具有金属肽酶抑制活性的硫醇衍生物的制作方法

专利名称：具有金属肽酶抑制活性的硫醇衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有金属肽酶抑制活性的硫醇衍生物，更具体地，它涉及在治疗心血管疾病中有用的N-巯基酰基苯丙氨酸衍生物。
对金属肽酶抑制分子研究的药理学兴趣来自所述酶对心脏循环系统水平所施加的作用。
具有血管紧张肽转化酶(ACE)抑制活性的化合物主要用于治疗高血压、心力衰竭和梗死后，因为它们抑制血管紧张肽Ⅱ(一种产生多种升高血压作用的物质)的形成，这是一众所周知的事实。
具有内皮缩血管肽转化酶(ECE)抑制活性的化合物用作抗血管收缩剂，因为它们抑制内皮缩血管肽(一种具有血管收缩活性的21氨基酸肽)的形成。
相反，具有中性内肽酶(NEP)(也称为脑啡肽酶)抑制活性的化合物作为血管舒张剂是有用的，因为NEP酶不但引起内源脑啡肽酶，而且还引起某些促尿钠排泄因子如心房因子(ANF)(一种由心脏分泌的增加血管舒张和在肾水平上，增加利尿和尿钠排泄的激素)的失活。
因此，即使是通过不同的作用机制对心血管系统施加其作用，具有金属肽酶抑制活性的化合物通常是单独或联合用于治疗高血压、肾衰、充血性心力衰竭和局部缺血性心脏病。
在金属肽酶的硫醇衍生物抑制剂中，Thiorphan〔(DL-(3-巯基-2-苄基丙酰基)甘氨酸)〕(首先由Roques等人叙述于自然(Nature)，288卷，286-288页，(1980)中)和卡托普利(Merck索引，第十一版，第1773号，267页)分别被看成是NEP-抑制剂和ACE-抑制剂的母体化合物。
其它具有硫醇结构的具有金属肽酶抑制活性的分子叙述于文献中。
美国专利4，401，677和4，199，512(两者都以E．R．Squibb & Sons，Inc．的名义)分别叙述了具有脑啡肽酶抑制活性和ACE-抑制活性的巯基烷酰基氨基酸。
欧洲专利申请0419327(Societe Civile Bioproiect)叙述了分别具有脑啡肽酶和ACE抑制活性的氨基酸衍生物。
欧洲专利申请0449523(E．R．Squib & Sohs，Inc．)叙述了具有NEP-抑制活性的巯基或酰基硫代三氟甲基酰胺。
国际专利申请WO 93／08162(Rhone-Poulenc Rorer S．A．-Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale(INSERM))叙述了具有混合的ACE／NEP抑制活性的β，β-二取代的α-巯基甲基丙酰基酰胺。
欧洲专利申请0524553〔Institut National de la Sante et de laRecherche Médicale(INSERM)〕叙述了具有中性内肽酶和肽基二肽酶A抑制活性的酰基巯基烷酰基二肽。
欧洲专利申请0566157(Schering Corporation)叙述了具有NEP-抑制活性的硫醇衍生物如N-巯基酰基氨基酸。
具有ACE-抑制和NEP-抑制活性的α-巯基酰基二肽还由S．S．Bhagwat等人叙述于Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，7，735-738，1995中。
在最后的这一工作中作者得出结论，尽管在具有α-巯基酰基二肽结构的分子中二苯基甲基基团的存在带来了令人感兴趣的混合的ACE／NEP-抑制活性，但二苯基基团被如α-或β-萘基的基团的取代使活性显著丧失。
现在我们已发现对血管紧张肽转化酶以及对中性内肽酶(混合的或双重的ACE／NEP抑制活性)具有显著抑制活性的N-巯基酰基苯丙氨酸衍生物，其在治疗心血管病上特别有用。
因此，本发明的目的是式(Ⅰ)化合物以及其药物可接受的盐
其中R是巯基或在生物中可转化成巯基基团的R4COS基团；R1是直链或支链的C2-C4烷基基团或芳基或在烷基部分具有从1到6个碳原子的芳烷基基团，其中芳基是苯基或具有1或2个选自氮、氧和硫的杂原子的5或6元芳杂环，其可被1或多个取代基取代或不取代，相同的或不同的，取代基是选自卤素原子、羟基基团、烷氧基、烷基、烷硫基、在烷基部分具有从1到6个碳原子的烷基磺酰基或烷氧基羰基基团、含1或多个氟原子的C1-C3烷基基团、羧基基团、硝基基团、氨基或氨基羰基基团、酰氨基基团、氨基磺酰基基团、在烷基部分具有从1到6个碳原子的单-或二-烷基氨基或者单-或二-烷基氨基羰基基团；R2是氢原子、直链或支链的C1-C4烷基或苄基基团；R3是由具有1或2个选自氮、氧和硫的杂原子的5或6元芳杂环取代的苯基，作为苯基和杂环基团，可以被一或多个取代基取代或不取代，可以相同或不同，如对R1所指出的；R4是直链或支链C1-C4烷基基团或苯基；用星号标记的碳原子是立体结构中心。
式Ⅰ的化合物含两个立体结构中心，因此可以立体异构体的形式存在。
因此，本发明的目的是以立体异构混合物形式和以单一立体异构体形式的式Ⅰ化合物。
本发明目的式Ⅰ化合物具有混合的ACE／NEP-抑制活性并且可用于治疗心血管疾病。
尽管“混合的”和“双重的”的两个术语都无差异地使用，但是在文献中对同时具有ACE和NEP-抑制活性的化合物更普遍地接受术语“双重的”。
在本文中，术语“混合的”和“双重的”被认为是等同的。
在本说明书中，除非另外指明，对术语直链或支链烷基基团，我们是指烷基如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、异戊基、叔戊基、正己基和异己基基团；对术语直链或支链烷氧基，我们是指烷氧基如甲氧基、乙氧基、正丙氧基和异丙氧基；对术语卤素原子，我们是指氟、卤、溴或碘原子；对术语酰基，我们是指从脂肪或芳香羧酸如乙酸、丙酸、丁酸和苯甲酸衍生的酰基基团；对术语含1或2个选自氮、氧和硫中的杂原子的5或6元芳香杂环，我们是指如噻唑、异噁唑、噁唑、异噻唑、吡唑、咪唑、噻吩、吡咯、吡啶、嘧啶、吡嗪哒嗪和呋喃、选择性地为苯并稠合的。
式Ⅰ化合物的药物可接受的盐的例子是与碱金属或碱土金属的盐以及与药物可接受的有机碱的盐。
优选的式Ⅰ化合物是其中R3是在4位取代有一杂环基团的苯基的化合物。
在此类中更优选的化合物是其中R1表示被一或多个取代基取代或不取代的芳烷基的式Ⅰ化合物，相同的或不同的，取代基选自卤素原子、羟基、烷基或烷氧基。
在此类中更进一步优选的化合物是其中R1表示被一或多个取代基取代或不取代的苯基烷基的式Ⅰ化合物，相同的或不同的，取代基选自卤素原子、羟基、烷基或烷氧基。
优选的式Ⅰ化合物的药物可接受的盐的例子是与碱金属如钠、锂和钾的盐。
对本领域中熟练技术人员很清楚地是其中R是在生物体中可转化成巯基基团的R4COS的式Ⅰ化合物和其中R2是烷基或苄基基团的式Ⅰ化合物是其中分别R是巯基(R=SH)或R2是氢原子(R2=H)的相应的式Ⅰ化合物的生物前体(前体药物)。
