专利名称：冰晶生长抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明的目标是冰晶生长抑制剂、该制剂的制备方法和生产食品中使用这种制剂的方法。
众所周知，冰晶生长抑制剂称作“热滞蛋白质”，具有结合冰晶和降低其生长的能力[《生物物理杂志》(Biophysical Journal)，1991年2月，第409-418页]。这种制剂的两个性能已经得到证实它们具有降低溶液的表观凝结温度而不影响其解冻温度的能力，它们还具有抑制冰晶重结晶的能力[《低温生物学》(Cryobiology)25卷，1988年，第55-60页]。
此外，三种冰晶生长抑制剂特别被证实存在于北极和南极的某些鱼类体中(《FASEB杂志》1990年5月号，第2460-1468页)。这些制剂具有蛋白质或者糖蛋白类的结构。它们从这些鱼的血浆或血清中分离出来，然后提纯。但是它们也存在于其它的组织当中。
人们还知道，使用冰晶生长抑制剂来改善食品如冻结甜食、果冻或者新鲜食品如西红柿的质量。DNA设备技术公司合成了一种人造蛋白质，这是一种冰晶生长抑制剂，它与在很低温度下生长的某些鱼类或其它生物体内发现的很相似。[《食品加工》(Food Processing)1992年10月号，第55页]。
但是，当前还没有从绵鳚这种生活在挪威和波罗的海的鱼中分离出任何的冰晶生长抑制剂。
本发明的目标是提供一种新型的冰晶生长抑制剂，它具有明显的活性，特别适合使用于比如食品等产品的冻结或增稠。
为此，根据本发明的冰晶生长抑制剂是从绵鳚鱼中提取的制剂，其分子量为4-5.5kDa，可以通过如下的方法得到，即提取绵鳚的血清、分离血清蛋白、通过凝胶过滤分离出蛋白质和分离热滞后值为1-1.8℃的蛋白质部分。
此冰晶生长抑制剂优选具有1.3-1.5℃的热滞后值。
我们意外地观察到，当食品如冰、冻结甜食或果冻冻结时，这种冰晶生长抑制剂能够有效地降低冰晶的尺寸，这样就使这些食品的组织更加稠腻。
在后面的叙述中，将使用“晶体抑制剂”这个词表示“冰晶生长抑制剂”的意思。
在后面的叙述中，将使用“晶体的典型尺寸”这个词表示“最常见的冰晶尺寸”的意思。
在后面的叙述中，将使用“当量直径”这个词表示“具有和所考虑的晶体的形象相同表面积的圆的直径”的意思。
在制备按照本发明的冰晶生长抑制剂提取液的方法中，我们制备含有所述制剂的绵鳚鱼血清。
为此，例如可以提取绵鳚鱼的血液，可以将其冷却，可以回收含有冰晶生长抑制剂的绵鳚血清的表面浮液，然后可以冻结该表面浮液。
可以借助于处理过的毛细管，特别是用比如肝素钠处理过的毛细管来提取绵鳚鱼的血液。
可以将绵鳚鱼的血液冷却至0-5℃，特别是要抑制血液中所含的比如蛋白酶和肽酶的活性。
可以在0-5℃下，将绵鳚鱼血在1000-5000g的离心机中离心比如5-15分钟，以回收含有冰晶生长抑制剂表面浮液的绵鳚鱼血清。为此，可以使用比如Heraeus Minifuge GL型离心机，这是由Heraeus股份有限公司(23,Jeunes路，瑞士联邦-1227卡洛-维也纳)出售的。
可以在比如-15～-40℃的温度下冻结表面浮液。
本发明也涉及减小冰晶尺寸的方法，在该方法中，至少向食品中加入一份从绵鳚鱼中提取的冰晶生长抑制剂。特别可以在制备食品的过程中向食品中加入0.01-10％的根据本发明的冰晶生长抑制剂。
然后可以比如冷冻如此制备的食品。特别是可以冷冻至-15～-40℃。
借助于生物化学数据和借助于所测定的不同性能，特别是借助于后面的不同的测试方法，来更加详细地叙述本发明的晶体生长抑制剂。如无特别的说明，百分比都是重量百分比。
在绵鳚鱼血清存在下，在20％的蔗糖溶液中显示冰晶的结晶制备6份各1mL的20％蔗糖溶液的试样，向其中加入不同浓度的含有晶体抑制剂的绵尉鱼血清。
