专利名称：：用作病原体抑制剂的分支寡核苷酸的制作方法
技术领域：
：本发明涉及对病原体具有抑制作用的合成寡核苷酸。更具体地，本发明涉及较已知寡核苷酸具有更好抑制特性的抗病原体的合成寡核苷酸。使用合成寡核苷酸作为抗感染剂最近已发展成为一个颇具希望的领域。Agrawal的“生物技术的趋势”((TrendsinBiotechnology)10152-158,1992)综述了反义寡核苷酸用作抗病毒剂的发展。现在，合成寡核苷酸不仅在作为抗病毒剂方面，而且在作为其它病原体的抑制剂方面均显示出相当好的前景。Rapaport等的“美国全国科学院学报”(Proc.Natl.Acad，Sci.USA898577-8580，1992)报道了硫代磷酸寡核苷酸抗恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)的抗疟活性。由于合成寡核苷酸作为抗感染剂的巨大希望，很多研究致力于提高这类化合物的药理特性。很多这样的研究包括向寡核苷酸中引入修饰的核苷间键，从而提高对溶核降解作用的抗性和生物稳定性。Agrawal等的“美国全国科学院学报”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA857079-7083，1988)报道，硫代磷酸寡脱氧核苷酸和寡脱氧核苷酸氨基磷酸酯能抑制人类免疫缺陷病毒(MIV)的增殖。Sarin等的“美国全国科学院学报”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA857448-7451，1988)披露了寡脱氧核苷酸甲基膦酸酯对HIV具有抑制作用。Padmapriga的“生物有机和医药化学通讯”(Bioorganic&MedicinalChemistryLetters3761-764，1993)报道了具有新的甲基硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸。Goodchild和Zamecnik(美国专利第4,806,463号)公开了抑制HTLV-III复制和蛋白质表达的反义寡苷酸。这些寡核苷酸是针对HTLV-III基因组的高度保守区域的。它们针对的位点包括a)rRNAlys引物结合位点，b)rRNAlys引物结合位点5′端附近的HTLV-III基因组区域，c)tRNAlys引物结合位点和rRNAlys引物结合点5′端附近的HTLV-III基因组区域，d)mRNA剪接供体，e)mRNA剪接受体，f)gag基因的起始密码子，g)env基因的起始密码子，h)tat基因的起始密码子，i)sor基因的起始密码子，j)3′orf基因的起始密码子，k)HTLV-III基因组加帽核苷酸，l)art基因及其部分序列，m)HTLV-III基因组编码grameshift的区域。其它修饰，不一定仅指使用修饰的磷酸二酯核苷酸间键，还包括在寡核苷酸3′未端引入化学封闭结构。Temsamani等的“纽约科学院年鉴”(AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences，660318-320，1992)报道具有3′-帽子的硫代磷酸寡核苷酸的体内药物动力学和生物稳定性超过没有帽子的硫代磷酸寡核苷酸。Tang等的“核酸研究”(NucleicAcidRes.212729，1993)报道具有3′未端发夹结构的寡核苷酸的生物稳定性较好。Koga等的“有机化学杂志”(J.Org.Chem.563757-3759，1991)报道，具有交替(3′→3′)未端(5′→5′)的核苷酸间磷酸二酯键的交替α，β-寡聚胸苷酸对核酸酶的抗性提高了。Seliger等的“核苷和核苷酸”(Nucleosides&Nacleotides10469-477，1991)和Ortigao等的“反义研究和发展”(AntisenseResearch&Development2129-146，1992)报道具有单一未端3′→3′和5′→5′键倒位的寡脱氧核苷酸对溶核降解作用的抗性提高了。合成具有至少一个3′→3′核苷间键的寡核苷酸的方法可包括使用允许5′→3′合成的修饰核苷单体，或使用接头，采用可市购的5′氨基膦酸酯核苷单体，由上述接头进行双向3′→5′合成，获得具有3′→3′和5′→5′键的寡核苷酸。CLONTECHniques(1993年4月)报道使用可市购的分支接头合成了具有单个3′→3′核苷间键的寡核苷酸。Horne和Dervan的“美国化学学会会刊”(J.Am.Chem.Soc.1122435-2437，1990)、Luebke和Dervan的“核酸研究”(NucleicAcidRes.203005-3009，1992)和vandeSande等的“科学”(Science，241551-557，1988)报道以类似方法合成了具有单个3′→3′键的寡核苷酸，以研究交替链三螺旋的形成或平行链DNA。然而，使用合成寡核苷酸有效地进行抗感染治疗存在着一些潜在的问题，这些问题是由作用对象的性质引起的，而不是由寡核苷酸引起的，因而不能通过提高寡核苷酸的生物稳定性得到解决。问题之一是感染体可能通过靶序列的突变，降低寡核苷酸与靶序列的反应能力，从而逃脱寡核苷酸介导的治疗。例如，Lisziewicz等的“美国全国科学院学报”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA8911209-11213，1992)报道一种剪接受体的反义寡核苷酸开始能抑制MOLT-3感染细胞中的HIV，但25天后，观察到有病毒突破抑制。这一报道提示用互补于不同靶序列的寡核苷酸进行联合或分批治疗，可能有助于避免病毒突破抑制。有必要找到提高抑制病原体的合成寡核苷酸的生物稳定性的其它方法。也有必要找到避免病原体的突变引起的突破抑制的新途径。理想的情况是得到能同时解决上述两个问题的寡核苷酸。本发明涉及到对病原体具有抑制作用的合成寡核苷酸。