本发明目的的优选的式Ⅰ化合物的特定的例子是N-(3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰)-4-(2-噻唑基)-苯丙氨酸甲酯；N-(3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰)-4-(2-吡啶基)-苯丙氨酸甲酯；N-(3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰)-4-(3-吡啶基)-苯丙氨酸苄酯；N-(3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰)-4-(2-呋喃基)-苯丙氨酸甲酯；N-(3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰)-4-(5-嘧啶基)-苯丙氨酸乙酯；N-(3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰)-4-(2-吡嗪基)-苯丙氨酸甲酯；N-(3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰)-4-(2-噻吩基)-苯丙氨酸甲酯；N-(3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰)-4-(3-噻吩基)-苯丙氨酸甲酯；N-(3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰)-4-(3-呋喃基)-苯丙氨酸甲酯；N-〔3-苯基羰基硫代-2-(3-吡啶基甲基)丙酰〕-4-(2-噻唑基)-苯丙氨酸甲酯；N-〔3-乙酰基硫代-2-(3-甲氧基苯基)甲基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-苯丙氨酸甲酯；N-〔3-乙酰基硫代-2-(2-氟苯基)甲基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-苯丙氨酸甲酯；N-〔3-苯基羰基硫代-2-(2-噻吩基)甲基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-苯丙氨酸甲酯；N-〔2-(2-呋喃基)甲基-3-苯基羰基硫代-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-苯丙氨酸甲酯；N-〔2-(3-甲基-5-异噁唑基)甲基-3-苯基羰基硫代-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-苯丙氨酸甲酯；N-(3-巯基-2-苯基甲基丙酰)-4-(2-噻唑基)-苯丙氨酸；
N-(3-巯基-2-苯基甲基丙酰)-4-(2-吡啶基)-苯丙氨酸；N-(3-巯基-2-苯基甲基丙酰)-4-(3-吡啶基)-苯丙氨酸；N-(3-巯基-2-苯基甲基丙酰)-4-(2-呋喃基)-苯丙氨酸；N-(3-巯基-2-苯基甲基丙酰)-4-(5-嘧啶基)-苯丙氨酸；N-(3-巯基-2-苯基甲基丙酰)-4-(2-吡嗪基)-苯丙氨酸；N-(3-巯基-2-苯基甲基丙酰)-4-(2-噻吩基)-苯丙氨酸；N-(3-巯基-2-苯基甲基丙酰)-4-(3-噻吩基)-苯丙氨酸；N-(3-巯基-2-苯基甲基丙酰)-4-(3-呋喃基)-苯丙氨酸；N-〔3-巯基-2-(3-吡啶基甲基)丙酰〕-4-(2-噻唑基)-苯丙氨酸；N-〔3-巯基-2-(3-甲氧基苯基)甲基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-苯丙氨酸；N-〔3-巯基-2-(2-噻吩基)甲基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-苯丙氨酸；N-〔3-巯基-2-(3-甲基-5-异噁唑基)甲基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-苯丙氨酸；N-〔2-(2-氟苯基)甲基-3-巯基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-苯丙氨酸；N-〔2-(2-呋喃基)甲基-3-巯基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-苯丙氨酸。
本发明目的的式Ⅰ化合物的制备是按照下列合成方法进行的，包括式Ⅱ化合物
其中R和R1具有上面所述的意义；和式Ⅲ的苯丙氨酸衍生物之间的反应
其中R2和R3具有上面所述的意义。
缩合反应按照肽化学常规技术进行。
在进行反应之前，适当地保护可能会干扰反应的选择性官能团是有益的。
选择性保护是根据常规技术进行。
在这点上，优选使用其中R是R4COS基团的化合物作为式Ⅱ的中间体，因而得到其中R=R4COS的相应的式Ⅰ化合物，从其经水解可得其中R=SH的式Ⅰ化合物。
按照所进行的反应和要保护的官能团，选择性保护的有效性的评价以及所采取的保护种类的选择是处于本领域熟练技术人员的常识之内。
选择性保护基的去除是按照常规技术进行的。
作为在有机化学中保护基应用的一般性参考资料参看TheodoraW．Greene和Peter G．M．Wuts的“有机合成中的保护基”，JohnWiley & Sons．Inc．，第二版，1991。
式Ⅱ化合物是已知或容易按照所述常规方法制备的，例如在以E．R．Squibb & Sons Inc．的名义的英国专利号1576161中所述的。
另一可供选择地，式Ⅱ化合物可按照由M．C．Fournié-Zalusky等人在J．Med．Chem．1994，37，1070-1083中所述的合成方法制备。
并且式Ⅲ的中间体化合物是已知或容易按照已知方法制备。
例如，式Ⅲ化合物可按照由W．C．Shieh等人在J．Org．Chem．1992，57，379-381中所述的合成方法制备。
另一可选择地，式Ⅲ化合物可按由D．S．Wilbur等人在Bioconjugate Chem．1993，4，574-580中所述的从卤代杂环化合物和甲锡烷苯丙氨酸衍生物开始通过偶联方法(交叉偶联)制备。
以单一立体异构体形式的式Ⅰ化合物是通过立体选择性合成或通过按照常规技术的立体异构体混合物的分离制备的。
并且本发明目的的式Ⅰ化合物的盐的制备是按照常规技术进行的。
本发明目的的式Ⅰ化合物具有混合的ACE／NEP-抑制活性并可用于治疗心血管疾病。
式Ⅰ化合物的抑制活性是通过体外试验(实施例8)评价的。
特别地，式Ⅰ化合物的抑制活性是通过与前述的Thiorphan和卡托普利相比评价的。
式Ⅰ化合物的体外抑制活性表示为IC50值，结果为nM浓度。
产生所述的活性与卡托普利所涉及的ACE-抑制活性相当，大于与Thiorphan所涉及的NEP-抑制活性。
而且式Ⅰ化合物的抑制活性还通过来自体内的试验与已知化合物(实施例9)相比评价。
特别地，N-〔3-巯基-2-(3，4-亚甲二氧基苯基)甲基-丙酰〕-(S)-苯丙氨酸和N-〔3-巯基-2-(3，4-亚甲二氧基苯基)甲基-丙酰〕-(S)-酪氨酸，作为脑啡肽酶和ACE-抑制剂叙述于前述的欧洲专利申请0419327中，下文分别称作化合物R-1和R-2，以及N-(3-巯基-2-甲基丙基)-L-酪氨酸和N-(3-巯基-2-甲基丙酰基)-L-色氨酸作为ACE-抑制剂叙述于美国专利4，199，512中和作为脑啡肽酶抑制剂叙述于美国专利4，401，677中，下文分别称作化合物R-3和R-4，作为对比化合物。
特别地，来自体内的ACE／NEP-抑制活是通过评价用试验化合物静脉或口服途径处理的自发性高血压鼠(SHR)的组织匀浆(对ACE和NEP活性分别为肺和肾)的酶活性确定的。
值得注意的是由式Ⅰ化合物在来自体内的试验中显示的活性证实在体外试验中显示的混合活性(双重活性)，也出现在口服给药后。
而且产生了所述活性显著地高于对比化合物活性的结果。
为了治疗上实用，式Ⅰ化合物可配制成适于口服或不经肠胃给药的固体或液体药物组合物。
因此，在与药用载体的混合物中含治疗有效量的式Ⅰ化合物的药物组合物是本发明的进一步的目的。
按照本发明的药物组合物的特定的例子是片剂、包衣片、胶囊、颗粒剂、适于口服给药的溶液或悬浮液、适于不经肠胃给药的溶液和悬浮液。
本发明目的的药物组合物是按照常规技术制备的。
式Ⅰ化合物或相应前体药物的一日剂量将取决于数种因素如疾病的严重性、病人的个体反应或制剂的种类，但通常为每公斤体重0．1mg到10mg之间，分成单剂量或多个日剂量。
为了阐述本发明，现在给出下面的实施例。
除非另外指明，闪式色谱法是通过使用Baker公司(编码7024-00)的闪式色谱硅胶进行的。
实施例1N-叔丁氧羰基-4-(5-嘧啶基)-L-苯丙氨酸乙酯的制备。
