专利名称：用农杆菌介导外源基因转化水稻的方法
技术领域：
本发明属于以根癌农杆菌转化植物的方法，具体地说是涉及一种用诱导性信号分子诱导根癌农杆菌介导外源基因转化水稻的方法。
随着植物基因工程的兴起，运用基因工程技术改变常规育种手段难以奏效的某些经济作物已成为可能。目前应用最广泛而有效的转化系统是以Ti质粒为载体的根癌农杆菌(Agrobaeterium tumefaeiens以下简称农杆菌)介导法。据统计，已有大约23个科的60多种植物获得转基因植株。其中80％的转基因植株是运用农杆菌Ti质粒或Ri质粒为载体转化得到的。但是，农杆菌对于大多数单子叶植物不敏感，特别是水稻等重要禾谷类作物，很难运用农杆菌介导法获得转化植株。有的科学家甚至认为农杆菌介导转化单子叶植物是无效的。因此，如何建立一种高效而简便的转化系统来转化单子叶经济作物已成为当今分子生物学界，特别是植物基因工程技术领域渴望解决的重大课题。
水稻是世界上主要的粮食作物之一，随着世界人口的增长，人类对稻米的需求将不断增大，然而，当今全球性的生态环境恶化和不利的气候条件正侵蚀着稻属种内和种间的遗传多样性，有可能使许多有价值的稻属(种)资源灭绝，给传统的水稻育种工作带来难以解决的问题，这种状况将威胁着水稻生产，导致粮食短缺，尤其是在人口迅猛增长的亚洲地区。所以，如何借助现代基因工程技术建立一种简便而高效的转化系统，以便将优良基因导入栽培水稻，从而培育出优良水稻品种，提高水稻产量，这是目前水稻育种中亟待解决的重要课题。
本发明的目的是建立一种以农杆菌介导外源基因转化水稻的方法，以解决目前水稻育种中所面临的难题。
本发明是在我们发现水稻中存在诱导农杆菌vir区基因表达的信号分子的基础上做出的。在此之前，多数科学家认为单子叶植物之所以难以被农杆菌转化，是因为单子叶植物不能产生使农杆菌趋化运动及诱导vir区基因表达的诱导性信号分子。为了证实单子叶植物中是否存在这种诱导性信号分子，并以此探索一种以农杆菌转化水稻的方法，我们对水稻各个发育时期的代谢物进行提取，以农杆菌vir∷lacZ融合基因系统进行检测和筛选，发现并确定在幼穗分化期至抽穗扬花期的水稻茎叶抽提物中含有二种高效诱导农杆菌vir区基因表达的信号分子。这两种诱导性信号分子与乙酰丁香酮(AS)这一经典的农杆菌诱导物的诱导效果极为相似，而且这两种信号分子对vir区基因的协同诱导效果比AS单独诱导作用要强。经过红外光谱、紫外光谱、质谱、核磁共振、异核多量子相干相关谱、异核多键相关谱等波谱分析，确定这两种诱导性信号分子的化学结构分别为5，7，4′-三羟基-3′，5′-二甲氧基黄酮(5，7，4′-trihydroxy-3′，5′-dimethoxy-flavone，以下简称F1)和5，4′-二羟基-3′，5′-二甲氧基-7-(β-D葡萄糖基)黄酮〔5，4′-dihydroxy-3′，5′-dimethoxy-7-(β-D-glncosyloxy)-flavone，以下简称F2〕，这两种信号分子的化学结构式如下 从上述结构式可看出，信号分子F1和F2具备了Spencer等所分析的高效诱导vir区基因表达的酚类化合物的结构特征(Spencer，P，A，etal.，1990，Phytochemistry，293785-3788)在3′或5′位上含甲氧基，1′位上具极性侧链；侧链上含一个羰基，与苯环隔1～3个碳原子；羰基与苯环间有一个双键；4′位上含羟基。
