专利名称：抑制肿瘤生长的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制人体肿瘤生长的药物，具体地讲涉及抑制肿瘤生长的反义寡脱氧核苷酸药物。
众所周知，蛋白质在人体代谢的每一环节都起着核心的作用。几乎所有的人体疾病都起因于不适当蛋白质的产生、蛋白质的不适当产生或蛋白质的功能紊乱。传统的药物被设计用来与引起疾病的体内蛋白质分子相互作用。而反义核酸药物则是用来抑制导致疾病的蛋白质的产生。因此，与传统药物相比，核酸药物具有高选择性、高有效率及低副作用等特点。在抑制肿瘤方面，与传统抗癌药物相比，反义核酸药物显示更强的优势。已有许多有关反义核酸药物在完成临床前期的研究和开发后进入临床一、二期试验(Stein CA.et al(1994)Curr.Opin.Onco，6587-594)，尤其在人体肿瘤(Tseng BY.et al.(1994).Cancer Gene Therapy，1(1)65-71)、病毒、AIDS疾病等方面的临床应用(Crooke ST.(1995).Hematologic Pathology，9(2)59-72)的成功报导。
作为新一代的生物技术基因治疗的方法之一，反义寡脱氧核苷酸(简称反义核酸)是当今生物技术制药业上的一个崭新领域，也是医药卫生业的发展方向。反义核酸新药是特异的一小段核酸，其碱基顺序与信使核酸的某一片段呈镜象结构或互补结构，其生物功能是在体内作用于与疾病发生有关的基因。它与信使核苷酸相杂交，阻止信使核酸转译蛋白质，从而阻断了引起疾病的蛋白质在信息传递中的作用，最终达到治疗和抑制病情发展的目的。
Raf激酶基因编码对丝氨酸苏氨酸特异的蛋白激酶，这种蛋白激酶在有丝分裂信号传导途径中起着重要作用。Raf一旦被激活就可以通过直接激活有丝分裂原激活蛋白激酶的激酶(MEK)，引起细胞的无限制增殖，导致肿瘤的发生。大量事实表明，raf激酶在人体肿瘤的发生、发展和维持方面起着直接的作用。针对raf激酶的治疗被证明在治疗与ras有关的肿瘤方面十分有效。raf基因的突变可以转化细胞并且其突变与人体肿瘤的发生有关。发现在小细胞肺癌和乳腺癌病人中有不正常的高水平的c-raf激酶mRNA和蛋白质的表达。
过去的实验结果表明，c-raf-1激酶对人体许多种肿瘤的发生和发展起关键作用(Johnson BE.et al.(1993).Chest，103(1 suppl)15-25；VainioH.(1995).J.of Occupatioanl & Enviromental Medicine，37(1)69-76)。c-raf-1最初是在鼠类肉瘤病毒产生的肿瘤中发现的(Rapp UR.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，804218-4222)，随后在人体中也发现了c-raf-1激酶(Bonner TI.et al. Nucleic Acids Res.14(2)1009-1015)；与此同时，科学家搞清了c-raf-1的基因序列及主要功能。根据功能分类，c-raf-1属于原癌基因类(Rapp UR.et al. The Oncogene Handbook，pp 215-253，Elseiver，Amsterdam)。Raf-1的主要功能是与致ras癌基因蛋白相结合，并把信息通过细胞表面受体传递到细胞核中，引起细胞增殖。在人体多种癌发生病例中，由ras基因突变所引起的大约占50％以上。因此阻断c-raf-1激酶信使核酸的表达，使Ras不能与Raf-1相结合，从而使Ras蛋白失去致癌功能。这会对由Ras所引发的肿瘤具有相当有效的治疗效果。
各种疾病、特别是癌症和肿瘤正日益威胁着人类的健康，因此迫切需要开发出一种新药，将肿瘤和癌扼杀在其孕育阶段或阻抑在其早期阶段。本发明针对Raf基因的非转录区，通过生物化学方法，合成了一系列反义核酸并从中筛选出了对肿瘤有特异性抑制作用的一段核酸序列。因此，本发明的目的在于提供一种新的抑制人体肿瘤生长的核酸药物及其应用。