5-嘧啶基硼酸(850mg；2毫摩尔)、N-叔丁氧羰基-4-三氟甲基磺酰基-L-苯丙氨酸乙酯(450mg；2．2毫摩尔)、碳酸钠(530mg)在水(2．59ml)中的溶液和甲苯∶乙醇=10∶4．5(20ml)混合液的混合物用氮气脱气30分钟。
随后，向其中加四(三苯基膦)钯(0)(120mg；0．06毫摩尔)，反应混合物在90℃加热并在搅拌下保持3小时。
然后混合物保持在室温并再加N-叔丁氧羰基-4-三氟甲基磺酰基-L-苯丙氨酸乙酯(112mg)和四(三苯基膦)钯(0)(30mg)。
混合物进一步在90℃温度加热并在搅拌下保持另外18小时。
在室温冷却反应混合物后，加乙酸乙酯(100ml)和水(40ml)。
分离各相并用硫酸钠干燥有机相并在真空下蒸发。得到的残余物经闪式色谱法(硅胶，洗脱剂己烷∶乙酸乙酯=7∶3，氮气压力0．1大气压)纯化，这样得到了N-叔丁氧羰基-4-(5-嘧啶基)-L-苯丙氨酸乙酯(130mg；14％产率)，为无色油状物。
1H-NMR(200MHz，CDCl3)；δ(ppm)1．24(t，3H，CH2-CH3)；1．40[s，9H，C(CH3)3]；3．01-3．25(m，2H，CH2-CH)；4．19(q，2H，CH2-CH3)；4．52-4．65(m，1H，CH-COO)；5．06(d，1H，NH)；7．25-7．52(m，4H，亚苯基)；8．91(s，2H，N-CH-C-CH-N)；9．19(s，1H，N-CH-N)。
实施例2N-叔丁氧羰基-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸甲酯的制备将N-叔丁氧羰基-4-(三氟甲基磺酰基)-L-苯丙氨酸甲酯(8g；32．3毫摩尔)和二(三苯基膦)氯化钯(2．3g)加至2-三甲基甲锡烷基-噻唑(13．8g；32．3毫摩尔)在预先用氮气脱气的四氢呋喃∶甲苯=10∶1的混合物(50ml)的溶液中。
混合物回流24小时，随后，再加2-三甲基甲锡烷基-噻唑(2g)。
在回流6小时后，加N-叔丁氧羰基-4-(三氟甲基磺酰基)-L-苯丙氨酸甲酯(2g)和二(三苯基膦)氯化钯(700mg)。
产生的反应混合物在搅拌下于70℃保持16小时，随后在室温下冷却。
然后加水(200ml)至混合物中，用二氯甲烷(4×200ml)萃取之。
收集的有机相用硫酸钠干燥并在真空下蒸发。
得到的残余物经闪式色谱法(硅胶，洗脱剂二氯甲烷∶乙酸乙酯=9∶1，氮气压力=0．1大气压)纯化，这样给出N-叔丁氧羰基-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸甲酯(2．3g；20％产率)。
1H-NMR(200 MHz，CDCl3)；δ(ppm)1．40[s，9H，C(CH3)3]；3．00-3．21(m，2H，CH2)；3．70(s，3H，COOCH3)；4．42-4．65(m，1H，CH-COO)；5．02(bd，1H，NH)；7．30(d，1H，S-CH-CH-N)；7．81(d，1H，S-CH-CH-N)；7．15-7．90(m，4H，亚苯基)。
实施例3N-叔丁氧羰基-4-(3-吡啶基)-L-苯丙氨酸甲酯的制备将3-溴吡啶(1．67g；10毫摩尔)和四(三苯基膦)钯(0)(370mg；0．219毫摩尔)加至按照由D．S．Wilbur等人在BioconjugateChem．，1973，4，574-580中所述制备的N-叔丁氧羰基-4-(三丁基甲锡烷基)-L-苯丙氨酸甲酯(4g；7．03毫摩尔)在预先用氮气脱气的无水二甲基甲酰胺(30ml)的溶液中。
反应混合物在搅拌下于室温保持10分钟，随后在105℃加热6小时。
再加四(三苯基膦)钯(0)(0．0035毫摩尔)，反应混合物在搅拌下于105℃保持8小时，然后在室温冷却。
向其中加水(100ml)，反应混合物用己烷(3×150ml)萃取。
收集的有机相用饱和氟化钾水溶液洗涤，硫酸钠干燥并在真空下蒸发。
得到的残余物用乙酸乙酯收集并过滤。
产生的溶液在真空下蒸发，残余物经闪式色谱法(硅胶，洗脱剂己烷∶乙酸乙酯=8∶2，氮气压力0．1大气压)纯化给出N-叔丁氧羰基-4-(3-吡啶基)-L-苯丙氨酸甲酯(1．5g；60％产率)，为无色油状物。质谱(C．I．)(M+H)+=3571H-NMR(200 MHz，CDCl3)δ(ppm)1．40[s，9H，C(CH3)3]；3．00-3．20(m，2H，CH2)；3．71(s，3H，COOCH3)；4．55(m，1H，CH-COO)；5．05(bd，1H，NH)；7．19-7．51(m，4H，亚苯基)；7．30-8．82(bm，4H，吡啶基)通过类似的操作方法制得下面的化合物N-叔丁氧羰基-4-(2-吡啶基)-L-苯丙氨酸甲酯质谱(C．I．)(M+H)+=3571H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)1．40[s，9H，C(CH3)3]；3．03-3．21(m，2H，CH2-CH)；3．70(s，3H，COOCH3)；4．54-4．65(m，1H，CH-COO)；4．98(d，1H，CONH)；7．16-7．21(m，1H，N-C-CH-CH)；7．65-7．77(m，2H，N-CH-CH-CH)；7．19-7．93(m，4H，亚苯基)；8．63-8．68(m，1H，N-CH)。
N-叔丁氧羰基-4-(2-吡嗪基)-L-苯丙氨酸甲酯1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)1．40[s，9H，C(CH3)3]；3．02(m，2H，CH2)；3．70(s，3H，COOCH3)；4．53-4．70(m，1H，CH-COO)；5．03(bd，1H，NH)；7．21-7．98(m，4H，亚苯基)；8．49和8．62[2(bs，2H，N-CH-CH-N)]；9．00(s，1H，CH-N-CH-CH)；N-叔丁氧羰基-4-(2-噻吩基)-L-苯丙氨酸甲酯1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)1．41[s，9H，C(CH3)3]；2．98-3．18(m，2H，CH2)；3．71(s，3H，COOCH3)；4．53-4．64(m，1H，CH-COO)；4．98(bd，1H，NH)；7．02-7．28(m，3H，噻吩基)；7．10-7．54(m，4H，亚苯基)。
实施例44-(3-吡啶基)-L-苯丙氨酸甲酯二盐酸盐的制备将氯化亚砜(0．85ml；4．78毫摩尔)滴加至按照在实施例3中所述制备的N-叔丁氧羰基-4-(3-吡啶基)-L-苯丙氨酸甲酯(1．4g；3．93毫摩尔)在甲醇(30ml)的溶液中。保持温度在0℃。
滴加结束，使反应混合物回到室温并在搅拌下保持8小时。
然后在真空下蒸发溶剂给出4-(3-吡啶基)-L-苯丙氨酸甲酯二盐酸盐(820mg；71％产率)，就这样用于下面的反应中。
质谱(C．I．)(M+H)+=257(游离碱)1H-NMR(200 MHz，D2O)δ(ppm) 3．11-332(m，2H，CH2)；3．67(s，3H，CH3)；4．31-4．37(m，1H，CH)；7．30-7．63(m，4H，亚苯基)；7．97(dd，1H，CH-N-CH-CH-CH)；8．59(d，1H，CH-N-CH-CH-CH)；8．65-8．71(m，1H，CH-N-CH-CH)；8．89(d，1H，CH-N-CH-CH-CH)。