本发明提供的抗病原体的合成寡核苷酸，较已知的寡核苷酸具有更好的抑制特性。本发明针对HIV或流感病毒的分支寡核苷酸较通常的寡核苷酸更为有效。本发明的寡核苷酸具有更好的抑制特性是由这些寡核苷酸的初级结构特征所决定的，它们是由两个或两个以上的寡核苷酸序列相互连接而成，所说的寡核苷酸序列与一个或多个病原体的一个或多个必需基因互补。一方面，本发明提供了由两个或两个以上相同的寡核苷酸序列相互连接而成的寡核苷酸，其中，每一寡核苷酸序列都与病原体的同一靶序列互补。靶序列为病原体增殖所必需的基因或调控序列的部分序列。根据本发明的这一方面，相同的寡核苷酸序列可以5′→3′构型或3′→3′构型相互连接。采用后一构型的寡核苷酸对溶核降解作用具有高度的抗性。另一方面，本发明提供了由两个或两个以上不同的寡核苷酸序列相互连接而成的寡核苷酸，其中，每一寡核苷酸序列与同一病原体的不同靶序列互补。所述不同的寡核苷酸序列可与同一基因或调控序列的不同部分互补，或与不同的基因和/或调控序列互补。此处的寡核苷酸降低了病原体通过突变逃脱该寡核苷酸抑制作用的机率。不同的寡核苷酸序列可以5′→3′或3′→3′构型相互连接，采用后一构型大大提高了对溶核降解作用的抗性。第三方面，本发明提供了由两个或两个以上不同的寡核苷酸序列相互连接而成的寡核苷酸，其中，一个或几个寡核苷酸序列与一种病原体的一段靶序列互补，一个或几个寡核苷酸序列与另一种病原体的一个基因或调控序列互补。此处的寡核苷酸可对包括两种不同病原体的感染进行联合治疗。不同寡核苷酸序列可以5′→3′或3′→3′构型相互连接。采用后一构型大大提高了对溶核降解作用的抗性。第四方面，本发明提供了由两个或两个以上不同的寡核苷酸序列相互连接而成的寡核苷酸，其中，一个或几个寡核苷酸序列与病原体的一个菌株的一个基因或调控序列互补，一个或几个寡核苷酸序列与同一病原体的另一菌株的一个基因或调控序列互补。此外的寡核苷酸的优点在于可有效地抑制病原体的两个或两个以上菌株，因而该寡核苷酸甚至在病原体的特定菌株被发现之前就可作为其抑制剂。本领域的技术人员可以知道本发明的几个方面可以集中在一种寡核苷酸上，从而提供一种对治疗特定疾病有更好特性的寡核苷酸。他们也会认识到如果本发明前三个方面的相同或不同的寡核苷酸序列具有3′末端核糖核苷酸，那么相同或不同的寡核苷酸也可通过5′→3′、5′→2′、2′→3′、3′→2′或3′→3″键连接。本发明的一个目的是提供抗病原体的寡核苷酸，它们能减少或消除突变引起的病原体逃脱这种寡核苷酸的抑制作用。本发明的另一个目的是提供能同时抑制一种以上病原体的抗病原体寡核苷酸，尤其是在自然条件下，这些病原体通常共同感染宿主机体的情况下。上文仅仅总结了本发明的某些方面，无意、也绝不应理解为是以任何方式对本发明进行限定。此处引用的所有专利和出版物这里把其全文引为参考。图1显示5′-氨基磷酸酯(phosphoramidites)和5′-连接于CPG的核苷的一般合成路线。图2显示一种3′→3′连接的寡核苷酸的实例，其中X例如可为硫或氧。图3显示用蛇毒磷酸二酯酶处理过的寡核苷酸的A260/时间曲线。图4显示用蛇毒磷酸二酯酶消化寡核苷酸3(PO)和4(PO)的结果。图5显示大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶和T4DNA聚合酶的3′-核酸外切活性(前者也具有一定的5′-核酸外切活性)消化5′-32P末端标记的寡核苷酸3(PO)和4(PO)的结果。图6显示在37℃温度下有10％的牛胎血清存在时，消化寡核苷酸3(PO)和4(PO)的结果。图7显示用牛胎血清处理寡核苷酸1(PS)和4(PS)的结果。图8显示RNaseH切割寡核苷酸双螺旋的结果。图9A和9B显示用本发明的寡核苷酸处理HIV感染的细胞的结果。本发明涉及对病原体具有抑制作用的合成寡核苷酸。本发明提供对病原体具有更好的抑制特性的抗病原体的合成寡核苷酸。本发明的针对HIV或流感病毒的分支寡核苷酸较通常的反义寡核苷酸更为有效。本发明的几个实施方案中寡核苷酸具有更好的抑制特性，是由于寡核苷酸通过5′→3′、5-′2′或优选的3′→3′、3′→2′或2′→3′寡核苷酸间键相互连接产生的。当寡核苷酸通过5′→3′键相互连接时，该寡核苷酸的序列不与任何天然的环状核酸连接。一方面，本发明提供了由两个或两个以上相同的寡核苷酸序列相互连接而成的寡核苷酸。本发明此处所说的寡核苷酸中，相同的寡核苷酸序列均与病原体的同一靶核苷酸序列互补。靶序列为病原体致病效应必需基因或调控序列的部分序列。此处所说的寡核苷酸对病原体的致病效应的抑制作用较通常的寡核苷酸要强。另一方面，本发明提供了由两个或两个以上不同寡核苷酸序列相互连接而成的寡核苷酸。在此处所说的寡核苷酸中，不同的寡核苷酸序列与同一病原体的靶核苷酸序列互补。这些不同的靶序列可以是同一基因或调控序列中的不同位点，或是不同的基因和/或调控序列。这些寡核苷酸的优点在于能够消除病原体的突变引起的逃脱该寡核苷酸对它的抑制作用。当使用的抗病原体寡核苷酸只与单一靶核苷酸序列互补时，病原体有可能通过该苷核苷酸序列的突变，使所述寡核苷酸不能与该靶核苷酸序列杂交，从而逃脱所述寡核苷酸的抑制作用。当使用的寡核苷酸具有与两个不同的靶序列互补的寡核苷酸序列时，这种逃脱的可能性就大大降低了，因为多位点同时发生突变的频率是单位点突变频率的乘积。与同时或分批使用互补于不同靶核苷酸序列的寡核苷酸相比，此处的寡核苷酸具有以下优点首先，使用较为简单，因为只需要合成和使用一种化合物。这种化合物的优点也体现在，当这种寡核苷酸作人用或兽用时，为管理需要易于进行质量控制且颁发许可较为简单。第三方面，本发明又提供了由两个或两个以上不同寡核苷酸序列相互连接而成的寡核苷酸。然而，此处所说的寡核苷酸中，不同的寡核苷酸序列与不同病原体的靶核苷酸序列互补。这些靶核苷酸序列为每一病原体的致病效应必需基因或调控序列的部分序列。