将试样保存在冰箱中，然后放在Polyvar型显微镜(这是Reichert-Jung公司的产品，地址Harnalser Hauptstrasse 219，AT-1170 Wien)下，借助于Lincam型温度控制器(Lincam科学仪器公司的产品，地址Epsom DoWn Metro Centre,Waterfield,Tadworth,Surrey,KT205HT-UK)将其迅速冷冻到-100℃的温度。
然后再将试样加热到-9℃的温度，在30-120分钟的时间间隔内，在Polyvar型显微镜下观察在如此制备的试样中得到的晶体的尺寸。
同时，在相同的条件下制备含有1mL20％蔗糖溶液的对照组试样。
得到不同体积百分比的被加入到20％庶糖溶液中的含晶体抑制剂的绵鳚鱼血清。
试样1在1mL的20％蔗糖溶液中，加入1.3％的绵鳚鱼血清，然后如上所述制备试样。在-9℃下60分钟以后，晶体的典型尺寸小于2μm。没有观察到晶体尺寸随时间的进行而有任何变化。
试样2在1mL的20％蔗糖溶液中，加入1％的绵鳚鱼血清，然后如上所述制备试样。在-9℃下30分钟以后，晶体的典型尺寸小于2μm。没有观察到晶体尺寸随时间的进行而有任何变化。
试样3在1mL的20％蔗糖溶液中，加入0.1％的绵鳚鱼血清，然后如上所述制备试样。在-9℃下30分钟以后，晶体的典型尺寸小于15μm。随着时间的进程晶体尺寸仅有非常微小的变化。在-9℃120分钟以后，晶体的典型尺寸仍然小于15μm，晶体具有轮廓分明的形状。
试样4在1mL的20％蔗糖溶液中，加入0.02％的绵鳚鱼血清，然后如上所述制备试样。在-9℃下60-90分钟内，晶体的尺寸变化不大，在-9℃下90分钟以后，晶体的典型尺寸小于20μm。晶体具有轮廓分明的形状。
试样5在1mL的20％蔗糖溶液中，加入0.013％的绵鳚鱼血清，然后如上所述制备试样。观察到与用0.02％的绵鳚鱼血清制备的试样同样的晶体尺寸的变化。在-9℃下90分钟以后，晶体的典型尺寸超过20μm。晶体具有轻微的周角形状。
试样6在1mL的20％蔗糖溶液中，加入0.01％的绵鳚鱼血清，然后如上所述制备试样。观察到比用0.013％的绵鳚鱼血清制备的试样更大的晶体尺寸的变化。而且，晶体具有比用0.013％的绵鳚鱼血清制备的试样更圆的形状。在-9℃下90分钟以后，晶体的典型尺寸超过25μm。
对照试样如上所述制备20％蔗糖溶液，但是不加入绵鳚鱼血清。晶体迅速地长得更大。其形状呈圆形，在-9℃下90分钟以后，晶体的典型尺寸超过25μm。
因此，如果在20％的蔗糖溶液中加入浓度为1.3-0.013％的绵鳚鱼血清，在显微镜下观察到比较小的冰晶，其尺寸随时间只有极小的变化。
相反，如果在20％的蔗糖溶液中加入极小浓度的绵鳚鱼血清，则冰晶增长得就更快更大。
试样6和对照试样之间在冰晶形状和冰晶尺寸上观察到的差别非常小。
如果在20％的蔗糖溶液中所含的绵鳚鱼血清浓度为0.01-10％，则观察到，与不含有所述血清的对照溶液的晶体相比，该晶体具有更加轮廓分明的形状。
测量热滞后借助于Clifton Nanolitre Osmometre型温度控制仪(Clifton技术物理公司制造，地址P.O.Box.Hartford,US-New York,12830)和Wild MZ8型立体显微镜(Leica A.G.公司制造，地址Verkaufgesellschaft,Kanalstrasse 21,CH-8152 Glattbrugg)进行这项分析。
为了进行分析，在环境温度下，提取20mL绵鳚鱼血清试样，在置于温度控制仪中的容器中进行沉淀。所述的容器中装有液体石蜡。在进行了快速冻结之后进行逐步解冻，借助于立体显微镜观察晶体的解冻。然后放慢速度，停止解冻，使留下的小尺寸单晶稳定化，注意此时的温度。这个温度就是解冻点。然后慢慢地重新冻结，注意晶体开始生长的温度。这个温度就是表观冻结点。