通过类似的操作方法制得下面的化合物4-(2-吡啶基)-L-苯丙氨酸甲酯二盐酸盐质谱(C．I．)(M+H)+=257(游离碱)1H-NMR(200 MHz，D2O)δ(ppm)3．12-3．33(m，2H，CH2)；3．64(s，3H，CH3)；4．30-4．37(m，1H，CH)；7．36-7．73(m，4H，亚苯基)；7．78-8．58(m，4H，吡啶基)4-(5-嘧啶基)-L-苯丙氨酸乙酯二盐酸盐1H-NMR(200MHz，DMSO-d6)δ(ppm)1．11(t，3H，CH2-CH3)；3．10-3．35(m，2H，CH2-CH)；4．04-4．20(m，2H，CH2-CH3)；4．22-4．35(m，1H，CH)；7．40-7．84(m，4H，亚苯基)；9．15(s，2H，N-CH-C-CH-N)；9．19(s，1H，N-CH-N)；4-(2-吡嗪基)-L-苯丙氨酸甲酯二盐酸盐质谱(C．I．)(M+H)+=258(游离碱)1H-NMR(200MHz，DCl 1N)δ(ppm)3．45-3．67(m，2H，CH2)；3．98(s，3H，CH3)；4．65-4．72(m，1H，CH)；7．68-8．26(m，4H，亚苯基)；9．02(d，1H，CH-N-CH-CH)；9．44(dd，1H，CH-N-CH-CH)；9．54(d，1H，CH-N-CH-CH)；4-(2-噻吩基)-L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐质谱(C．I．)(M+H)+=262(游离碱)1H-NMR(200 MHz，D2O)δ(ppm)2．98-3．19(m，2H，CH2)；3．65(s，3H，CH3)；4．21-4．28(m，1H，CH)；6．96-7．28(m，3H，噻吩基)；7．08-7．52(m，4H，亚苯基)；4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸甲酯二盐酸盐1H-NMR(200MHz D2O)δ(ppm)3．10-3．32(m，2H，CH2-CH)；3．68(s，3H，CH3)；4．30-4．38(m，1H，CH)；7．30-7．80(m，4H，亚苯基)；7．70-7．91(m，2H，噻唑基)。
实施例52-异丁基-3-苯基羰基硫代-丙酸的制备2-异丁基-丙烯酸(6．34g；49毫摩尔)和硫代苯甲酸(5．96ml；51毫摩尔)的混合物在搅拌下于100℃加热2小时。
然后反应混合物用石油醚40-60℃(100ml)处理并在-70℃的干冰／丙酮浴中冷却。
经过滤并用石油醚在-70℃洗涤后，收集得一残余物，其在减压下干燥给出2-异丁基-3-苯基羰基硫代-丙酸(11．12g；85％产率)，为白色固体。
1H-NMR(200 MHz，CDCl3)δ(ppm)0．90-1．00(m，6H)；1．40-1．90(m，3H)；2．70-2．90(m，1H)；3．10-3．40(m，2H)；7．35-7．62(m，3H)；7．90-8．00(d，2H)。
通过类似的操作方法制得下面的化合物2-(3-甲氧基苯基)甲基-3-苯基羰基硫代-丙酸
1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)2．32(s，3H)；2．80-3．15(m，5H)；3．77(s，3H)；6．70-6．80(m，3H)；7．14-7．25(m，1H)。
3-乙酰基硫代-2-(2-氟苯基)甲基-丙酸1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)2．31(s，3H)；2．90-3．20(m，5H)；6．95-7．30(m，4H)。
3-苯基羰基硫代-2-(2-噻吩基)甲基-丙酸苄胺盐1H-NMR(200MHz，DMSO-d6)δ(ppm)2．45-3．25(m，5H，s-CH2-CH-CH2)；3．90(s，2H，CH2-苯基)；6．85-7．91(m，13H，芳基)。
实施例6N-(2S)-3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸甲酯(化合物1)的制备羟基苯并三唑(0．54g；4毫摩尔)在四氢呋喃(30ml)中的溶液以及随后的二环己基碳二亚胺(0．825g；4毫摩尔)在二氯甲烷(15ml)中的溶液在搅拌下于0℃加至(2S)-3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酸(1．2g；4毫摩尔)、如在实施例4中所述制备的4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸甲酯二盐酸盐(1．34g；4毫摩尔)、三乙胺(1．11ml；8毫摩尔)在四氢呋喃(20ml)和二氯甲烷(30ml)中的混合物中。
反应混合物在搅拌下保持20小时，然后滤除二环己基脲并在减压下蒸发溶剂。
用乙酸乙酯收集残余物并且溶液用20％氯化钠、5％碳酸氢钠和再次20％氯化钠水溶液洗涤。
在各相分离和有机相蒸发后，产生的白色固体经闪式色谱法(硅胶，洗脱剂乙酸乙酯∶己烷=40∶60，氮气压力0．1大气压)纯化，如此给出N-〔(2S)-3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸甲酯(1．5g)。
m．p．98-1002质谱(C．I．)(M+H)+=5451H-NMR(200 MHz，CDCl3)δ(ppm)2．63-3．35(m，7H，CH2-CH-CH2，CH2-C6H4-噻唑基)；3．68(s，3H，COOCH3)；4．75-4．85(m，1H，CH-COO)；5．78(d，1H，NH)；7．10-8．00(m，16H，芳基)。
通过类似的操作方法，从已知或如在实施例4和5中所述制备的化合物起始，得到了下面的化合物N-〔(2S)-3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰〕-4-(2-呋喃基)-L-苯丙氨酸甲酯(化合物2)。
m．p．132-134℃质谱(C．I．)(M+H)+=5281H-NMR(200 MHz，CDCl3)δ(ppm)2．60-3．35(m，7H，CH2-CH-CH2，CH2-C6H4-呋喃基)；3．58(s，3H，COOCH3)；4．71-4．81(m，1H，CH-COO)；5．73(d，1H，NH)；6．40-8．00(m，17H，芳基)。
N-〔(2S)-3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰〕-4-(5-嘧啶基)-L-苯丙氨酸乙酯(化合物3)m．p．117-119℃质谱(C．I．)(M+H)+=5541H-NMR(200 MHz，CDCl3)δ(ppm)∶1．18(t，3H，CH3-CH2)；2．65-3．35(m，7H，CH2-CH-CH2，CH2-C6H4-嘧啶基)；3．95-4．20(m，2H，COOCH2)；4．70-4．80(m，1H，CH-COO)；5．78(d，1H，NH)；7．05-8．00(m，14H，苯基，亚苯基)；8．68(s，2H，CH-N-CH-N-CH)；9．11(s，1H，N-CH-N)。
N-〔(2S)-3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰〕-4-(2-吡嗪基)-L-苯丙氨酸甲酯(化合物4)m．p．145-147℃
