专利名称：生产α-L-天冬氨酰二肽酰胺衍生物的方法
技术领域：
本发明涉及生产α-L-天冬氨酰二肽酰胺类人造甜味剂的方法。
本发明所包括的α-L-天冬氨酰-D-氨基酸-N-(S)-α-烷基苄基酰胺是美国专利5,286,509中所公开的一种人造甜味剂。该专利公开了上述化合物的生产方法，该方法包括利用二环己基碳二亚胺，使L-天冬氨酸中的氨基和β-羧基得到保护的N-苄氧羰基-L-天冬氨酸-β-苄酯与D-氨基酸-N-(S)-α-烷基苄基酰胺缩合，然后通过催化还原脱除苄氧羰基和苄基，即得到目标化合物。该方法在工业生产中需要使用昂贵的二环己基碳二亚胺。此外，目标化合物中会含有少量由二环己基碳二亚胺反应衍生的二环己基脲，从而导致品质下降。
该专利指出N-苄氧羰基-L-天冬氨酸酐或N-甲酰基-L-天冬氨酸酐可以用以前的方法中所提到的化合物来代替，但却没有公开具体的方法或条件。当D-氨基酸酰胺上的氨基进攻天冬氨酸β位羧基的羰基碳时，除目的α-L-天冬氨酰-D-氨基酸氨基衍生物外，还作为副产物而生成β-L-天冬氨酰-D-氨基酸酰胺衍生物。该β副产物也需要去除，因而降低了目的化合物的产率。
本发明的目的是提供一种经济的、不使用昂贵的二环己基碳二亚胺且不生成β副产物的生产α-L-天冬氨酰二肽酰胺衍生物的方法。
本发明研究了制取目的α-L-天冬氨酰二肽酰胺衍生物的方法使式(1)的天冬氨酸衍生物与氯甲酸烷基酯混合生成混合酸酐，与式(2)的氨基酸胺衍生物混合以优良的产率生成被保护的α-L-天冬氨酰二肽酰胺衍生物，然后在酸性条件下将该化合物水解，脱除天冬氨酸上的氨基保护基，并将β-羧酸酯转化成羧酸，
式(1) 其中R1是含有1-4个碳原子的烷基或烷氧基，或含有6-10个碳原子的芳基；R2是含有1-4个碳原子的烷基或含有6-10个碳原子的芳基；R3是含有1-4个碳原子的烷基或苄基；A是质子化的叔胺或二环己胺或碱金属，式(2) 其中R1是含有1-6个碳原子的烷基或含有2-7个碳原子的烷氧甲基；R2是苄基、环己基、环己基甲基、苯基、或其2、3或4位上带有取代基的苯基，所述取代基选自F、Cl、Br、I、羟基、含1-6个碳原子的烷氧基、氰基、硝基乙酰基、氨基、乙酰氨基、在其2，3或3，4位带有亚甲二氧基、三亚甲基、四亚甲基的苯基、或2-、3-或4-吡啶基、或2-或3-呋喃基、或2-或3-噻吩基；含有C*的分子结构在R1是烷基时为(S)或(RS)，在R1是烷氧甲基时为(R)、(S)或(RS)；如果R1是烷基，R2是苄基、环己基、环己基甲基或苯基，则X是D-α-氨基酸残基或DL-α-氨基酸残基，选自D-正亮氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-别异亮氨酸、D-苏氨酸、D-O-甲基苏氨酸、D-别苏氨酸、D-O-甲基别苏氨酸、D-或DL-呋喃基甘氨酸、或含3-6碳原子的环或非环α，α-二烷基氨基酸残基；如果R1是烷基，R2是2、3或4位上带有取代的苯基，所述取代基选自F、Cl、Br、I、羟基、含1-6个碳原子的烷氧基、氰基、硝基、乙酰基、氨基、乙酰氨基、在其2，3或3，4位带有亚甲二氧基、三亚甲基或四亚甲基的苯基、或2-、3-或4-吡啶基、或2-或3-呋喃基、或2-或3-噻吩基，以及R1是烷氧甲基时，则X是D-α-氨基酸残基或DL-α-氨基酸残基，选自D-丙氨酸、D-α-氨基丁酸、D-正缬氨酸、D-缬氨酸、D-正亮氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-别异亮氨酸、D-t-亮氨酸、D-丝氨酸、D-O-甲基丝氨酸、D-苏氨酸、D-O-甲基苏氨酸、D-别苏氨酸、D-O-甲基别苏氨酸、D-苯基甘氨酸、D-或DL-呋喃基甘氨酸、或含3-6个碳原子的环或非环α，α-二烷基氨基酸残基；L-Asp和X是α键合的。
式(1)天冬氨酸衍生物的生产方法是在适当的溶剂中使L-天冬氨酸β-烷基酯与“A”碱和作为氨基保护基的β-二酮或乙酰乙酸酯混合。适当的溶剂可以是水、醇类(如甲醇和乙醇)、醚类(如四氢呋喃和1，4-二噁烷、腈类(如乙腈)、二甲基甲酰胺、二甲亚砜及其他混合溶剂。
L-天冬氨酸β-烷基酯易于用以下方法制取在相应的烷基醇中(H.Schwarz等，J.Am.Chem.Soc.，795697，1957)或含有卤化氢的烷基醇中(D.W.Coleman等，J.Chem.Soc.，1951，2294)，等等，用亚硫酰氯处理L-天冬氨酸。
A代表叔胺，如三乙胺、三丁胺、三辛胺和N-甲基吗啉；具有大取代基和弱亲核性的仲胺，如二环己胺；以及含碱金属的无机碱，如氢氧化钠、氢氧化钾和碳酸钠。特别推荐叔胺，如三丁胺和三辛胺，因为叔胺在下一步骤中具有浆液性质。
氨基保护基包括乙酰乙酸酯，如乙酰乙酸甲酯和乙酰乙酸乙酯；以及β-二酮，如乙酰丙酮和苯甲酰丙酮。
由上述三种物质混合而生成的式(1)天冬氨酸衍生物与反应中将要生成的水共存。质子性溶剂如水和醇对反应有干扰，所以在下一步骤与氯甲酸烷基酯的反应开始之前，需要将这种溶剂以适当方式除去。为蒸馏掉水和醇，可将反应液浓缩。如果它们在反应液中固化，则可用过滤或其他方法从液体中分出固体物。