上述信号分子F1和F2可以从水稻幼穗分化期至抽穗扬花期的茎叶提取得到。具体方法是取该生长期的水稻新鲜茎叶，切碎匀浆，按每公斤加入0.5～6升70～95％的乙醇，搅拌，浸取3～10天，过滤除渣，将滤液浓缩(一般采用减压浓缩，至每公斤水稻茎叶50mL)；还可以将第一次过滤的滤渣再按上述步骤浸取一次，将所得滤液与第一次滤液合并一起浓缩；浓缩液用石油醚∶乙醚＝(0.3∶0.7)～(0.7∶0.3)(体积比)萃取，去萃取液，余液(水相部分)再经乙酸乙酯萃取，去水相部分，取乙酸乙酯相部分过60～200目硅胶柱；然后分别用丙酮∶石油醚＝(15∶85)～(70∶30)(体积比)洗脱得A洗脱液和用丙酮∶石油醚＝(75∶25)～(90∶10)(体积比)洗脱得B洗脱液，将A、B两洗脱液分别经氯仿∶甲醇＝(9∶1)～(5∶5)(体积比)重结晶即得信号分子F1和F2，再经60℃干燥得纯品。
本发明的方法是用含有诱导性信号分子F1、F2和AS的培养液诱导培养携带有外源基因重组质粒的农杆菌，得到诱导菌液，再将该诱导菌液与经致伤处理的水稻幼苗一起在旋转磁场中共培养，即可获得被转化的转基因水稻幼苗。
本发明方法一般包括以下步骤1.将经消毒灭菌处理的水稻种子按常规进行萌发培养；2.用AB诱导培养液悬浮携带有外源基因重组质粒的农杆菌菌体，培养成为AB诱导菌液；通常培养至菌体密度为O.D600nm＝0.45～1.2；AB诱导培养液是在AB培养液中加入诱导性信号分子F1、F2和AS而成；三种信号分子在AB诱导培养液中的浓度分别为F1(0.1～100)μM，F2(0.1～100)μM，AS(0.1～100)μM；
3.将经步骤1萌发培养3～10天的水稻幼苗的叶片及根部表面轻轻划线致伤；4.在N6培养液中加入AB诱导菌液成为共培养液；通常AB诱导菌液的加入量按体积比为0.1～10％；将经步骤3致伤处理的水稻幼苗移入该共培养液中，在旋转磁场中培养5～120小时；5.撤去旋转磁场，用N6培养液置换共培养液，继续培养10～120小时。
将经上述方法培养处理的水稻幼苗按常规方法培育成植株，并根据所用外源基因的表达特征按常规方法检验选择，即可获得已被转化的水稻转基因植株。
本发明方法中所说的旋转磁场可通过一般的磁力搅拌器实现。
以下结合实施例对本发明方法作进一步说明1.将去壳水稻种子(IR72)浸入70％乙醇5～10分钟，转入0.1％HgCl2溶液7分钟，用无菌水洗涤五次，转入水稻萌发培养液中，于24～26℃黑暗中培养3～5天；水稻萌发培养液为在浓度为25％的N6培养液中加入0.75％(g/ml)的蔗糖和0.7％(g/ml)的琼酯；2.将农杆菌BHA101(pBYT2)接种于MG培养基(含50μg/ml抗菌素Hyt)中培养至菌体密度为O.D600nm＝0.9～1.2，离心收集菌体，用AB诱导培养液(含50μg/ml抗菌素Hyt)悬浮菌体，调至O.D600nm为0.40，于24～30℃，50～300rpm培养至菌体密度为O.D600nm＝0.9～1.2，成为AB诱导菌液；所用AB诱导培养液中三种信号分子的浓度分别为F1(1～10)μM，F2(1～10)μM，AS(50～100)μM；3.将经步骤1萌发培养的水稻幼苗浸在无菌N6培养液中，用锋利的刀片在叶片及根部表面轻轻划线致伤；4.将经步骤3致伤处理的水稻幼苗移入新的无菌N6培养液中，按体积比加入1～5％的AB诱导菌液，置于磁力搅拌器-摇床装置上，50～300rpm，24～30℃，黑暗中培养10～50小时；5.撤去磁力搅拌器，倒去共培养液，加入新的无菌N6培养液，于摇床上，50～300rpm，20～30℃，黑暗中继续培养50～100小时；培养过程中每隔24～48小时更换2/3新的无菌N6培养液。
本实施例中采用黑暗条件下培养只是为了防止幼苗叶片变绿，保证后面GDS基因检验的准确性，而与转化效果无关。所说的在磁力搅拌器-摇床装置上培养，即是将磁力搅拌器置于摇床上，再将培养物置于磁力搅拌器上，使培养物处于摇床的旋转振荡及磁力搅拌器的旋转磁场的共同作用之下，以利于促使农杆菌中的外源基因转入水稻幼苗细胞中。