此处的寡核苷酸的优点在于合成和使用一种化合物，就可抑制两种可能共同感染宿主的不同病原体的致病效应，两种病原体共同感染宿主常见于人类免疫缺陷病毒(HIV)和巨细胞病毒、流感病毒、卡氏肺囊虫(Pneumocystiscarnii)或结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的共同感染。在组织培养研究中另外一个例子是任何待研究的病毒和污染的支原体，常使研究结果复杂化。第四方面，本发明还提供了含有两个或两个以上不同核苷酸序列的寡核苷酸。然而，此处的寡核苷酸中，不同的寡核苷酸序列与同一病原体的不同菌株或等位基因的靶核苷酸序列互补。这些靶核酸序列可以是该病原体的致病效应必需基因或调控序列的相同或不同部分。此处的寡核苷酸的优点在于合成和使用一种化合物，即可抑制一种病原体的致病效应，而无需知道该病原体的哪一种菌株或等位基因影响了该宿主。根据本发明的各个方面对寡核苷酸采用下述名称。“寡核苷酸序列”包括有选择地具有额外的核糖核苷酸、2′-取代的核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸单体的寡核苷酸，它们均可通过5′→3′键连接，所述键可以是本领域中已知的任何核苷酸间键。优选这些寡核苷酸有选择地包括磷酸二酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基醚、乙酰胺、氨基甲酸酯、硫醚、桥连氨基磷酸酯、桥连亚甲基磷酸酯、桥连硫代磷酸酯和/或砜核苷酸间键。含上述任何核苷酸间键的寡核苷酸的合成为本领域技术人员熟知，例如，可参考Uhlmann和Peyman的文章“化学综述”(ChemicalReviews90543-584，1990)和Schneider和Banner的文章“四面体通讯”(TetrahedronLett.31335，1990)。优选本发明的寡核苷酸的寡核苷酸序列以总共含有大约6-100个单体，最优选大约8-50个单体。这些修饰的寡核苷酸也可选择性地包括修饰的核酸碱基和/或糖、以及附加的取代基，如二元胺、胆甾烯基或其它亲脂基团。术语“互补”指能够与细胞内的靶核苷酸序列形成杂合体的充分互补。在实际工作中，这种充分互补可通过测定使用该寡核苷酸是否能抑制靶核苷酸序列的功能来进行验证。“病原体”包括能够感染人、其它动物或细胞的病毒、细菌和真核生物，也包括由于其正常或异常表达，使得人、植物或动物疾病恶化或加重的天然或突变基因。优选病原体包括、但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病冒、乙肝病毒、水痘-带状疱疹病毒、口蹄疫病毒、黄热病病毒、巨细胞病毒、结核分枝杆菌、卡氏肺囊虫、疟原虫、ras和B2癌基因、人淀粉样蛋白前体(APP)基因、人血管内皮生长因子基因、人多重药物抗性(mdr)基因。“抗病原体寡核苷酸”是指与该病原体致病效应必需基因或调控序列的部分序列互补的寡核苷酸。“连接”或“相互连接”指直接或通过中间化学组分共价连结，所述共价连接结包括一个寡核苷酸序列的5′末端和另一寡核苷酸序列的3′或2′末端的连结，或一个寡核苷酸序列的3′或2′末端和另一寡核苷酸序列的3′或2′末端的连结。“两个或两上以上”指2到大约6个。此处，“PO”指具有磷酸二酯核苷酸间键的寡核苷酸，“PS”指具有硫代磷酸酯核苷酸间键的寡核苷酸。对本发明的各个方面来说，两个或两个以上寡核苷酸序列可通过5′→3′、5′→2′、3′→3′、2′→2′、3′→2′或2′→3′键相互连接。许多核苷酸能够掺入本发明的分支寡核苷酸，这在本领域中是已知的。例如，这类寡核苷酸包括、但不限于上文提到的Goodchild和Zamecnik的美国专利第4,806,463号公开的寡核苷酸。当寡核苷酸通过3′→3′、2′→2′、3′→2′或2′→3′键相互连接时，它们就对外切核酸的降解作用具有高度的抗性。它们可以通过任何已知的核苷酸间键相互连接。或者也可以通过一些其它的化学取代基相互连接，这些取代基包括、但不限于环糊精、醚和醚键、冠醚和甘油。优选这种键为共价键，但具有非常高的解离常数的非共价键，如抗生物素蛋白-生物素键和环糊精金刚烷，也是可以接受的。本发明的寡核苷酸可用于体内和体外的多种目的。这种寡核苷酸可用于体内治疗由病原体的作用引起的人、植物或动物疾病。此处，病原体指本发明所定义的病原体。这些寡核苷酸得到FDA的上市许可，也可用作药物。本发明的寡核苷酸也具有多种体外用途。它们可用于抑制组织培养细胞系中病原体的作用。根据本发明的第二方面的寡核苷酸可用于研究某一病原体中不同基因的相对突变率。根据本发明的第三方面的寡核苷酸可用于研究不同病原体的基因的相对突变率。根据本发明的第四方面的寡核苷酸可用于研究同一病原体不同菌株的基因的相对突变率。最后，根据本发明的所有方面，对核酸酶具有最强抗性的寡核苷酸可作为研究在某些条件下病原体基因表达的探针，在这些条件下普通寡核苷酸会被降解。以下实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施方案，而绝不是要对发明进行限制。实施例实施例15_氨基磷酸酯和5′-连接于CPG的核苷的合成如图1所示，5′→3′合成寡核苷酸所需的5′-氨基磷酸酯F和5′-连接于CPG支持物上的核苷G，由3′-DMT核苷E制得。而3′-DMT核苷是由4′-O-乙酰丙基碱保护的核苷A合成，后者根据标准方法制备(例如，参见Kumar和Poonian，“有机化学杂志”(J.Org，Chem494905-4912，1984)。合成步骤如下(i)采用t-丁基二甲基甲硅烷基氯进行5′-羟基的甲基硅烷化(见上文Kumar和Poonian)；(ii)用肼除去乙酰丙基(见上文Kamar和Poonian)；(iii)用二对甲氧三苯甲基(DMT)氯保护(酸不稳定的)3′-羟基(Smitb等“美国化学学会会刊”(J.Am.Chem.Soc.84430，1962))；(iv)用1M氟化回丁铵进行5′位去甲基硅烷化(见上文，Kumar和Poonian)；(v)用氯(2-氰乙基)-N，N-二异丙基氨基亚磷酸酯进行5′位亚磷酸化(Sinha等，“核酸研究”(Nucl.AcidsRes.124539-4557，1984)；或(vi))通过与琥珀-酰化的LCAA-CPG缩合，将5′位连接于CPG支持物上(Damha等“核酸研究”(Nucl.AcidRes.)183813-3821，1990)。