为了由式(1)化合物和氯甲酸烷基酯生成混合酸酐，可以用非质子性溶剂将(1)化合物溶解或悬浮，然后可以加入氯甲酸烷基酯，得到混合酸酐。
非质子性溶剂包括芳烃，如苯和甲苯；乙酸酯，如乙酸乙酯和乙酸丁酯；酮类，如丙酮和甲乙酮；卤化烃，如二氯甲烷和氯仿；醚类，如四氢呋喃和二噁烷。总的来说，就反应液的液体性质和下一个脱保护过程而言，芳烃和乙酸酯是理想的。
反应最好在低温下进行，以抑制副反应。达到最佳产率的温度是≤5℃，优选≤0℃，理想的是≤-10℃。
式(1)化合物与氯甲酸烷基酯的混合摩尔比是1(等摩尔)较为经济，但是0.6-1.5的摩尔比范围是可接受的。
氯甲酸烷基酯包括氯甲酸甲酯、氯甲酸乙酯、氯甲酸异丁酯及氯甲酸苄酯。
将含有所生成的混合酸酐的反应液与氨基酸衍生物混合，很容易得到式(5)的被保护α-L-天冬氨酰二肽酰胺衍生物。
式(5) 其中R1是含1-4个碳原子的烷基或烷氧基，或含6-10个碳原子的芳基；R2是含1-4个碳原子的烷基或含6-10个碳原子的芳基；R3是含1-4碳原子的烷基或苄基；R4是含1-6个碳原子的烷基或含2-7个碳原子的烷氧甲基；R5是苄基、环己基、环己基甲基和苯基，或其2、3或4位上带有取代基的苯基，所述取代基选自F、Cl、Br、I、羟基、含1-6个碳原子的烷氧基、氰基、硝基、乙酰基、氨基和乙酰氨基、或在其2，3或3，4位带有亚甲二氧基、三亚甲基或四亚甲基的苯基、或2-、3-或4-吡啶基、2-或3-呋喃基、或2-或3-噻吩基。C*的构型在R4是烷基时为(S)或(RS)，在R4是烷氧甲基时为(R)、(S)或(RS)。如果R4是烷基，R5是苄基、环己基、环己基甲基或苯基，则X是D-α-氨基酸残基或DL-α-氨基酸残基，选自D-正亮氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-别异亮氨酸、D-苏氨酸、D-O-甲基苏氨酸、D-别苏氨酸、D-O-甲基别苏氨酸、D-或DL-呋喃基甘氨酸、或含3-6碳原子的环或非环α，α-二烷基氨基酸残基；如果R4是烷基，R5是2、3或4位上带有取代的苯基，所述取代基选自F、Cl、Br、I、羟基、含1-6个碳原子的烷氧基、氰基、硝基、乙酰基、氨基、乙酰氨基、在其2，3或3，4位带有亚甲二氧基、三亚甲基或四亚甲基的苯基、或2-、3-或4-吡啶基、或2-或3-呋喃基、或2-或3-噻吩基，以及R4是烷氧甲基时，则X是D-α-氨基酸残基或DL-α-氨基酸残基，选自D-丙氨酸、D-α-氨基丁酸、D-正缬氨酸、D-缬氨酸、D-正亮氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-别异亮氨酸、D-t-亮氨酸、D-丝氨酸、D-O-甲基丝氨酸、D-苏氨酸、D-O-甲基苏氨酸、D-别苏氨酸、D-O-甲基别苏氨酸、D-苯基甘氨酸、D-或DL-呋喃基甘氨酸、或含3-6个碳原子的环或非环α，α-二烷基氨基酸残基；L-Asp和X是α键合的。
如美国专利5286509所公开，从N-苄氧羰基或N-叔丁氧羰基氨基酸衍生物上脱除保护基，就能够制取本发明的氨基酸酰胺衍生物。也可以利用初始由式(3)氨基酸衍生物的混合酸酐得到的有机层来制取，即使其与式(4)的胺衍生物缩合，然后使其与酸性水溶液接触，得到含有氨基酸酰胺衍生物的水溶液，再用有机溶剂在碱性条件下萃取。
式(3) 其中R1是含1-4个碳原子的烷基或烷氧基，或含6-10个碳原子的芳基；R2是含1-4个碳原子的烷基或含6-10个碳原子的芳基；X是D-α-氨基酸残基或DL-α-氨基酸残基，选自D-丙氨酸、D-α-氨基丁酸、D-正缬氨酸、D-缬氨酸、D-正亮氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-别异亮氨酸、D-t-亮氨酸、D-丝氨酸、D-O-甲基丝氨酸、D-苏氨酸、D-O-甲基苏氨酸、D-别苏氨酸、D-O-甲基别苏氨酸或D-苯基甘氨酸、D-或DL-呋喃基甘氨酸、或含3-6个碳原子的环或非环α，α-二烷基氨基酸残基。
A代表质子化的叔胺、二环己胺或碱金属，式(4) 其中R1是含有1-6个碳原子的烷基或含有2-7个碳原子的烷氧甲基；R2是苄基、环己基、环己基甲基、苯基、或其2、3或4位上带有取代基的苯基，所述取代基选自F、Cl、Br、I、羟基、含1-6个碳原子的烷氧基、氰基、硝基、乙酰基、氨基、乙酰氨基、或在其2，3或3，4位带有亚甲二氧基、三亚甲基、四亚甲基的苯基、或2-、3-或4-吡啶基、或2-或3-呋喃基、或2-或3-噻吩基；C*的构型在R1是烷基时为(S)或(RS)，在R1是烷氧甲基时为(R)、(S)或(RS)。
在该方法中，混合酸酐反应和缩合反应的条件仍与前述相同式(4)胺衍生物与氨基酸衍生物的缩合及缩合化合物与天冬氨酸组分的混合都采用相同的原料(如氯甲酸烷基酯和叔胺)和温度。这意味着该方法在工业上特别有利，因为共同使用相同的贮罐和反应器。