按照上述实施例重复四次试验；同时作平行对照试验，即按该实施例方法，在步骤2中用AB培养液代替AS诱导培养液，得到不经诱导性信号分子处理的AB菌液，在步骤4中用该AS菌液代替AS诱导菌液；分别收集各组试验培养处理后的水稻幼苗，用无菌水洗涤干净，然后通过GUS基因的组织检验，分别统计各组水稻幼苗的瞬时转化率，结果如表1所示。所用检验及统计方法为分别将各组水稻幼苗浸入X-Gluc固定液中，真空抽气10分钟，室温下放置1小时；接着用磷酸缓冲液(0.05M，pH7.0)室温洗涤三次，每次10分钟；然后将水稻幼苗浸入X-Gluc分析液中，37℃水浴16小时，取出水稻幼苗统计显蓝色反应的幼苗数目，按下式计算瞬时转化率瞬时转化率＝(显蓝色反应的幼苗数÷幼苗总数)×100％。
从表1中可看出，经本发明方法上述实施例培养处理的水稻幼苗在X-Gluc分析液中有50％左右呈明显的蓝色反应，重复四次试验，都获得相似结果，说明该方法重复性好；四次试验平均瞬时转化率达51.3％；而不加诱导因子的对照组的水稻幼苗则无一显蓝色反应，转化率为0，说明本发明方法的转化效果是十分显著的。
本发明打破了以往认为农杆菌不能介导转化水稻等单子叶植物的观念，建立了以农杆菌介导转化水稻的方法，而且该方法具有步骤与条件简单、容易操作控制、转化率高等优点，为采用基因工程技术培育优良水稻品种开辟了新的途径。所以本发明对于水稻育种乃至植物基因工程领域都将具有极为深远的意义。
权利要求
1.以农杆菌介导外源基因转化水稻的方法，其特征是用含有诱导性信号分子6，7，4′-三羟基-3′，6′-二甲氧基黄酮(F1)、6，4′-二羟基-3′，5′-二甲氧基-7-(β-D葡萄糖基)黄酮(F2)和乙酰丁香酮(AS)的培养液诱导培养携带有外源基因重组质粒的农杆菌，得到诱导菌液，再将该诱导菌液与经致伤处理的水稻幼苗一起在旋转磁场中共培养，即可获得转基因水稻幼苗。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征是包括以下步骤(1)、将经消毒灭菌处理的水稻种子按常规进行萌发培养；(2)、用AB诱导培养液悬浮携带有外源基因重组质粒的农杆菌菌体，培养成为AB诱导菌液；所说的AB诱导培养液是在AB培养液中加入诱导性信号分子F1、F2和AS而成，该三种信号分子在AB诱导培养液中的浓度分别为0.1～100μM；(3)、将经步骤(1)萌发培养3～10天的水稻幼苗的叶片及根部表面轻轻划线致伤；(4)、在N6培养液中加入AB诱导菌液成为共培养液；将经步骤(3)致伤处理的水稻幼苗移入该共培养液中，在旋转磁场中培养5～120小时；(5)、撤去旋转磁场，用N6培养液置换共培养液，继续培养10～120小时。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征是所说的AB诱导菌液的菌体密度为O.D600nm＝0.45～1.2；所说的共培养液中AB诱导菌液的加入量按体积比为0.1～10％。
4.按照权利要求2或3所述的方法，其特征是其中步骤(4)的培养是在磁力搅拌器-摇床装置上进行。
6.按照权利要求2或3所述的方法，其特征是其中步骤(4)和(5)的培养温度为24～30℃。
全文摘要
本发明涉及一种用农杆菌介导外源基因转化水稻的方法。该方法是以诱导性信号分子5，7，4′-三羟基-3′，5′-二甲氧基黄酮和5，4′-二羟基-3′，5′-二甲基-7-(β-D葡萄糖基)黄酮以及乙酰丁香酮诱导处理携带有外源基因重组质粒的农杆菌，再将其与水稻幼苗共培养，从而获得转基因水稻幼苗。该方法简便而高效，瞬时转化率达50％以上。本发明打破了农杆菌不能转化水稻等单子叶植物的传统观念，为培育优良水稻品种开辟了新的途径。
文档编号C07H17/07GK1135530SQ9511907
公开日1996年11月13日 申请日期1995年12月13日 优先权日1995年12月13日
发明者许东晖, 李宝健 申请人:中山大学