质谱(C．I．)(M+H)+=5401H-NMR(200 MHz，CDCl3)δ(ppm)2．65-3．35(m，7H，CH2-CH-CH2，CH2-C6H4-吡嗪基)；3．61(s，3H，COOCH3)；4．75-4．85(m，1H，CH-COO)；5．78(d，1H，NH)；7．10-8．00(m，14H，苯基，亚苯基)；8．48-8．75(m，3H，CH-N-CH-CH-N)；N-〔(2S)-3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰〕-4-(3-吡啶基)-L-苯丙氨酸甲酯(化合物5)m．p．132-134℃质谱(C．I．)(M+H)+=5391H-NMR(200 MHz，CDCl3)δ(ppm)2．66-2．79(m，1H，CH2-CH-CH2)；2．88-3．35(m，6H，CH2-CH-CH2，CH2-C6H4-吡啶基)；3．61(s，3H，COOCH3)；4．75-4．85(m，1H，CHCOO)；5．77(d，1H，NH)；7．07-7．99(m，16H，CH-CH-CH-N，苯基，亚苯基)；8．51-8．64(m，2H，CH-N-CH)；N-〔(2S)-3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰〕-4-(2-吡啶基)-L-苯丙氨酸甲酯(化合物6)m．p．123-125℃质谱(C．I．)(M+H)+=5391H-NMR(200 MHz，CDCl3)δ(ppm)2．63-2．77(m，1H，CH2-CH-CH2)；2．85-3．35(m，6H，CH2-CH-CH2，CH2-C6H4-吡啶基)；3．56(s，3H，COOCH3)；4．75-4．85(m，1H，CHCOO)；5．75(d，1H，NH)；7．09-7．99(m，16H，CH-CH-CH-N，苯基，亚苯基)；8．61-8．65(m，1H，N-CH-CH)；N-〔(2S)-3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰〕-4-(2-噻吩基)-L-苯丙氨酸甲酯(化合物7)质谱(C．I．)(M+H)+=5441H-NMR(200 MHz，CDCl3)δ(ppm)2．64-336(m，7H，CH2-CH-CH2，CONH-CH-CH2)；3．58(s，3H，COOCH3)；4．74-4．83(m，1H，CH-COO)；5．74(d，1H，NH)；6．97-7．99(m，17H，芳基)；N-〔(2S)-3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰〕-4-(3-噻吩基)-L-苯丙氨酸甲酯(化合物8)质谱(C．I．)(M+H)+=5441H-NMR(200 MHz，CDCl3)δ(ppm)2．63-3．35(m，7H，CH2-CH-CH2，NH-H-CH2)；3．58(s，3H，COOCH3)；4．73-4．85(m，1H，CH-COO)；5．70-5．76(bd，1H，NH)；7．00-7．62(m，15H，苯基，亚苯基，CH-CH-S)；7．93-8．00(m，2H，CH-S-CH)；N-〔(2S)-3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰〕-4-(3-呋喃基)-L-苯丙氨酸甲酯(化合物9)m．p．115-117℃质谱(C．I．)(M+H)+=5281H-NMR(200 MHz，CDCl3)δ(ppm)2．62-3．36(m，7H，CH2-CH-CH2，NH-CH-CH2)；3．58(s，3H，COOCH3)；4．71-4．82(m，1H，CH-COO)；5．72(bd，1H，NH)；6．50-8．00(m，17H，芳基)；N-〔3-苯基羰基硫代-2-(3-吡啶基甲基)丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸甲酯-立体异构体A(化合物10)质谱(C．I．)(M+H)+=546TCL(乙酸乙酯∶石油醚=95∶5)，Rf=0．331H-NMR(200 MHz，CDCl3)；δ(ppm)2．60-3．38(m，7H，CH2-CH-CH2，NH-CH-CH2)；3．60(s，3H，COOCH3)；4．79-4．90(m，1H，CH-COO)；6．21(bd，1H，NH)；7．29-7．81(m，2H，噻唑基)；6．75-8．48(m，13H，苯基，亚苯基，吡啶基)N－〔3-苯基羰基硫代-2-(3-吡啶基甲基)丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸甲酯-立体异构体B(化合物11)质谱(C．I．)(M+H)+=546TLC(乙酸乙酯∶石油醚=95∶5)，Rf=0．241H-NMR(200 MHz，CDCl3)δ(ppm)2．61-3．25(m，7H，CH2-CH-CH2，NH-CH-CH2)；3．60(s，3H，COOCH3)；4．80-4．91(m，1H，CH-COO)；6．09(bd，1H，NH)；7．27-7．80(m，2H，噻唑基)；7．10-8．40(m，13H，苯基，亚苯基，吡啶基)；N-〔2-异丁基-3-苯基羰基硫代-丙酰〕-4-( 2-噻唑基)-L-苯丙氨酸甲酯(化合物12)1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)0．80-0．95(m，6H)；1．30-1．80(m，3H)；2．40-2．60(m，1H)；3．00-3．30(m，4H)；3．70(d，3H)；4．90-5．05(m，1H)；6．00-6．15(bt，1H)；7．10-8．00(m，11H)；N-〔3-乙酰基硫代-2-(3-甲氧基苯基)甲基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸甲酯(化合物13)1H-NMR(200 MHz，CDCl3)δ(ppm)2．30(d，3H)；2．45-3．20(m，7H)；3．63(d，3H)；3．75(d，3H)；4．70-4．93(m，1H)；5．70-5．90(dd，1H)；6．60-6．85(m，4H)；7．17-7．32(m，3H)；7．68-7．90(m，3H)；N-〔3-乙酰基硫代-2-(3-氟苯基)甲基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸甲酯(化合物14)1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)2．29(s，3H)；2．55-3．20(m，7H)；3．65(2s，3H)；4．70-4．90(m，1H)；5．80-6．00(2d，1H)；6．70-7．32(m，3H)；N-〔3-苯基羰基硫代-2-(2-噻吩基)甲基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸甲酯(化合物15)1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)2．68-3．37(m，7H)；3．60-3．61(2s，3H，COOCH3)；4．31-4．45(m，1H，CH-COOCH3)；6．01-6．10(2d，1H，NH)；6．80-8．00(m，14H)；实施例7N-〔(2S)-3-巯基-2-苯基甲基丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸(化合物16)的制备如在实施例6中所述制备的N-〔(2S)-3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸甲酯(1．4g；2．57毫摩尔)悬浮于经氮气冒泡脱除氧气的乙醇(30ml)中。
于5℃向此悬浮液中滴加氢氧化钠1N(7．7ml)的脱气水溶液并在加完后，再滴加脱气乙醇(20ml)。
反应混合物于室温搅拌下保持4小时，然后于0℃冷却并用盐酸5％(10ml)酸化。
反应混合物蒸发至干并用乙腈和水收集残余物，随后过滤，如此给出N-〔(2S)-3-巯基-2-苯基甲基丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸(1g)。