在所得的混合物中存在被保护的α-L-天冬氨酰二肽酰胺衍生物。通过脱除保护基而得到目的α-L-天冬氨酰二肽酰胺衍生物的方法如下在反应混合物中加入无机酸溶液如稀盐酸，使在室温下处于酸性条件下30分钟至数小时。这样可以很容易地脱除氨基保护基，生成式(6)的α-L-天冬氨酰二肽酰胺β-烷基酯。如果使用不易溶解式(5)化合物的溶剂，则该物质可以以晶体或固体形式存在。在这种情况下，进行固/液分离操作如过滤，得到固体物，再向其中加入稀盐酸即得到相应于式(6)的物质，式(6) 其中R1是含1-4个碳原子的烷基或苄基；R2是含1-6个碳原子的烷基或含2-7个碳原子的烷氧甲基；R3是苄基、环己基甲基、苯基、或其2、3或4位上带有取代基的苯基，所述取代基选自F、Cl、Br、I、羟基、含1-6个碳原子的烷氧基、氰基、硝基、乙酰基、氨基、乙酰氨基、在其2，3或3，4位带有亚甲二氧基、三亚甲基或四亚甲基的苯基、或2-、3-或4-吡啶基、或2-或3-呋喃基、或2-或3-噻吩基；C*的构型在R2是烷基时为(S)或(RS)，在R2是烷氧甲基时为(R)、(S)或(RS)。如果R2是烷基，R3是苄基、环己基、环己基甲基或苯基，则X是D-α-氨基酸残基或DL-α-氨基酸残基，选自D-正亮氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-别异亮氨酸、D-苏氨酸、D-O-甲基苏氨酸、D-别苏氨酸、D-O-甲基别苏氨酸、D-或DL-呋喃基甘氨酸、或含3-6碳原子的环或非环α，α-二烷基氨基酸残基；如果R2是烷基，R3是2、3或4位上带有取代的苯基，所述取代基选自F、Cl、Br、I、羟基、含1-6个碳原子的烷氧基、氰基、硝基、乙酰基、氨基、乙酰氨基、或在其2，3或3，4位带有亚甲二氧基、三亚甲基或四亚甲基的苯基、或2-、3-或4-吡啶基、2-或3-呋喃基、或2-或3-噻吩基，以及R2是烷氧甲基时，则X是D-α-氨基酸残基或DL-α-氨基酸残基，选自D-丙氨酸、D-α-氨基丁酸、D-正缬氨酸、D-缬氨酸、D-正亮氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-别异亮氨酸、D-t-亮氨酸、D-丝氨酸、D-O-甲基丝氨酸、D-苏氨酸、D-O-甲基苏氨酸、D-别苏氨酸、D-O-甲基别苏氨酸、D-苯基甘氨酸、D-或DL-呋喃基甘氨酸、或含3-6个碳原子的环或非环α，α-二烷基氨基酸残基；L-Asp和X是α键合的。
式(6)的物质在酸性条件下水解，将天冬氨酸中的β-酯转化为羧酸，并生成目的α-L-天冬氨酰二肽酰胺衍生物。该反应需要比简单脱除氨基保护基剧烈的反应条件。所需的酸浓度为1N至6N盐酸，温度为室温至80℃。反应时间在30分至24小时之间，从而使酯水解但却不裂解目的物质的酰胺键。例如，可以把较高的酸浓度与相对较低的温度和较短的时间相组合。
如果β位上是苄基酯，则该酯基可通过催化还原来脱除。从酸溶液中脱除氨基保护基，然后加入催化剂如钯/碳，同时在氢气氛下搅拌即可转化成羧酸。过滤除去催化剂后再将混合物中和，即得到目的α-L-天冬氨酰二肽酰胺衍生物。
氨基保护基的脱除和酯的水解可以同时进行。优选的是，如果使用易水解的溶剂如乙酸乙酯，可通过浓缩或过滤从反应液中分离出式(5)化合物。所得的式(5)化合物可置于酯水解条件下，以同时脱除氨基保护基。如果使用不易水解的溶剂如甲苯，则可将缩合反应液置于水解条件下。
所得的含有α-L-天冬氨酰二肽酰胺衍生物的酸溶液可以用碱如氢氧化钠进行中和，然后可通过浓缩或冷却来控制结晶过程，从而得到结晶形式的目的α-L-天冬氨酰二肽酰胺衍生物。
以下实施例将详细叙述本发明。HPLC条件如下柱InertsilODS-2，6φ×150mm；洗脱剂0.1M KH2PO4(pH3.0)/MeCN＝80/20(V/V)；流速1ml/分；温度室温；检测紫外(210nm)。
实施例1在20ml甲醇中加入1.27g(6.90mmol)L-天冬氨酸β-甲酯盐酸盐、0.80g(6.9mmol)乙酰乙酸甲酯、4.88g(13.8mmol)三辛胺(溶液I)。使溶液I回流3小时，然后减压浓缩。在残余物(浆状)中加入27ml乙酸乙酯，搅拌下冷却到-10℃以下，加入10ml含有0.66ml(6.9mmol)氯甲酸乙酯的乙酸乙酯溶液，同时保持反应液的温度为-11℃至-12℃。20分钟后，在反应液中加入15ml含有1.37g(5.85mmol)D-缬氨酸-N-(S)-α-乙基苄基酰胺的乙酸乙酯溶液，同时保持温度为-13℃至-17℃。使反应混合物温热至室温，加入20ml 1NHCl，并在室温下搅拌1小时。待溶液分层后，乙酸乙酯层用稀盐酸萃取两次。收集水层进行HPLC分析，测出1.81g(4.97mmol)α-L-天冬氨酰-D-缬氨酸-N-(S)-α-乙基苄基酰胺甲酯。产率为85.0％。
浓缩水层，在残余物中加入12ml 2NHCl，并在60℃下维持5小时。水解液进行HPLC分析，测出1.55g(4.45mmol)α-L-天冬氨酰-D-缬氨酸-N-(S)-α-乙基苄基酰胺。产率为89.4％。