5′-氨基磷酸酯和5′-连接于CPG的核苷最近已可向GlenResearch(Sterling.VA)商购。实施例2寡核苷酸的合成寡核苷酸的合成是采用β氰乙基氨基磷酸酯在标准条件下于自动合成仪(Millipore8700，Bedford，MA)上进行，合成规模为1μmol。对含有硫代磷酸酯核苷酸间键的寡核苷酸来说，碘氧化步骤被3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮-1，1-二氧化物的氧化步骤所代替。含3′→3′核苷酸间键的寡核苷酸的合成分两部分进行。第一种序列的合成，采用5′-氨基磷酸酯和5′-连接于CPG支持物上的3′-DMTr-核苷、沿5′→3′方向进行。第一种序列合成后，将单体转换成3′-氨基磷酸酯，第二种序列的合成以通常的3′→5′方向进行。图2显示了一个由3′→3′键连结两个序列形成的较大的寡核苷酸的一个四体部分。随机序列是采用随机方式在合成仪上合成，合成时由每一单体瓶中取一份氨基磷酸酯，产生各个位置的混合物。合成结束后，所得寡核苷酸用浓缩氨在55℃下作用16小时去保护。寡核苷酸粗品以反向色谱(C18)进行纯化、20体的色谱梯度为由100mM乙酸铵配制的0-50％乙腈，时间为45分钟以上，40体的色谱梯度为0-40％乙腈。除去三苯甲游基之后，寡核苷酸对水透析并冻干。寡核苷酸的纯度通过聚丙烯酰胺凝胶电泳来确定。本发明中合成和使用的寡核苷酸于表I中列出。序列I与HIV核酸gag区的一段序列互补，序列3与HIV核酸tat区的一段序列互补。表1</tables>+PO＝磷酸二酯连接的寡核苷酸PS＝硫代磷酸酯连接的寡核苷酸*N＝每一序列中的核苷酸数目20＝具有随机序列的20体寡核苷酸Y＝5′T-T-3’；Z＝5′T-T-5’实施例3寡核苷酸的核酸酶抗性分析为了利用增色现象研究寡核苷酸磷酸二酯的消化速度，将0.2个A260单位的寡核苷酸溶于0.5ml缓冲液(10mMTrisHCl，pH8.310mMMgCl2)中，在一热控紫外分光光度计的测量室内使其温度达到37℃。加入蛇毒磷酸二酯酶(SVPD)(5μl，1μg，1.5U/mg)，不同时间测其A260结果示于图3中。消化寡核苷酸序列5的t1/2为～200秒，而消化寡核苷酸序列7达1800秒尚未达到其t1/2。因而不含自由3′末端的寡核苷酸序列7，对SVPD的3′-外切核酸消化活性，比寡核苷酸序列5稳定得多。图4中再现了这一结果，讨论见下文，结果显示15分钟后，寡核苷酸序列5的90％为SVPD所消化，而寡核苷酸序列7保持原样。SVPD对寡核苷酸的消化也通过以下方法监测将5′-32P标记的寡核苷酸(100ng)于37℃下保温，终体积为20μl，含50mM乙酸钠(pH4.5)、1mM乙酸锌、250mMNaCl、0.05mg/mlBSA和2μlSVPD(100ng)。在0、2、5和15分钟取样(5μl)，并加入20μl含有染料的80％甲酰胺加样缓冲液中，样品在15％聚丙烯酰胺凝胶(8.3M尿素)上进行分析，随后在-80℃下放射自显影，结果见图4。这些结果证实，3′→3′连接的寡核苷酸对核酸酶降解的抗性较普通寡核苷酸强得多。为试验这些结果能否推广于更严酷的条件，采用更高的核酸酶活性消化所述寡核苷酸。为研究3′→3′连接的寡核苷酸对DNA聚合酶I和T4DNA聚合酶的3′-外切核酸活性的抗性，将5′-32P标记的寡核苷酸(150ng)在37℃下保温，终体积为20μl，含有50mMTrisHCl、pH8.0、5mMMgCl2、5mMDTT、0.05mg/mlBSA和大肠杆菌DAN聚合酶I(2.5μl；0.22U，1.5U/μg)或T4DNA聚合酶(3.3μl，0.22U，1.5U/mg)。在0、30、60和120分钟分别取样(4μl)，并加入8μl含有染料的80％甲酰胺加样缓冲液中，在15％聚丙烯酰胺凝胺(8.3M尿素)上进行分析，随后在-80℃下放射自显影，结果示于图5。寡核苷酸序列5在30分钟内被消化成单核苷酸，而寡核苷酸序列7在120分钟后完好无损。这些结果证实，3′→3′连接的寡核苷酸即使对高核酸酶活性也具有很高的抗性。为试验这些结果能否能推广于哺乳动物中存在的核酸，酶活性条件，将所述寡核苷酸与牛胎血清一起保温。寡核苷酸对牛胎血清的稳定性可通过如下方法确定将5′-32p标记的寡核苷酸(100ng)与含10％牛胎血清的100μl基质一起在37℃下保温。在0、1、3和6小时分别取样(10μl)。通过加入5μl蛋白酶k、10μl缓冲液(20mMTrisHCl，pH7.8，10mMNaCl，10mMEDTA，0.5％SDS)、37℃下保温30分钟，终止反应。样品随后用苯酚/氯仿抽提，用乙醇沉淀，并在15％聚丙烯酰胺凝胶(8.3M尿素)上进行分析，随后在-80℃下放射自显影，结果示于图6。寡核苷酸序列5在6小时内被充分消化，而3′→3′连接的寡核苷酸序列7则稳定得多，在6小时后，大部分完好无损。对3′→3′连接的硫代磷酸酯寡核苷酸序列8对牛胎血清的稳定性也进行了研究，并将其与含寡核苷酸序列8的半数序列的寡核苷酸序列2的稳定性进行了比较(图7)。具有自由3′末端的寡核苷酸序列2，在1小时后开始降解，24小时后被充分降解，不含自由3′末端的寡核苷酸序列8则稳定得多，24小时后完好如初。这些结果与聚合酶I和T4DNA聚合酶试验所得结果类似，它们证实3′→3′连接的寡核苷酸对哺乳动物血清中的外切核酸活性具有高度抗性。实施例4双螺旋的稳定性对3′→3′连接的寡核钳酸与互补于其一个序列的DNA或RNA形成的双螺旋的解链温度进行了测定。