m．p．180-182℃质谱(C．I．)(M+H)+=4271H-NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ(ppm)1．80-1．88(m，1H，SH)；2．22-2．84(m，5H，CH2-CH-CH2)；2．86-3．18(m，2H，CH2-CH-COO)；4．46-4．57(m，1H，CH-COO)；7．10-7．25(m，5H，苯基)；7．32-7．84(m，4H，亚苯基)；7．74(d，1H，N-CH=CH-S)；7．89(d，1H，N-CH=CH-S)；8．35(d，1H，NH)；12．76(s，1H，COOH)；通过类似的操作方法制得下面的化合物N-〔(2R)-3-巯基-2-苯基甲基丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸(化合物17)1H-NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ(ppm)2．15-2．23(m，1H，SH)；2．31-2．74(m，5H，CH2-CH-CH2)；2．78-3．07(m，2H，CH2-CH-COO)；4．42-4．53(m，1H，CH-COO)；7．02-7．80(m，9H，苯基和亚苯基)；7．75(d，1H，N-CH=CH-S)；7．90(d，1H，N-CH=CH-S)；8．36(d，1H，NH)；N-[(2S)-3-巯基-2-苯基甲基丙酰]-4-(2-呋喃基)-L-苯丙氨酸(化合物18)m．p．153-155℃质谱(C．I．)(M+H)+=4101H-NMR(200 MHz，CDCl3)δ(ppm)1．40(t，1H，SH)；2．45-3．25(m，7H，CH2-CH-CH2，CH2-CH-COO)；4．80-4．90(m，1H，CH-COO)；5．86(d，1H，NH)；6．42-7．42(m，3H，呋喃基)7．07-7．57(m，9H，苯基，亚苯基)；N-〔(2S)-3-巯基-2-苯基甲基丙酰〕-4-(5-嘧啶基)-L-苯丙氨酸(化合物19)m．p．193-195℃质谱(C．I．)(M+H)+=4221H-NMR(200MHz，DMSO-d6)δ(ppm)1．81(bm，1H，SH)；2．21-3．20(m，7H，CH2-CH-CH2，CH2-C6H4-嘧啶基)；4．46-4．57(m，1H，CH-COO)；7．06-7．29(m，5H，苯基)；7．36-7．72(m，4H，亚苯基)；8．33(d，1H，NHCO)；9．08(s，2H，N-CH-C-CH-N)；9．15(s，1H，N-CH-N)；N-〔(2S)-3-巯基-2-苯基甲基丙酰〕-4-(2-吡嗪基)-L-苯丙氨酸(化合物20)m．p．176-178℃质谱(C．I．)(M+H)+=4221H-NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ(ppm)1．84(bt，1H，SH)；2．21-3．21(m，7H，CH2-CH-CH2，CH2-CH-COO)；4．48-4．59(m，1H，CH-COO)；7．10-7．26(m，5H，苯基)；7．37-8．05(m，4H，亚苯基)；8．37(d，1H，NHCO)；8．58(d，1H，CH-N-CH-CH-N)；8．68-8．70(m，1H，CH-N-CH-CH-N)；9．21(d，1H，C-CH-N)；12．78(b，1H，COOH)；N-〔(2S)-3-巯基-2-苯基甲基丙酰〕-4-(3-吡啶基)-L-苯丙氨酸(化合物21)m．p．146-148℃质谱(C．I．)(M+H)+=4211H-NMR(200MHz，DMSO-d6)δ(ppm)1．69-1．89(b，1H，SH)；2．23-3．18(m，7H，CH2-CH-CH2，CH2-亚苯基)；4．45-4．56(m，1H，CH-COO)；7．09-7．26(m，5H，苯基)；7．42-7．48(m，1H，CH-N-CH-CH-CH)；7．62-7．33(m，4H，亚苯基)；7．98-8．04(m，1H，CH-N-CH-CH-CH)；8．30(d，1H，CONH)；8．53(dd，1H，CH-N-CH-CH-CH)；8．83(d，1H，CH-N-CH-CH-CH)；N-〔(2S)-3-巯基-2-苯基甲基丙酰〕-4-(2-吡啶基)-L-苯丙氨酸(化合物22)m．p．157-159℃质谱(C．I．)(M+H)+=4211H-NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ(ppm)1．87(b，1H，SH)；2．23-3．19(m，7H，S-CH2-CH-CH2，CONH-CH-CH2)；4．44-4．45(m，1H，CH-COO)；7．09-7．93(m，8H，N-CH-CH-CH-CH-苯基)；7．30-7．99(m，4H，亚苯基)；8．29(d，1H，CONH)；8．61-8．65(m，1H，C-N-CH)；N-〔(2S)-3-巯基-2-苯基甲基丙酰〕-4-(2-噻吩基)-L-苯丙氨酸(化合物23)m．p．152-154℃1H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)1．34-1．43(m，1H，SH)；2．44-3．26(m，7H，S-CH2-CH-CH2，CONH-CH-CH2)；4．80-4．89(m，1H，NH-CH-COO)；5．81(d，1H，NH)；7．02-7．52(m，12H，芳基)；
N-〔(2S)-3-巯基-2-苯基甲基丙酰〕-4-(3-噻吩基)-L-苯丙氨酸(化合物24)m．p．169-171℃质谱(C．I．)(M+H)+=426TLC(乙酸乙酯∶己烷∶乙酸=50∶50∶5)，Rf=0．441H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)1．84(bs，1H，SH)；2．23-3．13(m，7H，S-CH2-CH-CH2，NH-CH-CH2)；4．42-4．53(m，1H，NH-CH-COO)；7．12-7．80(m，12H，芳基)；8．30(d，1H，JHH=8．2Hz，NH)；N-〔(2S)-3-巯基-2-苯基甲基丙酰〕-4-(3-呋喃基)-L-苯丙氨酸(化合物25)m．p．140-142℃质谱(C．I．)(M+H)+=410TLC(乙酸乙酯∶己烷∶乙酸=50∶50∶5)，Rf=0．421H-NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)1．79-1．90(m，1H，SH)；2．22-3．11(m，7H，S-CH2-CH-CH2，NH-CH-CH2)；4．41-4．53(m，1H，NH-CH-COO)；7．11-7．50(m，9H，苯基，亚苯基)；6．91-8．12(m，3H，呋喃基)；8．30(d，1H，JHH=8．2Hz，NH)；N-〔3-巯基-2-(3-吡啶基甲基)丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸-立体异构体A(化合物26)m．p．193-196℃质谱(C．I．)(M+H)+=428TLC(二氯甲烷∶甲醇∶乙酸=85∶15∶1．5)，Rf=0．531H-NMR(200MHz，DMSO-d6)δ(ppm)2．37-3．05(m，7H，S-CH2-CH-CH2，NH-CH-CH2)；4．36-4．47(m，1H，NH-CH-COO)；7．76-7．90(m，2H，噻唑基)；7．10-8．33(m，9H，NH，吡啶基，亚苯基)；N-〔3-巯基-2-(3-吡啶基甲基)丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸-立体异构体B(化合物27)质谱(C．I．)(M+H)+=428TLC(二氯甲烷∶甲醇∶乙酸=85∶15∶1．5)，Rf=0．471H-NMR(200MHz，DMSO-d6)δ(ppm)2．28-3．20(m，7H，S-CH2-CH-CH2，NH-CH-CH2)；4．20-4．