用25％NaOH将水解液pH调至pH6，所得浆状液在5℃下搅拌过液，并减压过滤。所得的α-L-天冬氨酰-D-缬氨酸-N-(S)-α-乙基苄基酰胺晶体用少量水冲洗，并减压干燥，得量为1.42g。结晶收率为91.4％。
实施例2
在50ml甲醇中加入5.85g(50.0mmo1)D-缬氨酸、5.81g(50.0mmol)乙酰乙酸甲酯和9.05g(50.0mmol)二环己胺(溶液II)。将溶液II加热回流3小时，并减压浓缩。在残余物中加入165ml乙酸乙酯和0.48g(4.7mmol)N-甲基吗啉，冷却下进行搅拌，加入60ml含有6.18ml(4.72mmol)氯甲酸异丁酯的乙酸乙酯溶液，同时保持温度为-17℃至-20℃。20分钟后，再在混合物中加入100ml含有5.42g(40.1mmol)(S)-α-乙基苄胺的乙酸乙酯溶液，同时保持温度不变。使反应混合物温热至室温，然后过滤除去沉淀的二环己胺盐酸盐晶体，在滤液中加入100ml 1NHCl。混合物在室温下搅拌90分钟，分层。水层用1N NaOH调至pH11，用约200ml乙酸乙酯萃取。所得的226ml乙酸乙酯层中含有6.63g(28.3mmol)D-缬氨酸-N-(S)-α-乙基苄基酰胺。产率为70.5％。
在30ml甲醇中加入3.06g(16.7mmol)L-天冬氨酸甲酯盐酸盐、2.25g(19.4mmol)乙酰乙酸甲酯和6.51g(35.9mmol)二环己胺，然后加热回流3小时，减压浓缩反应混合物。在残余物中加入乙酸乙酯并进行过滤，以除去沉淀的二环己胺盐酸盐。浓缩滤液得到8.38g浆状残余物。在残余物中加入50ml乙酸乙酯和0.85g(8.4mmol)N-甲基吗啉。如上所述冷却所得混合物，并加入含有2.17ml(16.7mmol)氯甲酸异丁酯的乙酸乙酯溶液。20分钟后，加入由120ml乙酸乙酯层制备的约35ml浓缩物(含15mmol D-缬氨酸-N-(S)-α-乙基苄基酰胺)。将温度提高到室温，减压过滤得到沉积的晶体。晶体用100ml 0.5NHCl在室温下水解2小时，然后过滤除去沉淀的二环己胺盐酸盐，滤液进行HPLC分析，测出3.60g(9.91mmol，产率66.0％)α-L-天冬氨酰-D-缬氨酸-N-(S)-α-乙基苄基酰胺β-甲酯和0.116g(0.332mmol，产率2.2％)α-L-天冬氨酰-D-缬氨酸-N-(S)-α-乙基苄基酰胺。母液与稀盐酸混合并分层，得到的水层进行HPLC分析，测出0.545g(1.50mmol，产率10.0％)α-L-天冬氨酸-D-缬氨酸-N-(S)-α-乙基苄基酰胺甲酯和26mg(0.073mmol；产率0.5％)α-L-天冬氨酰-D-缬氨酸-N-(S)-α-乙基苄基酰胺。缩合反应总产率为78.7％。将上述两个水解液合并并浓缩，在残余物中加入200ml 2N HCl并保持在60℃下4小时，然后测出3.58g(10.26mmol，产率86.9％)α-L-天冬氨酰-D-缬氨酸-N-(S)-α-乙基苄基酰胺。
实施例3在40ml甲醇中加入1.84g(10.0mmol)L-天冬氨酸β-甲酯盐酸盐、1.00g(10.0mmol)乙酰丙酮和3.63g(20.0mmol)二环己胺(溶液III)。溶液III加热回流3小时并减压浓缩。在所得的浆状残余物中加入50ml乙酸乙酯，冷却到-10℃并搅拌。加入11ml含有0.96ml(10mmol)氯甲酸乙酯的乙酸乙酯溶液，同时保持反应液温度为-11℃至-12℃。20分钟后，加入45ml含有1.91g(9.27mmol)D-α-氨基丁酸-N-(S)-α-甲基苄基酰胺的乙酸乙酯溶液，同时保持反应液温度为-13℃至-17℃。使溶液温热至室温，然后过滤除去二环己胺盐酸盐并浓缩滤液。在残余物中加入乙腈和40ml 2N HCl，于60℃下加热4小时。所得溶液进行HPLC分析，测出1.79g(5.58mmol)α-L-天冬氨酰-D-α-氨基丁酸、N-(S)-α-甲基苄基酰胺。产率为60.6％。
实施例4在30ml甲醇中加入1.02g(5.00mmol)L-天冬氨酸β-苄酯、0.63ml(5.0mmol)乙酰乙酸乙酯和0.909g(5.00mmol)二环己胺(溶液IV)。溶液IV在室温下搅拌过夜并减压浓缩。在残余物中加入22ml乙酸乙酯和0.3ml三乙胺，搅拌混合物，同时冷却到-10℃以下。加入7ml含有0.47ml(4.94mmol)氯甲酸乙酯的乙酸乙酯溶液，同时保持反应液温度为-20±5℃。30分钟后，在反应液中加入由34ml实施例2的乙酸乙酯层制得的约6ml浓缩物(含有4.22mmol D-缬氨酸-N-(S)-α-乙基苄基酰胺)，同时保持温度为-20±3℃。使混合物温热至室温，然后过滤除去二环己胺盐酸盐，在滤液中加入11ml 1N HCl，混合物在室温下搅拌1小时并浓缩。在浆状残余物中加入40ml乙酸，然后加入0.36g 10％Pd/C，混合物于氢气气氛下搅拌3天进行催化还原。除去催化剂后，母液进行HPLC分析，测出0.592g(1.70mmol)α-L-天冬氨酰-D-缬氨酸-N-(S)-α-乙基苄基酰胺。产率为40.2％。