这时通过计算表现冻结点和解冻点之间的差值来计算热滞后的数值。绵鳚鱼血清级份的热滞后值是1.4℃，对于含有那种制剂的鱼来说此数值相当高。
由绵鳚鱼血清提取的冰晶生长抑制剂的特征通过色谱分析，然后在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离来说明由绵鳚鱼血清提取的冰晶生长抑制剂的特征。
因此首先进行色谱分析。为此，在带有Waters 519泵的superose12柱子(Pharmacia Biotech A.G.公司制造，地址Dubendorf,CH,)和DAD Waters 990检出器(Waters A.G.公司制造，地址Volketswil,CH)上分离出含在绵鳚鱼血清的20mg蛋白质。为了进行液相色谱分离，使用150mM、pH7.8、流量0.5mL/min的碳酸铵缓冲液作为移动相。
由色谱流出液进行在“热滞后测量”测试中叙述的热滞后测量。这样证实了一个事实，这就是在30-33分钟之间的流出液是含有由绵鳚鱼血清得到的冰晶生长抑制剂的级份，然后就在这个级份测定最大热滞后。
这时，通过凝胶电泳浓缩和分离具有热滞后活性的这个级份。在100V下，在带有Mini ProteanⅡ(BIO-RAD公司制造，地址Glattburg,CH)仪器的预制Ready凝胶(BIO-RAD公司制造，地址Glattburg,CH)上，在100分钟内进行此分离。
在着色以后，通过与在同样的凝胶上分离的26.6-1.4kDa的分子量标准谱(BIO-RAD公司制造，地址Glattburg,CH)进行比较，评估这个级份蛋白质的分子量。
这样就证实了热滞后活性级份的蛋白质的分子量为4-5.5kDa。
热对于在绵鳚鱼血清中所含的晶体生长抑制剂活性影响的研究在40℃、50℃、60℃、70℃和80℃加热绵鳚鱼血清试样2小时，然后测量这些试样的热滞后。将不同试样的热滞后值与保存在环境温度下的绵鳚鱼血清试样的热滞后值进行比较。
为此，按照“热滞后测量”测试中叙述的方法操作。
在下面的表Ⅰ中给出了这些血清试样的热滞后值。
表Ⅰ
由此测得的热滞后值证实了一个事实，在绵鳚鱼血清中的晶体抑制剂具有很大的热稳定性。这是该制剂用于高温阶段食品加工过程的一个优点，特别是在介入灭菌阶段的过程中。
绵鳚鱼血清浓度对热滞后值的影响的论证用二次蒸馏水稀释绵鳚鱼血清的试样，按照在“热滞后值的测定”测试中叙述的方式测量这些试样的热滞后值。
这些血清的热滞后值列于下表Ⅱ中。
表Ⅱ
由此得到的结果证实了，热滞后值取决于绵鳚鱼血清试样的浓度。这个依存关系不是线性的。
在鱼类血清中所含的晶体生长抑制剂活性的比较研究测量由大西洋鳕鱼(生活在纽芬兰岛沿岸的一种鱼)、青鳕鱼(生活在地中海沿岸到挪威北部的一种鱼)、金黄虾虎鱼(生活在欧洲沿岸和日本沿岸的一种鱼)、蝎床杜父鱼(生活在北冰洋和挪威沿岸的一种鱼)、狮子鱼(生活在南极洲沿岸的一种鱼)和海刺鱼(生活在比斯开湾至挪威北部的一种鱼)提取的血清试样的热滞后值。将这些不同的试样的热滞后值与绵鳚鱼血清试样的热滞后值进行比较。
各种鱼是冬季在挪威湾捕获的，在杀死后最多3小时用这些鱼提取的血清试样进行热滞后值的测定。
为此，按照“热滞后的测定”中所述的测试方式进行测试。这些血清试样的热滞后值列于下表Ⅲ中。
表Ⅲ
由此所得的结果证实，在绵鳚鱼血清中所含的晶体抑制剂具有高于在其它的生活在相似条件下鱼类的血清中所含的晶体抑制剂的活性。
测量含有绵鳚鱼血清的冰淇淋中冰晶的尺寸测定含有绵鳚鱼血清的冰淇淋中的冰晶尺寸，然后将此结果与在相同的条件下生产的，但不含有绵鳚鱼血清的冰淇淋中的冰晶尺寸进行比较。