35(m，1H，NH-CH-COO)；7．70-7．90(m，2H，噻唑基)；7．17-8．40(m，9H，NH，吡啶基，亚苯基)；N-(2-异丁基-3-巯基-丙酰)-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸(化合物28)1H-NMR(200MHz，DMSO-d6)δ(ppm)0．50-1．44(m，9H)；1．68-2．25(m，4H)；2．79-3．22(m，2H)；4．50-4．63(m，1H)；7．34-7．85(m，4H)；7．73-7．90(m，2H)；8．27-8．39(2d，1H)；质谱(C．I．)(M+H)+=393N-〔3-巯基-2-(3-甲氧基苯基)甲基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸(化合物29)质谱(C．I．)(M+H)+=4571H-NMR(200MHz，DMSO-d6+D2O)δ(ppm)2．20-3．21(m，7H)；3．70(d，3H)；4．48(m，1H)；6．55-6．86(m，3H)；7．00-7．40(m，3H)；7．65-7．95(m，4H)；8．27-8．45(bt，CONH)；N-〔3-巯基-2-(2-氟苯基)甲基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸(化合物30)质谱(C．I．)(M+H)+=4451H-NMR(200MHz，DMSO-d6)δ(ppm)2．20-3．18(m，8H)；4．35-4．55(m，1H)；6．85-7．35(m，6H)；7．65-7．90(m，4H)；8．35(d，1H)；N-〔3-巯基-2-(2-噻吩基)甲基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸(化合物31)
1H-NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ(ppm)1．82-3．19(m，8H，CH2-CH2-CH2；NH-CH-CH2)；4．44-4．5(m，1H，CH-COO)；6．62-7．91(m，9H，芳基)；8．42(d，1H，NH)；N-〔3-巯基-2-(2-呋喃基)甲基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸(化合物32)1H-NMR(200MHz，DMSO-d6)δ(ppm)1．79-3．18(m，8H，S-CH2-CH2-CH2；NH-CH-CH2)；4．43-4．58(m，4H，CH-NH)；5．79-7．47(m，3H，呋喃基)；7．30-7．85(m，4H，亚苯基)；7．73-7．91(m，2H，噻唑基)；8．40-8．46(2d，1H，NH)；N-〔3-巯基-2-(3-甲基-5-异噁唑基)甲基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸(化合物33)1H-NMR(200MHz，DMSO-d6)δ(ppm)2．00-2．12(2S，3H，CH3-异噁唑基)；2．28-3．19(m，8H，S-CH2-CH2-CH2；CH2-亚苯基)；4．43-4．59(m，1H，CH-NH)；5．75-6．03(2s，1H，异噁唑基)；7．29-7．86(m，4H，亚苯基)；7．74-7．90(m，2H，噻唑基)；8．46-8．53(2d，1H，NH)；实施例8药理活性的体外评价a)NEP-抑制活性NEP-抑制活性是在按照由T Maeda等人在Biochim．Biophys．Acta 1983，731(1)，115-120中所述的方法制备的鼠肾皮质膜中评价的。
从重约300g的雄性Sprague-Dawley鼠中取出肾并在4℃保持。
小心解剖肾皮质，切细碎并悬浮于1∶15重量／体积的匀浆缓冲液(含1mM MgCl2、30mMNaCl、0．02％NaN3的10mM磷酸钠，pH7．4)中。
然后用Ultra-Turrax匀浆器对组织冷匀浆30秒钟。使大约10ml匀浆在10ml蔗糖(41％重量／体积)中分层并于4℃在固定角转头上以31200rpm离心30分钟。从缓冲液／蔗糖的界面收集膜，用50mMTRIS／HCl缓冲液(pH7．4)洗涤两次并重新悬浮于同一缓冲液中，以小等分试样于-80℃贮存直到使用。
NEP-抑制活性是通过使用由C．Llorens等人在Eur．J．Pharmacol．，69，(1981)，113-116中所述的如同下文报导的方法评价。
如上所述制备的膜悬浮物等分试样(浓度5μg／ml的蛋白质)在氨肽酶抑制剂(苯丁抑制素-1mM)的存在下于30℃预温育10分钟。
加〔3H〕〔Leu5〕-脑啡肽酶(15nM)和缓冲液TRIS／HClpH7．4(50mM)以达到最终体积100μl。
通过加HCl0．1M(100μl)终止孵育(于30℃20分钟)。
代谢物〔3H〕Tyr-Gly-Gly通过在聚苯乙烯柱(Porapak Q)上色谱定量。
在用式Ⅰ化合物和用比较化合物处理的膜制品相对于未处理的膜制品的代谢物生成的抑制百分数表示为IC50(nM)值。
b)ACE-抑制活性ACE-抑制活性是按照由B．Holmquist等人在AnalyticalBiochemistry 95，540-548(1979)中报导的文献的方法评价。
50μM的ACE(250mU／ml从家兔的肺中纯化，EC 3．4．15．1SIGMA)用50μl的式Ⅰ化合物或者参比化合物或相关载体在恒温小池中于37℃预温育。
通过加呋喃基丙烯酰苯丙氨酰甘氨酰氨酸0．8mM(FAPGG-SIGMA)使反应开始。
同时，通过使用带有计算δA／分钟和酶动力学曲线的回归系数程序的Beckman DU-50分光光度计，连续记录340nm的吸收5分钟。
在用式Ⅰ化合物和用比较化合物处理的制品相对于未处理的制品的酶抑制百分数表示为IC50(nM)值。
与化合物16、18-25、27-33和对比化合物Thiorphan和卡托普利的ACE-抑制活性和NEP-抑制活性有关的IC50(nM)值报导于下面的表1中。
表1化合物16、18-25、27-33和Thiorphan以及卡托普利的ACE-抑制和NEP-抑制活性，表示为IC50(nM值)
表1中报导的数据显示本发明目的的式Ⅰ化合物具有显著的混合的ACE／NEP抑制活性。
所述活性与涉及ACE抑制活性的卡托普利的活性相当，而大于涉及NEP抑制活性的Thiorphan的活性。
实施例9“来自体内”的药理活性评价a)NEP-抑制活性来自体内的NEP-抑制活性是按照由M．Orlowsky等人在Biochemistry 1981，20，4942-4950的文献中报导的方法评价。
式Ⅰ化合物的抑制活性是在自发性高血压鼠(SHR)静脉注射(0．6和21μmol／kg)5分钟后和口服给药(30μmol／kg)试验化合物30分钟、60分钟和4小时后的肾中评价。
在从SHR中取出肾后，将肾组织匀浆化并在戊二酰-丙氨酰-丙氨酰-苯丙氨酰-2-萘基酰胺(GAAP)作为底物和氨肽酶M的存在下，在pH7．6于37℃孵育15分钟。
通过加10％三氯乙酸水溶液使反应终止。释出的2-萘胺通过加坚牢紫酱染料(2ml)测定。
酶反应速率通过测量相对于由2-萘胺与坚牢紫酱络合所得标准品在524nm(OD524)的光密度的增加确定。
试验化合物的NEP-抑制活性表示为在SHR肾中的NEP-抑制百分数。
b) ACE-抑制活性来自体内的ACE-抑制活性是通过使用放射试验法，如同由J．W．Ryan等人在Biochem．J．(1977)，167，501-504文献中报导的评价。
式Ⅰ化合物的抑制活性是在自发性高血压鼠(SHR)静脉注射(0．6和21μmol／kg)5分钟后和口服给药(30μmol／kg)试验化合物30分钟、60分钟和4小时后的肺中评价。