实施例5在13ml甲醇中加入1.52g(130mmol)D-缬氨酸、1.51g(13.0mmol)乙酰乙酸甲酯、2.36g(13.0mmol)二环己胺，该溶液加热回流3小时并减压浓缩。在残余物中加入45ml乙酸乙酯和0.13g(1.3mmol)N-甲基吗啉，搅拌并冷却(溶液V)。在溶液V中加入15ml含有1.71ml(13.0mmol)氯甲酸异丁酯的乙酸乙酯溶液，同时保持温度为-15℃至-17℃。20分钟后，加入25ml含有1.59g(10.5mmol)(R)-α-甲氧甲基苄胺的乙酸乙酯溶液，同时保持温度不变。使该溶液升温至室温，然后过滤除去沉淀的二环己胺盐酸盐。在滤液中加入25ml 1N HCl，然后将溶液于室温下搅拌90分钟使其分层。所得的水层用1N NaOH调至pH11，混合物用约50ml乙酸乙酯萃取。所得的乙酸乙酯层用无水硫酸镁干燥，混合物过滤后减压浓缩滤液，然后干燥，得到2.16g(8.63mmol)浅黄色透明浆状的D-缬氨酸-N-(R)-α-甲氧甲基苄基酰胺。产率为82.2％。
在18ml甲醇中加入1.84g(10.0mmol)L-天冬氨酸β-甲酯盐酸盐、1.16g(10.0mmol)乙酰乙酸甲酯和3.63g(20.0mmol)二环己胺，然后将该混合物加热回流3小时并减压浓缩。在残余物中加入乙酸乙酯，然后过滤除去沉淀的二环己胺盐酸盐。浓缩滤液得到4.74g浆状残余物。在残余物中加入30ml乙酸乙酯和0.51g(5.0mmol)N-甲基吗啉，并如上所述进行冷却，加入含有1.31ml(10.0mmol)氯甲酸异丁酯的乙酸乙酯溶液。20分钟后，在混合物中加入将2.13g(8.52mmol)D-缬氨酸-N-(R)-α-甲氧甲基苄基酰胺溶于20ml乙酸乙酯中制得的溶液。使该溶液温热至室温，并减压浓缩蒸出乙酸乙酯。在残余物中加入乙腈和200ml2N HCl，并于60℃加热20小时。对该溶液进行HPLC分析，测出2.49g(6.81mmol)α-L-天冬氨酰-D-缬氨酸-N-(R)-α-甲氧甲基苄基酰胺。产率为79.9％。
水解液用25％NaOH调至pH6并减压浓缩，将所得浆液冷却并减压过滤。所得的α-L-天冬氨酰-D-缬氨酸-N-(R)-α-甲氧甲基苄基酰胺晶体用少量水、乙酸乙酯和氯仿冲洗，并减压干燥。得量为2.00g。结晶收率为80.3％。
实施例6在25ml甲醇中加入1.47g(8.0mmol)L-天冬氨酸甲酯盐酸盐、0.93g(8.0mmol)乙酰乙酸甲酯和5.66g(16.0mmol)三辛胺(溶液VI)。溶液VI加热回流3小时并减压浓缩。在所得浆状残余物中加入30ml乙酸乙酯，搅拌下冷却至-10℃。在该混合物中加入15ml含有0.77ml(8.0mmol)氯甲酸乙酯的乙酸乙酯溶液，同时保持温度为-11℃至-12℃。20分钟后，加入20ml含有1.79g(6.78mmol)D-缬氨酸-N-(R)-α-乙氧甲基苄基酰胺的乙酸乙酯溶液，同时保持温度为-13℃至-17℃。使溶液温热至室温，在反应液中加入25ml 1N HCl，溶液在室温下搅拌1小时。分层后，乙酸乙酯层用稀盐酸溶液萃取两次。浓缩水层，在残余物中加入15ml 2N HCl，混合物于60℃下加热8小时。水解液进行HPLC分析，测出2.25g(5.94mmol)α-L-天冬氨酰-D-缬氨酸-N-(R)-α-乙氧甲基苄基酰胺。产率为87.6％。
水解液用25％NaOH调至pH6，所得浆液于5℃下搅拌过夜，然后减压过滤。所得的α-L-天冬氨酰-D-缬氨酸-N-(R)-α-乙氧甲基苄基酰胺晶体用少量水冲洗，并减压干燥。得量为2.01g。结晶收率为89.4％。
实施例7在40ml甲醇中加入1.84g(10.0mmol)L-天冬氨酸β-甲酯盐酸盐、1.00g(10.0mmol)乙酰丙酮和3.63g(20.0mmol)二环己胺(溶液VII)。将溶液VII加热回流3小时并减压浓缩。在所得浆状残余物中加入50ml乙酸乙酯，并在搅拌下冷却至-10℃。加入15ml含有0.96ml(10.0mmol)氯甲酸乙酯的乙酸乙酯溶液，同时保持温度为-11℃至-12℃。20分钟后，在反应液中加入40ml含有2.15g(9.11mmol)D-α-氨基丁酸-N-(R)-α-甲氧甲基苄基酰胺的乙酸乙酯溶液，同时保持温度为-13℃至-17℃。将溶液温度提高到室温，将混合物过滤除去二环己胺盐酸盐。浓缩滤液，在残余物中加入乙腈和40ml 2N HCl，混合物于60℃下加热5小时。对溶液进行HPLC分析，测得2.16g(6.16mmol)α-L-天冬氨酰-D-α-氨基丁酸－N-(R)-α-甲氧甲基苄基酰胺。产率为67.6％。