本发明以Raf基因非转录区的5′端、3′未端或转录的起始端为模板，设计了25个反义核酸。采用改进的磷酸硫代化方法，在DNA合成仪上分别合成了25个相应的反义核酸，其长短均为20个核苷酸。所述反义核酸的攻击目标分别位于Raf均5′端(15个)、3′末端(9个)及起始端(1个)。将它们分别定名为AntiSensel-25。采用人体肿瘤细胞作为靶受体，对合成的反义核酸进行初步筛选。筛选的结果表明AntiSense21有特异地抑制多种肿瘤的功能。本文自此将AntiSense21命名为ASD20。ASD20的核苷酸碱基组成如下所示5′-TGGGCTGTTTGGTGCCTTAT-3′此物质是20个脱氧核苷酸以氧-氧连接的磷酸硫代化物，攻击目标位于c-raf-1基因的3′末端。它与c-raf-1信使核酸相结合，阻止Raf-1蛋白的产生，抑制了Ras的功能，最终抑制肿瘤的发展。以对照相比，其抑制Raf激酶的活性高达90％。当浓度低于250nM时，ASD20的抑制活性是浓度依赖的。浓度高于250nM时，抑制活性的大小不随浓度的增加而增大。核苷酸碱基突变(突变碱基数为1-5个)试验表明ASD20 D的碱基序列对c-raf-1具有特异性。活体试验说明当注射剂量低于5.0mg/公斤体重/每天时，ASD20对肿瘤的抑制活性随着浓度的增加而增强。
ASD20是脱氧寡核苷酸的钠盐，因此它在体内可有效地抵制核酸酶的降解。在肿瘤和癌症的治疗方面显示出诱人的前景。通过一系列药物动力学、药理、毒理、及药物在生物体内的稳定性试验，结果表明此药物适用于进一步的治疗人体肿瘤的临床应用，在临床上可用来单独使用或与其他化疗药剂结合使用。
图1显示反义核酸ASD系列对c-raf-1基因表达的抑制特异性。其中N代表核酸杂交法分析的结果；W代表蛋白质的杂交分析结果；A代表Raf激酶活性的测定结果；以无处理作对照，并将之定为100％图2A显示反义核酸ASD20的浓度对HepG2人体肿瘤细胞内c-raf-1信息核酸表达的影响，以对照无处理为100％。
图2B为ASD20对c-raf-1蛋白质表达的抑制的蛋白质杂交的结果。
图2C为ASD20的浓度以及突变数对c-raf-1 mRNA抑制的Northern杂交的结果，以β-肌动蛋白校准扫描值。
图3显示反义核酸ASD20(250nM)的处理时间对抑制c-raf-1信息核酸表达的影响及多次处理对表达的影响。①表示一次处理结果，②表示二次处理结果，箭头所指处是第二次处理的时间。
图4显示反义核酸ASD20碱基变异体对抑制c-raf-1信息核酸表达的影响。(C)表示对照，(A)表示ASD20处理的结果。
图5显示反义核酸ASD20的核苷酸长度对抑制c-raf-1信息核酸表达的影响。(C)表示对照，(A)表示反义核酸处理的结果。
图6显示ASD20反义核酸对植入小鼠体内的肿瘤生长的影响。(C)表示对照。(ASDCO)表示对照反义核酸，即反义核酸的碱基序列组成是无特异性的、随机的。ASD20①表示一次处理(ASD20②〕表示经过二次处理的结果。
图7显示反义核酸ASD20的浓度对植入小鼠体内肿瘤生长的影响。
A.是人体HT29肿瘤细胞植入小鼠体内后的结果。
B.用人体HepG2肿瘤细胞植入小鼠体内后的结果。
C.对照无处理的结果，其余的数字指的是处理浓度单位(毫米/公斤/每天〕图8显示反义核酸ASD20的碱基变异体对植入小鼠体内肿瘤生长的影响。(C)是指的以ASD20原体作为对照，其余的数字1-4指的是变异的碱基数。
下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的阐述实施例1反义核酸攻击目标的确定及反义核酸的合成在基因图谱上选定反义核酸攻击的目标(20)。该目标选在Raf基因的非转录区的5′端(15个)、3′未端(9个)及信息转录的起始端(1个)。采用美国应用生物系统公司(AppliedBiosystems)制造的394型DNA合成仪及其配套试剂，以改进的磷酸硫代化(Phosphorothioate)方法合成所设计的反义核酸。合成原料均由合成仪生产厂商提供(其他公司生产的原料也可代替)。主要原料为二异丙基β-氰乙基亚磷酰胺单体(腺苷、鸟苷、胸腺嘧啶苷、胞嘧啶苷)、乙腈、四唑、氢氧化氨。盖帽物试剂为醋酸酐/二甲基吡啶/四氢呋喃和1-甲基咪唑/四氢呋喃。氧化反应试剂为二硫化四乙基秋兰姆(TETD)/乙腈。脱三苯甲基作用试剂为三氯醋酸/二氯甲烷。合成流程如下1.1号瓶乙腈的流量是1.7毫升/分，该瓶内装有亚磷酰胺腺苷，用来控制和校准亚磷酰胺单体和四唑的流速。亚磷酰胺单体的浓度为每10毫升无水乙腈其量为0.5克。