首先，0.2个A280单位的寡核苷酸和0.1个A280单位的其互补核酸在500ml缓冲液(10mMNa2HP04，pH7.4，100mMNaCl)中退火，退火时先加热至85℃，然后慢慢冷却至25℃。混合物随后以1℃/分钟的速度再次加热至85℃，并连续记录A260。解链温度于表2中列出。表2互序核酸序列号DNATm(℃)RNATm(℃)1gag64.3gag70.32gag54.2gag62.43tat57.2tat51.04tat48.9tat42.67gag62.9gag70.3tat55.7tat49.48gag53.1gag61.6tat47.8tat40.0对含磷酸二酯(序列7)或硫代磷酸酯(序列8)键的3′→3′连接的寡核苷酸与互补链的解链温度进行了测定，这些互补链包括gagDNA(25体)、gagRNA(39体)、tatDNA(24体)或tatRNA(28体)，并将上述解链温度与3′→5′连接的寡核苷酸序列5和序列6的相应解链温度进行了比较。连接的寡核苷酸序列5-8的解链温度也与寡核苷酸序列1-4中的每一序列与其互补链的解链温度进行了比较。寡核苷酸序列1-4、7和8与互补DNA和RNA的解链温度于表2中列出。寡核苷酸序列1和2与互补DNA和RNA的解链温度均高于寡核苷酸序列3和4的相应解链温度，因为寡核苷酸序列1和2中的G+C含量较高。通常，PS寡核苷酸的解链温度较PO寡核苷酸的解链温度低8-10℃。3′→3′连接的寡核苷酸序列7和8与互补DNA和RNA形成的双螺旋的解链温度，较寡核苷酸序列1-4分别与互补核酸形成的双螺旋的解链温度平均要低约2℃。寡核苷酸序列6和7与互补DNA和RNA的解链温度与寡核苷酸序列7和12的相应解链温度相同(数据未列出)。实施例5RNaseH裂解3′→3′连接的寡核苷酸与其互补靶序列(RNA)的结合也由RNaseH裂解试验得以证实。为进行研究，合成了寡核苷酸52体(序列17)，它含有gag和tat寡核苷酸的互补序列。5′-32P标记的gag-tatRNA(序列17)(1pmol)分别与寡核苷酸序列1和序列3以及序列5和7的混合物(5pmol)混合，混合液体积为10ml，含20mMTrisHCl(pH7.4)、10mMMgCl2、10mMKCl、0.1mMDTT和5％的甘油。加入RNaseH(Promega，404)，总体积调整为30ml。移出7ml，加入RNaseH(Promega，0.4U)，37℃保温。在0.5、2和5分钟取样(7ml)，加入10ml含染料的甲酰胺加样缓冲液，并在15％聚丙烯酰胺凝胶(含8.3M尿素)上进行分析，随后在-80℃下放射自显影(图8)。与此类似，32p标记的52体RNA(序列17)也与寡核苷酸序列5混合物(5pmol)一起保温，该混合物含有互补于gag位点(序列18)或tat位点(序列19)的寡脱氧核苷酸(20pmol)。通过RNaseH裂解证实了3′→3′连接的寡核苷酸与互补RNA的结合(图8)。52体gag-tagRNA含有与3′→3链接的寡核苷酸序列8的两个序列都互补的区域，该RNA被用来确定3′→3′连接的寡核苷酸的两个序列是否同时与该互补RNA结合。首先，确定了在寡核苷酸序列2(A道)和寡核苷酸序列4(B道)存在时，RNaseH在52体gag-tatRNA上的特异裂解位点。裂解位点在图8中用箭头标出。在寡核苷酸序列2存在时，裂解产物为10-15体，而在寡核苷酸序列4存在时，裂解产物为44-46体，在不存在互补寡核苷酸时，未见RNaseH裂解52体gag-tatRNA(序列17)(数据未列出)。在3′→3′连接的寡核苷酸序列8存在时，RNaseH在gag位点和tat位点，同时裂解gag-tagRNA(序列17)(C道)，这表明3′→3′连接的寡核苷酸(序列8)的两个序列同时与互补RNA结合。3′→3′连接的寡核苷酸序列8的两个序列均能结合互补RNA，并同时引导RNaseH裂解的事实由以下结果可得到进一步证实当3′→3′连接的寡核苷酸序列8的一个序列与互补DNA预先退火进行封闭后，RNaseH主要在另一位点裂解52体gag-tatRNA(序列17)(D道和E道)。实施例6寡核苷酸对HIV的抑制寡核苷酸的抗HIV活性采用CD4+T细胞系MOLT-3进行了研究，该细胞培养于RPMI1640培养基/13％牛胎血清/2％谷氨酰胺/抗生素中。细胞(5×105个分离细胞)被培养2小时，用不同浓度的寡核苷酸清洗和处理。4天后收集培养物上清液。活细胞通过染料排除计数，稀释成每ml含5×105个细胞，培养物用寡核苷酸再次处理。病毒复制通过p24膜表达(免疫荧光分析)进行监视，培养物上清液中以p24ELISA(DuPont)监视。上述步骤每周重复两次。其结果示于图9A(0.05μM寡核苷酸)和9B(0.1μM寡核苷酸)中。tat、gag和随机序列在第7天的活性免强能够检测或不具活性。相反，连接的寡核苷酸在第7天的活性仍相当明显。序列表(1)一般信息(i)申请人Meschwitz，SusanM.Agrawal，Suhdir(ii)发明名称用作病原体抑制剂的分支寡核苷酸(iii)序列数16(iv)通信地址(A)收件人MichaelS.Greenfield(B)街道10S.WackerDriveSuite3000(C)城市芝加哥(D)州依利诺斯(E)国家美国(F)邮编60606(v)计算机可读形式(A)媒介物类型软盘(B)计算机IBMPC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件DOS5.1WordPerfect(vi)本申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类号(viii)律师/代理人信息(A)姓名Greenfield，MichaelS.