实施例8在50ml甲醇中加入2.04g(10.0mmol)L-天冬氨酸β-苄基酯、1.26ml(10.0mmol)乙酰乙酸乙酯和1.82g(10.0mmol)二环己胺(溶液VIII)。溶液VIII在室温下搅拌过夜，并减压浓缩。在所得残余物中加入50ml乙酸乙酯和0.6ml三乙胺，将溶液在搅拌下冷却至-10℃，加入15ml含有0.95ml(10.0mmol)氯甲酸乙酯的乙酸乙酯溶液，同时保持温度为-13℃至-17℃。30分钟后，在溶液中加入15ml含有2.38g(9.51mmol)D-缬氨酸-N-(R)-α-甲氧甲基苄基酰胺的乙酸乙酯溶液，同时保持温度为-13℃至-17℃。将溶液温度提高到室温，将混合物过滤，在滤液中加入25ml 1N HCl，混合物于室温下搅拌1小时并浓缩。在浆状残余物中加入80ml乙酸乙酯，加入0.75g 10％Pd-C，混合物于氢气气氛下搅拌3天进行催化还原。过滤除去催化剂后的母液进行HPLC分析，测出1.83g(5.01mmol)α-L-天冬氨酰-D-缬氨酸-N-(R)-α-甲氧苄基酰胺。产率为52.7％。
实施例9在17ml甲醇中加入2.00g(19.4mmol)D-α-氨基丁酸、2.25g(19.4mmol)乙酰乙酸甲酯和3.52g(19.4mmol)二环己胺，加热回流3小时，并将混合物减压浓缩。加入60ml乙酸乙酯和0.20g(1.9mmol)N-甲基吗啉，将混合物于冷却下搅拌(溶液IX)。在溶液IX中加入20ml含有2.55ml(19.4mmol)氯甲酸异丁酯的乙酸乙酯溶液，同时保持温度为-15℃至-17℃。20分钟后，在同样温度下加入30ml含有2.37g(15.7mmol)(S)-α-乙基对羟基苄胺的乙酸乙酯溶液。使溶液温热至室温并过滤。于室温下向滤液中加入30ml 1N HCl，并搅拌90分钟，然后分层。所得的水层用1N NaOH调至pH11，然后用约70ml乙酸乙酯萃取。所得的乙酸乙酯层用无水硫酸镁干燥，然后过滤，滤液减压浓缩并干燥。测出2.72g(11.5mmol)浅黄色透明浆状D-α-氨基丁酸-N-(S)-α-乙基对羟基苄基酰胺。产率为73.2％。
在25ml甲醇中加入2.74g(14.9mmol)L-天冬氨酸β-甲酯盐酸盐、1.73g(14.9mmol)乙酰乙酸甲酯和5.41g(29.8mmol)二环己胺，该混合物加热回流3小时并减压浓缩。在所得残余物中加入乙酸乙酯，并将混合物过滤。浓缩滤液后得到浆状残留物。加入45ml乙酸乙酯和0.75g(7.5mmol)N-甲基吗啉，并如上所述进行冷却，加入含有1.96ml(14.9mmol)氯甲酸异丁酯的乙酸乙酯溶液。20分钟后，在混合物中加入将2.67g(11.3mmol)D-α-氨基丁酸-N-(S)-α-乙基对羟基苄基酰胺溶于30ml乙酸乙酯中得到的溶液。使该溶液温热至室温，减压浓缩该溶液，蒸出乙酸乙酯。在残余物中加入乙腈和200ml 2N HCl，并于60℃下加热10小时。对溶液进行HPLC分析，测出2.94g(8.37mmol)α-L-天冬氨酰-D-α-氨基丁酸-N-(S)-α-乙基对羟基苄基酰胺。产率为74.1％。水解液用25％NaOH调至pH6并减压浓缩。所得浆液用冰冷却并减压过滤。所得的α-L-天冬氨酰-D-α-氨基丁酸-N-(S)-α-乙基对羟基苄基酰胺晶体用少量水、乙酸乙酯和氯仿冲洗，然后减压干燥。得量为2.43g。结晶收率为82.7％。
实施例10在25ml甲醇中加入1.47g(8.00mmol)L-天冬氨酸β-甲酯盐酸盐、0.93g(8.0mmol)乙酰乙酸甲酯和5.66g(16.0mmol)三辛胺，并加热回流3小时(溶液X)，将溶液X减压浓缩。在所得的浆状残余物中加入30ml乙酸乙酯，并在搅拌下冷却至-10℃或其以下。在反应混合物中加入15ml含有0.77ml(8.0mmol)氯甲酸乙酯的乙酸乙酯溶液，同时保持温度为-11℃至-12℃。20分钟后，加入20ml含有D-缬氨酸-N-(S)-α-乙基对羟基苄基酰胺的乙酸乙酯溶液，同时保持温度为-13℃至-17℃。使溶液温热至室温，向溶液中加入25ml 1N HCl，并在室温下搅拌1小时。溶液分层后，乙酸乙酯层用稀盐酸萃取两次。浓缩水层，残余物中加入15ml 2N HCl，并在60℃下加热5小时。对水解液进行HPLC分析，测得1.70g(4.66mmol)α-L-天冬氨酰-D-缬氨酸-N-(S)-α-乙基对羟基苄基酰胺。产率为69.9％。
水解液用25％NaOH调至pH6，所得浆液在5℃下搅拌过夜并减压过滤。所得的α-L-天冬氨酰-D-缬氨酸-N-(S)-α-乙基对羟基苄基酰胺晶体用少量水冲洗，减压干燥。得量为1.51g。结晶收率为88.8％。
实施例11在17ml甲醇中加入2.00g(17.1mmol)D-缬氨酸、1.98g(17.1mmol)乙酰乙酸甲酯、3.10g(17.1mmol)二环己胺，并加热回流3小时(溶液XI)，将溶液XI减压浓缩。在所得残余物中加入60ml乙酸乙酯、0.17g(1.7mmol)N-甲基吗啉，并在搅拌下冷却。在混合物中加入20ml含有2.24ml(17.1mmol)氯甲酸异丁酯的乙酸乙酯溶液，同时保持温度为-15℃至-17℃。20分钟后，在混合物中加入30ml含有2.34g(13.8mmol)(S)-α-乙基对氯苄胺的乙酸乙酯溶液。使溶液温热至室温并过滤。在滤液中加入30ml 1N HCl，并将溶液于室温下搅拌90分钟，然后分层。所得的水层用1N NaOH调至pH11，并用约60ml乙酸乙酯萃取。所得的乙酸乙酯层用无水硫镁酸干燥，并过滤除去硫酸镁。滤液减压浓缩并干燥，测得3.14g(11.7mmol)浅黄色透明浆状D-缬氨酸-N-(S)-α-乙基对氯苄基酰胺。产率为84.8％。