18号瓶乙腈的流量是1.8毫升/分，该瓶是用来控制和校准盖帽物试剂、二硫化四乙基秋兰姆(TETD)、三氯醋酸和乙腈的流量。
2.合成柱是具有0.2微摩尔流量控制孔，孔直径为1000埃的玻璃柱。
3.合成过程进量全由电脑自动控制，试剂浓度和加量均按照手册操作，在此不详细说明。合成的核酸被收集在4毫升的玻璃瓶内。
4.氢氧化氨需要天天更换，用真空离心方法(42度)使合成的粗产品中的氢氧化氨挥发。
5.合成的核酸用酒精萃取两次，将干燥后的核酸溶于10mMTris-HCl，0.4 mM EDTA(PH7.6)的缓冲液中。
6.使用MonoQHR5/5pH12.5型FPLC离子交换层折柱(Pharmacia公司)对合成的反义核酸去离子和去盐以纯化之。
7.最终产品在冷冻干燥器内冷冻干燥得白色粉末状最终产品。将其储存在-20℃度。
8.以已知的各种方法对产品进行分析如用SDS-PAGE电泳鉴定分子量大小用HPLC高压液相色谱鉴定纯度及浓度。
实施例2以培养细胞初步筛选反义核酸选用人体HT29(大肠)HepG2(肝)肿瘤细胞系做为初步筛选试验的受体。参照Miwa W.等的文献(Miwa W.et al.(1994)Biological Chemistry Hoppe-Seyler，375(10)705-709)对培养于RPM1640中的肿瘤细胞进行如下处理。分别将HT29细胞和HepG2细胞分成对照(无处理)和反义核酸处理组。在1640培养液中，使细胞培养至105。处理组分别用250nM的反义核酸处理。24小时后提取c-raf激酶的mRNA和蛋白质进行定量监测。反义核酸处理后分别采样做核酸杂交(Northem blot)(Sambrook J.et al.Molecular CloningA Laboratory Manual，2nded.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)或蛋白印迹(Western blot)(Alessi DR.et al.Methods in-Enzymology 25279-290)及Raf活性测定(Harlow E.et al.(1988).AntibodiesA Laboratory Manual，2nd ed.ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。核酸杂交和蛋白质杂交的结果由Phamacia Image Master扫描仪扫描定量得出。以对照组细胞的c-raf激酶的mRNA和蛋白质的含量为100％。三种方法的结果如图1所示。从图1可清楚地看到反义核酸AntiSense21(ASD20)具有最高的肿瘤抑制活性。用三种方法检测，其抑制Raf激酶的活性均高于90％。所以选择ASD20作为进一步测试和研究的对象。
实施例3 ASD20的碱基组成结构将合成后经纯化的ASD20用碘处理，将磷酸硫酯键转化为磷酸二酯键，然后用常规的DNA测序方法测定ASD20的核苷酸组成。试验结果如下所示5′-TGGGCTGTTTGGTGCCTTAT-3′与设计序列一致。以10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳测定ASD20D分子量，分析结果为6880与理论分子量6883.946道尔顿相符。此物质是20个脱氧核苷酸以氧-氧连接的磷酸硫代化物，是脱氧寡核苷酸的钠盐。其攻击目标位于c-raf-1基因3′末端。
实施例4 ASD20的浓度对c-raf-1抑制的影响将不同浓度(从10nM至1000nM)的ASD20加入到HepG2细胞生长于其中的1640培养基中，测验ASD20的浓度对c-raf-1转录的影响，结果如图2A所示。当浓度低于250nM时，抑制程度随著浓度增高时而增强。当浓度高于250nM时，抑制性显然达到了极限，增加浓度也没有明显的进一步的作用(参见图2B)。半抑制性浓度(IC50)剂量大约为70nM。以下的实验均采用250nM作为试验浓度。从图2C可明显看出ASD20对HepG2和HT29细胞的c-Raf-1蛋白质的转译均有抑制作用。抑制Raf-1活性的时间大约能持续48至60小时，最大抑制高峰时间为24小时(参见图3)，所以为了持续抑制体内Raf-1活性，需要每隔24至48小时处理一次以达到长时间抑制作用。