(B)登记号37,142(C)文件/档案号93,743(ix)电信信息(A)电话(312)715-1000(B)电传(312)715-1234(2)序列1信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)种类核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线状(iii)是否假设否(iv)是否反义是CTCGCACCCATCTCTCTCCT20(2)序列2信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)种类核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线状(iii)是否假设否(iv)是否反义是(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置1..20(D)其它信息/注释＝“均为硫代磷酸酯核苷酸间键”(xi)序列表述序列2CTCGCACCCATCTCTCTCCT20(2)序列3信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)种类核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线状(iii)是否假设否(iv)是否反义是(xi)序列表述序列3ACACCCAATTCTGAAAATGG20(2)序列4信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)种类核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线状(iii)是否假设否(iv)是否反义是(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置1..20(D)其它信息/注释＝“均为硫代磷酸酯核苷酸间键”(xi)序列表述序列4ACACCCAATTCTGAAAATGG20(2)序列5信息(i)序列特征(A)长度42碱基对(B)种类核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线状(iii)是否假设否(iv)是否反义是(xi)序列表述序列5CTCGCACCCATCTCTCTCCTTTACACCCAATTCTGAAAATGG42(2)序列6信息(i)序列特征(A)长度42碱基对(B)种类核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线状(iii)是否假设是(iv)是否反义是(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置1..42(D)其它信息/注释＝“均为硫代磷酸酯核苷酸间键”(xi)序列表述序列6CTCGCACCCATCTCTCTCCTTTACACCCAATTCTGAAAATGG42(2)序列7信息(i)序列特征(A)长度42碱基对(B)种类核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线状(iii)是否假设否(iv)是否反义是(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置21..22(D)其它信息/注释＝“3′→3′核苷酸间键”(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置22..42(D)其它信息/注释＝“所有碱基均以3′→5′方向自左至右排列”(xi)序列表述序列7CTCGCACCCATCTCTCTCCTTTGGTAAAAGTCTTAACCCACA42(2)序列8信息(i)序列特征(A)长度42碱基对(B)种类核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线状(iii)是否假设否(iv)是否反义是(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置21..22(D)其它信息/注释＝“3′→3′核苷酸间键”(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置22..42(D)其它信息/注释＝“所有碱基均以3′→5′方向自左至右排列”(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置1..42(D)其它信息/注释＝“均为硫代磷酸酯核苷酸间键”(xi)序列表述序列8CTCGCACCCATCTCTCTCCTTTGGTAAAAGTCTTAACCCACA42(2)序列9信息(i)序列特征(A)长度42碱基对(B)种类核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线状(iii)是否假设否(iv)是否反义是(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置21..22(D)其它信息/注释＝“3′→3′核苷酸间键”(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置22..42(D)其它信息/注释＝“所有碱基均以3′→5′方向自左至右排列”(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置23..42(D)其它信息/注释＝“此区通过随机掺入A、T、C和G碱基合成”(xi)序列表述序列9CTCGCACCCATCTCTCTCCTTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN42(2)序列10信息(i)序列特征(A)长度42碱基对(B)种类核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