在25ml甲醇中加入2.41g(13.1mmol)L-天冬氨酸β-甲酯盐酸盐、1.52g(13.1mmol)乙酰乙酸甲酯和4.75g(26.2mmol)二环己胺，加热回流3小时，然后减压浓缩。在所得残余物中加入乙酸乙酯，然后过滤混合物。滤液浓缩后得到浆状残余物。在残余物中加入40ml乙酸乙酯和0.66g(6.6mmol)N-甲基吗啉，并如上所述进行冷却，然后加入1.72ml(13.1mmol)氯甲酸异丁酯。20分钟后，在混合物中加入将3.01g(11.2mmol)D-缬氨酸-N-(S)-α-乙基对氯苄基酰胺溶于25ml乙酸乙酯中制得的溶液。使所得溶液温热至室温，将反应液减压浓缩蒸出乙酸乙酯。残余物中加入乙腈和200ml 2N HCl，并在60℃下加热9小时。对溶液进行HPLC分析，并测得3.44g(8.98mmol)α-L-天冬氨酰-D-缬氨酸-N-(S)-α-乙基对氯苄基酰胺。产率为80.2％。
水解液用25％NaOH调至pH6并减压浓缩，所得浆液用冰冷却并减压过滤。所得的α-L-天冬氨酰-D-缬氨酸-N-(S)-α-乙基对氯苄基酰胺晶体用少量水、乙酸乙酯和氯仿冲洗，然后减压干燥。得量为2.95g。结晶收率为85.8％。
实施例12在17ml甲醇中加入2.00g(19.4mmol)D-α-氨基丁酸、2.25g(19.4mmol)乙酰乙酸甲酯和3.52g(19.4mmol)二环己胺(溶液XII)，将溶液XII加热回流3小时并减压浓缩。在所得残余物中加入60ml乙酸乙酯和0.20g(1.9mmol)N-甲基吗啉，搅拌下冷却，在反应液中加入20ml含有2.55ml(19.4mmol)氯甲酸异丁酯的乙酸乙酯溶液，同时保持温度为-15℃至-17℃。20分钟后，在溶液中加入30ml含有2.71g(16.2mmol)(R)-α-甲氧甲基对羟基苄胺的乙酸乙酯溶液，同时保持温度不变。使溶液温热至室温并过滤。在滤液中加入30ml 1N HCl，并在室温下搅拌90分钟。水层用1N NaOH调至pH11，并用约70ml乙酸乙酯萃取。所得的乙酸乙酯层用无水硫酸镁干燥，滤掉硫酸镁，滤液减压浓缩，测得3.08g(12.2mmol)浅黄色透明浆状的D-α-氨基丁酸-N-(R)-α-甲氧甲基对羟基苄基酰胺。产率为75.3％。
在25ml甲醇中加入2.74g(14.9mmol)L-天冬氨酸β-甲酯盐酸盐、1.73g(14.9mmol)乙酰乙酸甲酯和5.41g(29.8mmol)二环己胺，加热回流3小时，然后减压浓缩。在所得残余物中加入乙酸乙酯，然后将该混合物过滤。浓缩滤液得到浆状残余物。在残余物中加入45ml乙酸乙酯和0.75g(7.5mmol)N-甲基吗啉，如上所述冷却溶液，加入含有1.96ml(14.9mmol)氯甲酸异丁酯的乙酸乙酯溶液。20分钟后，在混合物中加入将2.98g(11.8mmol)所述D-α-氨基丁酸-N-(R)-α-甲氧甲基对羟基苄基酰胺溶于30ml乙酸乙酯中制得的溶液。使溶液温热至室温，反应液减压浓缩，蒸出乙酸乙酯。在溶液中加入一些乙腈和200ml 2NHCl，并于60℃下加热6小时。对所得混合物进行HPLC分析，测得3.38g(9.19mmol)α-L-天冬氨酰-D-α-氨基丁酸N-(R)-α-甲氧甲基对羟基苄基酰胺。产率为77.9％。该水解液用25％NaOH调至pH6并减压浓缩。所得浆液减压下用冰冷却。所得的α-L-天冬氨酰-D-氨基丁酸-N-(R)-α-甲氧甲基对羟基苄基酰胺用少量水、乙酸乙酯和氯仿冲洗，并减压干燥。产率为3.03g。结晶收率为89.6％。
实施例13在25ml甲醇中加入1.50g(8.17mmol)L-天冬氨酸β-甲酯盐酸盐、0.95g(8.2mmol)乙酰乙酸甲酯和5.78g(16.3mmol)三辛胺(溶液XIII)，将溶液XIII加热回流3小时并减压浓缩。在浆状残余物中加入30ml乙酸乙酯，并在搅拌下冷却到-10℃，在混合物中加入15ml含有0.79ml(8.2mmol)氯甲酸乙酯的乙酸乙酯溶液，同时保持温度为-11℃至-12℃。20分钟后，加入20ml含有1.84g(6.92mmol)D-缬氨酸-N-(R)-α-甲氧甲基对羟基苄基酰胺的乙酸乙酯溶液，同时保持温度为-13℃至-17℃。使混合物温热至室温，在反应液中加入25ml 1N HCl，并在室温下搅拌1小时。溶液分层后乙酸乙酯层用稀盐酸萃取两次。水层浓缩后在所得残余物中加入15ml 2N HCl，并于60℃下加热5小时。对水解液进行HPLC分析，测得1.92g(5.02mmol)α-L-天冬氨酰-D-缬氨酸-N-(R)-α-甲氧甲基对羟基苄基酰胺。产率为72.5％。
水解液用25％NaOH调至pH6，所得浆液在5℃下搅拌过夜，然后减压过滤。所得的α-L-天冬氨酰-D-缬氨酸-N-(R)-α-甲氧甲基对羟基苄基酰胺晶体用少量水冲洗并减压干燥。得量为1.45g。结晶收率为75.5％。