实施例5 ASD20的序列对c-raf-1转录抑制的影响在鉴定ASD20的特异性时，采用核苷酸碱基突变法(突变数为1至5个)，以ASD20原体(非突变体)作为对照。处理结果如图4所示，当突变数达到2个时，抑制性减少大于50％，当实变数超过3个时，抑制性几乎完全丧失。这说明了ASD20的碱基序列对c-raf-1信使核酸有特异性。利用已知的基因库来测试ASD20是否与已知的基因有相同的序列，计算机序列分析表明没有相同碱基数超过14个的序列存在，所以ASD20对其他基因的非特异性抑制会非常低。在测定核苷酸长度对抑制性的影响时，选择了17至22个核苷酸长度的来分别测定抑制性，结果表明最有效的长度是20个核苷酸，当核苷酸长度缩小到17个时，抑制性减少至40％左右，当长度高于20时，抑制性反而减少(图5)。所以实验结果表明，采用20个核苷酸的长度最适合。
实施例6 ASD20具有抑制人体肿瘤细胞快速繁殖的特性以人体肿瘤细胞HepG2为试验对象，试验设无处理对照、对照反义核酸处理(ASDCO)、和反义核酸ASD20处理，后两者的浓度均为250nM。细胞起始培养数为10万，细胞数每隔24小时计数一次，持续7天。结果如图6所示，表明ASD20具有显著地抑制肿瘤细胞繁殖的特性。与无处理对照和对照反义核酸处理的细胞繁殖数相比，生长速度显著地减少。对细胞繁殖抑的制在第四天达到最大限度，随后细胞生长速度开始返回到接近于对照细胞的生长速度。从图中还可看到第一次处理48小时后再处理一次，细胞生长速度的抑制性可以维持至第七天(图6)，而且如前所述该抑制性是浓度依赖性的。
实施例7 ASD20对体内肿瘤生长的抑制作用采用去胸腺裸鼠(Balb/c小鼠)分别植入预先经过ASD20处理或未经处理的(对照)人体HepG2和HT29肿瘤细胞。在5至10天的观察过程中发现，经ASD20处理过的肿瘤细胞在植入体内后其肿瘤形成受到抑制，没有明显肿瘤形成，而对照小鼠明显可见有肿瘤(大约150立方毫米左右)形成。在另一项研究中，先植入肿瘤细胞，当肿瘤达到50立方毫米后(大约经4至5天)静脉注射不同浓度的ASD20，每隔24小时注射一次，注射浓度为0.1、0.5、1.0、5.0和10mg/公斤体重/每天；对照注射使用ASDCO(也是20个核苷酸长度但碱基序列是非特异性的)。结果表明各个浓度对肿瘤生长均具有不同程度的抑制性，抑制性随浓度增加而增强。当浓度为5.0mg/公斤体重/每天时，抑制达到了极限，因为抑制性不在随着浓度的增加而增强。图7A和B显示ASD20对试验的二种肿瘤细胞均有很强的抑制作用。对照ASDCO的结果显示它对肿瘤无抑制作用。在另一组实验中，注射与碱基序列有1至5个差异的反义核酸，结果如图8所示。当差异为1至2个时，与ASD20原体相比，抑制性分别丧失50％和90％；当差异在2个以上时，抑制性几乎完全丧失。这说明ASD20的碱基序列对肿瘤的抑制有特异性。ASD20对体内c-raf-1信使核酸表达的抑制分析结果与自细胞培养测定得到的相似。
勿用赘言，本发明的反义核酸药物可与其它药物学上可接受的载体和/或赋形剂一起使用，也可用本领域技术人员熟知的技术将之包被起来或使之胶囊化。虽然本发明仅对静脉给药作了详述，其它的给药方式如口服给药、腹膜内给药、皮下给药以及这些方式的组合等对于本发明也是适用的，这一点在本领域的普通技术人员看来是而易见的。
权利要求
1.一种反义核酸，其特征在于具有5′-TGGGCTGTTTGGTGCCTTAT-3′的核苷酸序列。
2.权利要求1的反义核酸，其特征在于它与Raf基因的3′端互补。
3.权利要求1或2的反义核酸，其特征在于用于制备治疗肿瘤和/或癌症的药物。
全文摘要
人工合成了一小段特异核苷酸,其基因序列顺序与人体肿瘤生长因子c－raf－1基因的3’端互补。利用这一片段核酸在体内能特异地与人体c－raf－1信使核糖核酸(mRNA)相杂交特性,从而用来阻止核酸的转译并最终抑制或减少c－raf激酶的表达。这一小片段核酸被称为c－raf－1反义核苷酸,该反义核酸可作为抗癌、抑制人体肿瘤生长的药物。
文档编号C07H21/00GK1194985SQ97101958
公开日1998年10月7日 申请日期1997年3月27日 优先权日1997年3月27日
发明者梁旻 申请人:中生北方生物工程开发研究所