线状(iii)是否假设否(iv)是否反义是(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置21..22(D)其它信息/注释＝“3′→3′核苷酸间键”(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置22..42(D)其它信息/注释＝“所有碱基均以3′→5′方向自左至右排列”(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置23..42(D)其它信息/注释＝“此区通过随机掺入A、T、C和G碱基合成”(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置1..42(D)其它信息/注释＝“均为硫代磷酸酯核苷酸间键”(xi)序列表述序列10CTCGCACCCATCTCTCTCCTTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN42(2)序列11信息(i)序列特征(A)长度42碱基对(B)种类核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线状(iii)是否假设否(iv)是否反义是(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置21..22(D)其它信息/注释＝“3′→3′核苷酸间键”(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置22..42(D)其它信息/注释＝“所有碱基均以3′→5′方向自左至右排列”(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置23..42(D)其它信息/注释＝“此区通过随机掺入A、T、C和G碱基合成”(xi)序列表述序列11ACACCCAATTCTGAAAATGGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNN42(2)序列12信息(i)序列特征(A)长度42碱基对(B)种类核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线状(iii)是否假设否(iv)是否反义是(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置21..22(D)其它信息/注释＝“3′→3′核苷酸间键”(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置21..42(D)其它信息/注释＝“所有碱基均以3′→5′方向自左至右排列”(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置23..42(D)其它信息/注释＝“此区通过随机掺入A、T、C和G碱基合成”(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置1..42(D)其它信息/注释＝“均为硫代磷酸酯核苷酸间键”(xi)序列表述序列12ACACCCAATTCTGAAAATGGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN42(2)序列13信息(i)序列特征(A)长度42碱基对(B)种类核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线状(iii)是否假设否(iv)是否反义是(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置21..22(D)其它信息/注释＝“3′→3′核苷酸间键”(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置22..42(D)其它信息/注释＝“所有碱基均以3′→5′方向自左至右排列”(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置1..20(D)其它信息/注释＝“此区通过随机掺入A、T、C和G碱基合成”(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置22..42(D)其它信息/注释＝“此区通过随机掺入A、T、C和G碱基合成”(xi)序列表述序列13NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN42(2)序列14信息(i)序列特征(A)长度42碱基对(B)种类核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线状(iii)是否假设否(iv)是否反义是(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置21..22(D)其它信息/注释＝“3′→3′核苷酸间键”(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置22..42(D)其它信息/注释＝“所有碱基均以3′→5′方向自左至右排列”(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置1..20(D)其它信息/注释＝“此区通过随机掺入A、T、C和G碱基合成”(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置22..42(D)其它信息/注释＝“此区通过随机掺入A、T、C和G碱基合成”(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