在从SHR中取出肺后，将肺组织匀浆化并在〔3H〕Hyp-甘氨酰-甘氨酸底物存在下于37℃孵育2小时。
通过加盐酸使反应终止。
用乙酸乙酯萃取释出的放射性标记的hyppuric acid并按照常规方法通过液体闪烁光谱测定法计数。
试验化合物的ACE-抑制活性表示为在SHR肺中的ACE-抑制百分数。
作为例子，在静脉和口服给药化合物16和比较化合物R-1、R-2、R-3及R-4后的来自体内的试验获得的基底酶活性百分数报导于下面表2中。
表2化合物16和化合物R-1、R-2、R-3和R-4的来自体内的ACE-抑制和NEP-抑制百分数
表2中报导的数据证实本发明目的的式Ⅰ化合物在静脉给药以及口服给药后具有显著的ACE／NEP-抑制活性。
而且，来自体内的式Ⅰ化合物的ACE／NEP-抑制活性产生比比较化合物明显更高的结果。
权利要求
1．式Ⅰ化合物和其药物可接受的盐
其中R是巯基或在生物中可转化成巯基的R4COS；R1是直链或支链C2-C4烷基或芳基或在烷基部分具有从1到6个碳原子的芳烷基基团，其中芳基是苯基或具有1或2个选自氮、氧和硫的杂原子的5或6元杂芳基，其可被1或多个取代基取代或不取代，相同的或不同的，取代基选自卤素原子、羟基基团、烷氧基、烷基、烷硫基、在烷基部分具有从1到6个碳原子的烷基磺酰基或烷氧基羰基基团、含1或多个氟原子的C1-C3烷基基团、羧基基团、硝基基团、氨基或氨基羰基基团、酰氨基基团、氨基磺酰基基团、在烷基部分具有从1到6个碳原子的单-或二-烷基氨基或者单-或二-烷基氨基羰基基团；R2是氢原子、直链或支链C1-C4烷基或苄基基团；R3是由具有1或2个选自氮、氧和硫的杂原子的5或6元芳杂环取代的苯基，作为苯基和杂环基团，可以被一或多个取代基取代或不取代，可以相同或不同，如对R1所指出的；R4是直链或支链C1-C4烷基基团或苯基基团；用星号标记的碳原子是立体结构中心；
2．根据权利要求1的式Ⅰ化合物，其中R3是在4位被一杂环基取代的苯基基团。
3．根据权利要求2的式Ⅰ化合物，其中R1表示选择性地被一或多个取代基取代的芳烷基，相同或不同的，取代基选自卤素原子、羟基、烷基或烷氧基。
4．根据权利要求3的式Ⅰ化合物，其中R1表示选择性地被1或多个取代基取代的苯基烷基，相同或不同的，取代基选自卤素原子、羟基、烷基或烷氧基基团。
5．根据权利要求1的式Ⅰ化合物，以与选自钠、锂和钾的碱金属的盐的形式。
6．根据权利要求1的式Ⅰ化合物的制备方法，包括在式Ⅱ化合物
其中R和R1具有上面报导的意义；与式Ⅲ的苯丙氨酸衍生物之间的反应
其中R2和R3具有上面报导的意义。
7．根据权利要求1的含治疗有效量的掺在药用载体中的式Ⅰ化合物的药物组合物。
8．根据权利要求6的药物组合物，用于治疗心血管疾病。
9．一种心血管疾病治疗方法，包括给予治疗有效量的根据权利要求1的化合物。
10．选自下列的化合物及其立体异构体(2S)或(2R)N-(3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰)-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸甲酯；N-(3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰)-4-(2-吡啶基)-L-苯丙氨酸甲酯；N-(3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰)-4-(3-吡啶基)-L-苯丙氨酸苄酯；N-(3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰)-4-(2-呋喃基)-L-苯丙氨酸甲酯；N-(3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰)-4-(5-嘧啶基)-L-苯丙氨酸乙酯；N-(3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰)-4-(2-吡嗪基)-L-苯丙氨酸甲酯；N-(3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰)-4-(2-噻吩基)-L-苯丙氨酸甲酯；N-(3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰)-4-(3-噻吩基)-L-苯丙氨酸甲酯；N-(3-苯基羰基硫代-2-苯基甲基丙酰)-4-(3-呋喃基)-L-苯丙氨酸甲酯；N-〔3-苯基羰基硫代-2-(3-吡啶基甲基)丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸甲酯；N-(3-巯基-2-苯基甲基丙酰)-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸；N-(3-巯基-2-苯基甲基丙酰)-4-(2-吡啶基)-L-苯丙氨酸；N-(3-巯基-2-苯基甲基丙酰)-4-(3-吡啶基)-L-苯丙氨酸；N-(3-巯基-2-苯基甲基丙酰)-4-(2-呋喃基)-L-苯丙氨酸；N-(3-巯基-2-苯基甲基丙酰)-4-(5-嘧啶基)-L-苯丙氨酸；N-(3-巯基-2-苯基甲基丙酰)-4-(2-吡嗪基)-L-苯丙氨酸；N-(3-巯基-2-苯基甲基丙酰)-4-(2-噻吩基)-L-苯丙氨酸；N-(3-巯基-2-苯基甲基丙酰)-4-(3-噻吩基)-L-苯丙氨酸；N-(3-巯基-2-苯基甲基丙酰)-4-(3-呋喃基)-L-苯丙氨酸；N-〔3-巯基-2-(3-吡啶基甲基)丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸；N-〔3-乙酰基硫代-2-(3-甲氧基苯基)甲基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸甲酯；N-〔3-乙酰基硫代-2-(2-氟苯基)甲基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸甲酯；N-〔3-苯基羰基硫代-2-(2-噻吩基)甲基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸甲酯；N-〔2-(2-呋喃基)甲基-3-苯基羰基硫代-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸甲酯；N-〔2-(3-甲基-5-异噁唑基)甲基-3-苯基羰基硫代-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸甲酯；N-〔3-巯基-2-(3-甲氧基苯基)甲基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸；N-〔3-巯基-2-(2-噻吩基)甲基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸；N-〔3-巯基-2-(3-甲基-5-异噁唑基)甲基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸；N-〔2-(2-氟苯基)甲基-3-巯基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸；N-〔2-(2-呋喃基)甲基-3-巯基-丙酰〕-4-(2-噻唑基)-L-苯丙氨酸。
全文摘要
本发明涉及了式Ⅰ化合物,其中R、R
文档编号C07D333/24GK1206411SQ96199354
公开日1999年1月27日 申请日期1996年12月17日 优先权日1995年12月28日
发明者F·佩拉希尼, M·范图西, G·诺希尼, S·罗马格纳诺, F·森坦戈罗, C·塞莫拉罗 申请人:萨宝集团公司