOS
(D)软件PatentIn Release ＃1.0，Version ＃1.25(ⅵ)目前的申请资料(A)申请号US(B)申请日(C)分类号(ⅶ)在先申请资料(A)申请号US 08/081，610(B)申请日June 21，1993(C)分类号435(ⅷ)代理人/代理资料(A)姓名Leeds，James P.
(B)注册号35，241(C)案卷号X-9088A(ⅸ)电讯资料(A)电话317-276-1667(B)电传317-277-1917(2)SEQ ID NO∶1的资料(ⅰ)序列特征(A)长度2205碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)特征
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AGCCTCAGTC TTTGGGATCT GGGGAGGCCG CCTGGTTTTC CTCCCTCCTTCTGCACGTCT 3240GCTGGGGTCT CTTCCTCTCC AGGCCTTGCC GTCCCCCTGG CCTCTCTTCCCAGCTCACAC 3300ATG 3303(2)SEQ ID NO∶4的资料(ⅰ)序列特征(A)长度42碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO∶4GCGCCATATG AGTCTTAACT GCCAAAATT CTTATCATCA AT 42(2)SEQ ID NO∶5的资料(ⅰ)序列特征(A)长度44碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO∶5AAGCAAGCTT TCGCAGCCTC TGCCAGGCAG TGTCCCGACC CGGA 44(2)SEQ ID NO∶6的资料
(ⅰ)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO∶6AGCTTCGCGA CTCGAGA 17(2)SEQ ID NO∶7资料(ⅰ)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO∶7GATCTCTCCA GTCGCGA 17(2)SEQ ID NO∶8资料(ⅰ)序列特征(A)长度35碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA
(xi)序列描述SEQ ID NO∶8TCGAGAAAAG TCAGGTCACA GTGACCTGAT CAAAC 35(2)SEQ ID NO∶9资料(ⅰ)序列特征(A)长度35碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO∶9TCGAGTTTGA TCAGGTCACT GTGACCTGAC TTTTC 3权利要求
1.一种含有从TGFβ基因启动予区分离的雷洛昔芬反应性元件的核酸，其中的人TGFβ基因是TGFβ-2或TGFβ-3。
2.根据权利要求1的核酸，其中核酸的核苷酸序列含有选自下列序列的序列相当于图3和SEQ ID NO∶3中所示的1896到2306的序列，相当于图3和SEQ ID NO∶3中所示的1976到2306的序列，相当于图3和SEQ ID NO∶3中所示的2106到2306的序列，相当于图3和SEQ ID NO∶3中所示的2137到2306的序列，相当于图3和SEQ ID NO∶3中所示的2150到2306的序列，相当于图3和SEQ ID NO∶3中所示的2159到2306的序列，相当于图3和SEQ ID NO∶3中所示的2159到2271的序列;和相当于图3和SEQ ID NO∶3中所示的2159到2231的序列。
3.一种含有根据权利要求1或权利要求2的核酸和报道基因的重组表达构建体。
4.一种用根据权利要求3的重组表达构建体转染的真核细胞。
5.一种筛选多种化合物以鉴别具有作为抗骨质疏松药物能力的化合物的方法，该方法包括识别多种化合物中的某一化合物，它能够诱导从哺乳动物启动子的雷洛昔芬反应性元件开始的转录，它是一种非特异性转录诱导剂，但不能诱导哺乳动物启动子的雌激素反应性元件的转录，并且它是一种抗雌激素或非雌激素化合物，该方法包括下列步骤(a)检测该化合物诱导哺乳动物启动子的雷洛昔芬反应性元件转录的能力;(b)检测该化合物不能从诱导不含雷洛昔芬反应性元件的哺乳动物启动子转录的能力;(c)检测该化合物不能诱导雌激素反应性启动子转录的能力;和(d)在存在雌激素的情况下检测该化合物抑制雌激素诱导的雌激素反应性启动子转录的能力。
6.一种化合物(a)能够诱导TGFβ-3基因启动子区的雷洛昔芬反应性元件的转录;(b)不能诱导没有雷洛昔芬反应性元件的哺乳动物启动子转录;(c)不能诱导雌激素反应性启动子转录;和(d)在存在雌激素的情况下，能抑制雌激素诱导的雌激素反应性启动子的转录;条件是该化合物不是下式的化合物或其可药用的盐 其中n是0、1或2R和R1分别是氢、羟基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-酰氧基、C1-C6-烷氧基-C1-C6-酰氧基、R3取代的芳氧基、R3取代的芳酰氧基、R4取代的羰氧基、氯或溴;R2是选自吡咯烷基、哌啶子基或六亚甲基亚氨基的杂环;R3是C1-C3-烷基、C1-C3-烷氧基、氢或卤素;和R4是C1-C6-烷氧基或芳氧基。
全文摘要
本发明涉及鉴别治疗骨质疏松治疗药物和降低血脂药物的方法。本发明也涉及分离、克隆并使用来自含有称为“雷洛昔芬反应性元件”的新调节元件的转化生长因子β基因启动子区的核酸。本发明还包括含有与报道基因可操作相连的雷洛昔芬反应性元件，以便雷洛昔芬反应性元件调节报道基因转录的真核细胞。本发明还提供鉴别抗骨质疏松药物的方法，所述药物诱导与所述雷洛昔芬反应性元件可操作相连的基因的转录，而不会引起与目前抗骨质疏松治疗方式相关的有害或令人讨厌的副作用。
文档编号C07K14/46GK1102437SQ9410671
公开日1995年5月10日 申请日期1994年6月20日 优先权日1993年6月21日
发明者N·N·杨 申请人:伊莱利利公司