置1..42(D)其它信息/注释＝“均为硫代磷酸酯核苷酸间键”(xi)序列表述序列14NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN42(2)序列15信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)种类核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线状(iii)是否假设否(iv)是否反义是(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置1..20(D)其它信息/注释＝“该序列通过随机掺入A、T、C和G碱基合成”(xi)序列表述序列15NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN20(2)序列16信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)种类核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线状(iii)是否假设否(iv)是否反义是(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置1..20(D)其它信息/注释＝“该序列通过随机掺入A、T、C和G碱基合成”(ix)特征(A)名称/要点各种特征(B)位置1..20(D)其它信息/注释＝“均为硫代磷酸酯核苷酸间键”(xi)序列表述序列16NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN20(2)序列17信息(i)序列特征(A)长度52碱基对(B)种类核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线状(iii)是否假设否(iv)是否反义是(xi)序列表述序列17CUUACAGGAGAGAGAUGGGUGCGAGCGCCAUUUUCAGAAUUGGGUGUUGCAU52(2)序列18信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)种类核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线状(iii)是否假设否(iv)是否反义是(xi)序列表述序列18AGGAGAGAGATGGGTGCGAG20(2)序列19信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)种类核酸(C)链型单链(D)拓扑构型线状(iii)是否假设否(iv)是否反义是(xi)序列表述序列19CCATTTTCAGAATTGGGTGT20权利要求1.一种抗病原体寡核苷酸，由两个或两个以上相同的寡核苷酸序列相互连接而成，其中每一寡核苷酸序列均与病原体的一段靶序列互补。2.根据权利要求1的抗病原体寡核苷酸，其中该寡核苷酸序列通过5′→3′构型相互连接，而且不与任何天然核酸相连接。3.根据权利要求1的抗病原体寡核苷酸，其中该寡核苷酸序列通过3′→3′、2′→2′、3′→2′或2′→3′构型相互连接。4.根据权利要求1的抗病原体寡核苷酸，其中该寡核苷酸序列通过3′→3′构型相互连接。5.一种抗病原体寡核苷酸，由两个或两个以上不同的寡核苷酸序列相互连接而成，其中该寡核苷酸序列分别与同一病原体的不同靶序列互补。6.根据权利要求5的抗病原体寡核苷酸，其中该寡核苷酸序列通过5′→3′构型相互连接，而且不与任何天然核酸相连接。7.根据权利要求5的抗病原体寡核苷酸，其中该寡核苷酸序列通过3′→3′、2′→2′、3′→2′或2′→3′构型相互连接。8.根据权利要求5的抗病原体寡核苷酸，其中该寡核苷酸序列通过3′→3′构型相互连接。9.一种抗病原体寡核苷酸，由两个或两个以上不同的寡核苷酸序列相互连接而成，其中一个或几个寡核苷酸序列与一种病原体的一段靶序列互补，一个或几个寡核苷酸序列与另一种病原体的一段靶序列互补。10.根据权利要求9的抗病原体寡核苷酸，其中该寡核苷酸序列通过5′→3′构型相互连接，而且不与任何天然核酸相连接。11.根据权利要求9的抗病原体寡核苷酸，其中该寡核苷酸序列通过3′→3′、2′→2′、3′→2′或2′→3′构型相互连接。12.根据权利要求9的抗病原体寡核苷酸，其中该寡核苷酸序列通过3′→3′构型相互连接。13.一种抗病原体寡核苷酸，由两个或两个以上不同的寡核苷酸序列相互连接而成，其中一个或几个寡核苷酸序列与病原体的一个菌株的一段靶序列互补，一个或几个寡核苷酸序列与同一病原体的另一个菌株的一段靶序列互补。14.根据权利要求13的抗病原体寡核苷酸，其中该寡核苷酸序列通过5′→3′构型相互连接，而且不与任何天然核酸相连接。15.根据权利要求13的抗病原体寡核苷酸，其中该寡核苷酸序列通过3′→3′、2′→2′、3′→2′或2′→3′构型相互连接。16.根据权利要求13的抗病原体寡核苷酸，其中该寡核苷酸序列通过3′→3′构型相互连接。全文摘要本发明公开了新的反义寡核苷酸。该寡核苷酸对核酸酶降解的抗性提高了，对抗病原体感染的效果也提高了。该寡核苷酸包括两个或两个以上相同或不同的序列，这些序列均与病原体中的一段核酸序列互补，该病原体中的核酸序列为病原体的代谢和/或增殖所必需。这些序列可与一种病原体中的相同或不同靶核酸序列互补，或与同一病原体的不同菌株的靶序列互补，或与不同病原体中的靶序列互补。在优选实施例方案中，这些序列通过3′→3′键相互连接，这种连接方式大大提高了对溶核降解作用的抗性。文档编号C07H21/00GK1154703SQ95194395公开日1997年7月16日申请日期1995年5月30日优先权日1995年5月30日发明者萨德海尔·阿格雷沃,苏珊·梅希弗兹申请人:海布里顿公司