为此，使用含有0.05％的储存在-40℃下的绵尉鱼血清的冰淇淋。从冰淇淋在中间切下1cm3的一块，将其转移到-10℃的冰冻室中。
在-10℃的硅橡胶管中制备含有3mm3硅脂、3mm3所述的冰淇淋块和7滴石油醚的试样。将管的两端封闭，借助于玻璃棍将内容物混合。
将试样转移到显微镜的载物片上，盖上显微镜的第二块载物片。
将如此制备的试样放到光学显微镜下，在视屏上观察其形象。借助于Gloor Instrumente AG公司(地址Brauereistrasse 10,CH-8610Uster)的PC-IMAGE程序得到晶体的代表性的双轴形象。借助于所述的程序，测量以当量直径表示的晶体尺寸。
在如上所述由不含绵鳚鱼血清的冰淇淋制备的对照试样中测量冰晶尺寸。
然后按照尺寸的判据将含有绵鳚鱼血清的冰淇淋中的冰晶分布与对照试样进行比较。
按照尺寸作为判据，在下面的表Ⅳ中给出了含有绵鳚鱼血清冰淇淋中的冰晶分布(a)和对照组中的冰晶尺寸分布(b)。
表
由表Ⅳ中给出的结果发现在含有绵鳚鱼血清的冰淇淋(a)中小尺寸的晶体数目更多。实际上，可证实的事实是，在含有绵鳚鱼血清的冰淇淋(a)中，晶体主要分布在10-40μm的区域内，同时在对照组(b)中晶体主要分布在20-50μm的区域内。
再有，由全部晶体的尺寸值计算出含有绵鳚鱼血清的冰淇淋中晶体的平均尺寸，并将此数值和对照组中冰晶的平均尺寸进行比较。含有绵鳚鱼血清的冰淇淋中晶体的平均尺寸是27.8μm，而对照组中冰晶的平均尺寸为33.8μm。
在热冲击后测量含有绵鳚鱼血清的冰淇淋中冰晶的尺寸在36小时内对含有绵鳚鱼血清的冰淇淋和对照组试样进行热冲击实验。热冲击包括了几个温度循环，在循环的进程中，先加热到-4℃，然后冷冻到-20℃，最后在-4℃和-20℃的温度范围内再加热和再冷冻。
然后再按照上文测试中所述的方法操作。
以尺寸为判据，将含有绵鳚鱼血清的冰淇淋中的冰晶分布和对照组中的冰晶分布进行比较。
在如下的表Ⅴ中给出了含有绵鳚鱼血清的冰淇淋中的冰晶分布(c)和对照组中的冰晶分布(d)。
表Ⅴ
在表Ⅴ中给出的结果证实，在热冲击之后，加入了含有晶体生长抑制剂的绵鳚鱼血清的冰淇淋中，冰晶的尺寸小于不含有所述血清的冰淇淋中的冰晶的尺寸。
实际上，在绵鳚鱼血清存在下，冰淇淋中76％的冰晶尺寸小于60μm。这时在对照组中只有11％的冰晶尺寸小于60μm。
再有，在绵鳚鱼血清存在下，冰淇淋中只有6％的冰晶尺寸大于100μm。这时在对照组中有38％的冰晶尺寸大于100μm。
最后，由全部晶体的尺寸值计算出含有绵鳚鱼血清并经过热冲击的冰淇淋中的冰晶平均尺寸。然后将此值与对照组中的冰晶平均尺寸进行比较。含有绵鳚鱼血清的冰淇淋中的冰晶平均尺寸是50.8μm，而对照组中的冰晶平均尺寸是96.5μm。
因此就证实了在加入了含有晶体生长抑制剂的绵鳚鱼血清，然后进行热冲击的冰淇淋中，冰晶的重结晶受到了部分的抑制。
加入了绵鳚鱼血清提取液的食品的组织分析为了分析食品的组织，借助于组织分析仪，特别是用Instron有限公司(地址Coronation Road,High Wycombe,Buckes HP12 3SY,UK)的nstron食品测试仪测量粉碎所需的能量。
为此，将食品置于中间挖空的直径40mm的圆形盘子上，将一个底部直径30mm的圆形活塞压在食品的上表面上，同时测量粉碎能。
测量粉碎加入了1g含有晶体生长抑制剂的绵鳚鱼血清提取液，然后冻结并煮熟的的鳕鱼片所需的能量。这时将此测量值与粉碎不加入绵鳚鱼血清提取液，然后也冻结并煮熟的的鳕鱼片所需的能量相比较。
对照实施例将1g绵鳚鱼血清提取液在25g水中混合，将此溶液加入到1kg鳕鱼片中。将它们完全混合，然后分成40g一份。然后将这些分好的各份冻结到-35℃。
为了进行比较，将25g水混入1kg鳕鱼片中，然后将其分成40g一份，以制备对照组试样。此试样也冷冻到-35℃。