本发明涉及用经济的保护基、活化剂和不生成β-肽副产物的简便方法来生产α-L-天冬氨酰二肽酰胺衍生物。本发明可用于生产甜味剂化合物，即美国专利5,286,509的α-L-天冬氨酰-D-氨基酸-N-(S)-α-烷基苄基酰胺、日本专利申请42818/1995的天冬氨酰二肽衍生物、以及日本专利申请144844/1995的天冬氨酰二肽酰胺衍生物。
权利要求
1.一种生产α-L-天冬氨酰二肽酰胺衍生物的方法，该方法包括使式(1)的L-天冬氨酸衍生物与氯甲酸烷基酯和式(2)的氨基酸酰胺衍生物混合，并在酸性条件下进行水解式(1) 其中R1是含有1-4个碳原子的烷基或烷氧基，或含有6-10个碳原子的芳基；R2是含有1-4个碳原子的烷基或含有6-10个碳原子的芳基；R3是含有1-4个碳原子的烷基或苄基；A是质子化的叔胺、二环己胺或碱金属；式(2) 其中R1是含有1-6个碳原子的烷基或含有2-7个碳原子的烷氧甲基；R2是苄基、环己基、环己基甲基、苯基、或其2、3或4位上带有取代基的苯基，所述取代基选自F、Cl、Br、I、羟基、含1-6个碳原子的烷氧基、氰基、硝基、乙酰基、氨基、乙酰氨基、在其2，3或3，4位带有亚甲二氧基、三亚甲基或四亚甲基的苯基、或2-、3-或4-吡啶基、或2-或3-呋喃基、或2-或3-噻吩基；C*的构型在R1是烷基时为(S)或(RS)，在R1是烷氧甲基时为(R)、(S)或(RS)；如果R1是烷基，R2是苄基、环己基、环己基甲基或苯基，则X是D-α-氨基酸残基或DL-α-氨基酸残基，选自D-正亮氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-别异亮氨酸、D-苏氨酸、D-O-甲基苏氨酸、D-别苏氨酸、D-O-甲基别苏氨酸、D-或DL-呋喃基甘氨酸、或含3-6碳原子的环或非环α，α-二烷基氨基酸残基；如果1)R1是烷基，R2是2、3或4位上带有取代的苯基，所述取代基选自F、Cl、Br、I、羟基、含1-6个碳原子的烷氧基、氰基、硝基、乙酰基、氨基、乙酰氨基、在其2，3或3，4位带有亚甲二氧基、三亚甲基或四亚甲基的苯基、或2-、3-或4-吡啶基、或2-或3-呋喃基、或2-或3-噻吩基，或2)R1是烷氧甲基时，则X是D-α-氨基酸残基或DL-α-氨基酸残基，选自D-丙氨酸、D-α-氨基丁酸、D-正缬氨酸、D-缬氨酸、D-正亮氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-别异亮氨酸、D-t-亮氨酸、D-丝氨酸、D-O-甲基丝氨酸、D-苏氨酸、D-O-甲基苏氨酸、D-别苏氨酸、D-O-甲基别苏氨酸、D-苯基甘氨酸、D-或DL-呋喃基甘氨酸、或含3-6个碳原子的环或非环α，α-二烷基氨基酸残基；L-Asp和X是α键合的。
2.权利要求1的方法，其中氨基酸酰胺衍生物是在由以下方法得到的有机层中使式(3)的氨基酸衍生物与氯甲酸烷基酯混合，使该化合物与式(4)的胺衍生物混合，与酸性水溶液接触得到含有氨基酸酰胺衍生物的水溶液，并用有机溶剂在碱性条件下萃取，式(3) 其中R1是含1-4个碳原子的烷基或烷氧基，或含6-10个碳原子的芳基；R2是含1-4个碳原子的烷基或含6-10个碳原子的芳基；X是D-α-氨基酸残基或DL-α-氨基酸残基，选自D-丙氨酸、D-α-氨基丁酸、D-正缬氨酸、D-缬氨酸、D-正亮氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-别异亮氨酸、D-t-亮氨酸、D-丝氨酸、D-O-甲基丝氨酸、D-苏氨酸、D-O-甲基苏氨酸、D-别苏氨酸、D-O-甲基别苏氨酸或D-苯基甘氨酸、D-或DL-呋喃基甘氨酸、或含3-6个碳原子的环或非环α，α-二烷基氨基酸残基；A代表质子化的叔胺、二环己胺或碱金属；式(4) 其中R1是含有1-6个碳原子的烷基或含有2-7个碳原子的烷氧甲基；R2是苄基、环己基、环己基甲基、苯基、或其2、3或4位上带有取代基的苯基，所述取代基选自F、Cl、Br、I、羟基、含1-6个碳原子的烷氧基、氰基、硝基、乙酰基、氨基、乙酰氨基、或在其2，3或3，4位带有亚甲二氧基、三亚甲基、四亚甲基的苯基、或2-、3-或4-吡啶基、或2-或3-呋喃基、或2-或3-噻吩基；C*的构型在R1是烷基时为(S)或(RS)，在R1是烷氧甲基时为(R)、(S)或(RS)。
全文摘要
本发明提供用于生产α-L-天冬氨酰二肽酰胺衍生物的方法。用乙酰乙酸酯或β-二酮保护L-天冬氨酸β-烷基酯的氨基。用氯甲酸烷基酯将所得化合物转化为混合酸酐，与氨基酸酰胺衍生物缩合后在酸性条件下水解，使氨基保护基脱保护并将酯部分转化为羧酸，从而得到目的α-L-天冬氨酰二肽酰胺衍生物。
文档编号C07K5/075GK1131160SQ9512063
公开日1996年9月18日 申请日期1995年12月28日 优先权日1994年12月28日
发明者土屋丰人, 竹本正, 中村良一郎, 网野裕右, 杉山直子 申请人:味之素株式会社