将这些40g的试样和对照组的试样放在塑料袋中，然后在70℃下加热。
然后，测量粉碎这些试样和对照组试样所需的能量。比较测量值。
粉碎加入了绵鱼尉鱼血清提取液的鳕鱼片所需的能量是10.9±0.3J/100g，而粉碎未加入绵鳚鱼血清提取液的鳕鱼片所需的能量是12+0.3J/100g。
这些结果证实的事实是，加入了绵鳚鱼血清提取液并冷冻的鳕鱼片在煮熟后比不加入绵鳚鱼血清提取液并冻结的鳕鱼片的组织更加柔嫩。
固体食品组织的显微镜分析为了进行组织的显微镜分析，使用冷冻的显微镜评价存在的冰晶尺寸。
为此，按照在上面对照实施例中叙述的方式制备40g一份的鳕鱼片和对照组试样，在脉冲空气冷冻机将其冷冻至-35℃。
然后在冷冻显微镜下观察此冷冻的40g一份的试样和冷冻的对照组试样，评价和比较这些不同的试样的冰晶尺寸。
证实了这样的事实，加入了含有冰晶生长抑制剂的绵鳚鱼血清提取液，然后冻结的鳕鱼片所含有的冰晶尺寸小于不加入绵鳚鱼血清提取液，然后冻结的鳕鱼片中的冰晶尺寸。
因此加入了绵鳚鱼血清使得避免了特别是固体或纤维性食品由于在冷冻过程中冰晶尺寸的增长而引起的损害。
提供如下的实施例是为了说明本发明的晶体生长抑制剂在食品领域的工业应用。在下面的实施例中，如无其它说明，所有的百分比都是重量百分数。
实施例1使用含有晶体生长抑制剂的绵鳚鱼血清制造冰淇淋。
为此，在494g65℃的水中溶解92.3g粉末状的脱脂牛奶、150g蔗糖、26.2g葡萄糖浆和5g乳化剂。
在里面加入4g香兰素香料和228.5g35％的脂质物。
在Rannie型均化器(Kindler Maschinen AG.公司制造，Postfach297,CH-8021 Zurich)中相继通过两次将此制剂均化，第一次在140bar，第二次在40bar。
在板式换热器中，在83℃下将均化的制剂灭菌30分钟。
冷却到4℃，并在此温度下放置12小时，然后加入0.05％的绵鳚尉鱼血清，在HOYER MF50型冷冻机(APV TECHNOHOY公司制造，AxelKiers Vej 28-30,DK-8270 Aarhus-Hojbjerg)中进行冷冻。
由此得到具有泡沫结构的冰淇淋。
然后将此冰淇淋在空气脉冲冷冻室中硬化，并储藏在-35℃。
在-18℃以后，此冰淇淋具有光滑油腻的结构。
权利要求
1．可以通过如下的方法得到的分子量为4-5.5kDa的冰晶生长抑制剂，即提取绵鳚鱼血清、分离血清蛋白、经凝胶过滤分离蛋白质和分离出热滞后值为1-1.8℃的蛋白级份。
2．按照权利要求1的具有热滞后值1.3-1.5℃的冰晶生长抑制剂。
3．制备冰晶生长抑制剂提取液的方法，其中要制备含有所述抑制剂的绵鳚鱼血清。
4．按照权利要求3的方法，其中-提取绵鳚鱼的血液，-将其冷冻，-回收由含有冰晶生长抑制剂的绵鳚鱼血清组成的上层浮液，-然后将上层浮液冷冻。
5．为了减小冰晶尺寸的方法，其中在食品中加入至少一种按照权利要求1和2的提取自绵鳚鱼血清的或者按照权利要求3-4的方法得到的冰晶生长抑制剂。
6．按照权利要求5的方法，其中加入0.01-10％的冰晶生长抑制剂。
7．按照权利要求5的方法，其中将至少加入了一种冰晶生长抑制剂的食品冷冻。
8．按照权利要求7的方法，其中将食品在-15至-40℃的温度下冷冻。
全文摘要
冰晶生长抑制剂和制备这种制剂提取液的方法,其中提取绵鳚鱼的血液、将其冷冻、回收由含冰晶生长抑制剂的绵鳚鱼血清组成的上层浮液,然后将此上层浮液冷冻。本发明也涉及将这种制剂应用于食品加工中的方法。
文档编号C07K14/46GK1214615SQ97193431
公开日1999年4月21日 申请日期1997年2月5日 优先权日1996年2月9日
发明者A·雅, R·伦德黑姆 申请人:雀巢制品公司