专利名称：对类风湿性关节炎特异的人t细胞克隆的制作方法
技术领域：
本发明涉及对自身免疫性疾病的诊断、预防和/或治疗有益的物质，具体而言，本发明涉及与类风湿性关节炎(RA)患者的滑膜细胞所表达的、由特定的HLA-DR所呈递的抗原进行特异反应的T细胞克隆。
背景技术：
本来免疫系统的应答是机体为了破坏、清除从外部侵入的异物而产生的应答，通常是对非己分子(抗原)特异的，但是，由于某种原因，机体识别自身分子和非己分子的功能发生障碍(自身免疫耐受异常)就会发生全身性红斑狼疮、硬皮病、多发性硬化症(MS)、类风湿性关节炎(以下简称RA)等各种自身免疫性疾病。中年以后的女性易发RA，主要症状有关节肿胀和变形、疼痛及运动功能障碍，病理组织学上可看到覆于关节腔(关节囊)内侧的滑膜组织有异常增生。此外，在增生组织中有大量免疫细胞(嗜中性细胞、巨噬细胞、淋巴细胞)存在，可观察到产生抗体的B细胞的浆性细胞和辅助型T细胞聚集。到目前为止已明了免疫学上与作为疾病敏感性基因的HLA-DRB1等位基因相关。闭经前后的女性易发。此外，病理形态学上可见到病变部位(关节滑膜组织)有CD4阳性、CD45RO阳性的记忆性T细胞浸润，这表明对某种特定抗原有记忆的辅助型T细胞与疾病的发生密切相关。
目前RA治疗的中心是非类固醇类抗炎症剂、免疫调节剂和类固醇，但这些药物有各种副作用(胃肠障碍、肾功能障碍等)。免疫调节剂则有起效慢、连续施用出现无效性等问题。近年开始使用更能有效控制炎症的免疫抑制剂，但由于存在骨髓抑制等严重的副作用，所以迫切期望能开发出对病变部位特异的治疗手段。
作为对自身免疫性疾病特异的治疗手段，如可按照MS中提出的，从机体中去除对特定的自身抗原产生反应性的T细胞这一病因(例如使用T细胞疫苗)及对该抗原自身免疫耐受的由诱导等。为了将上述方法适用于RA、有必要鉴定RA相关自身抗原和对该抗原特异的T细胞，得到RA相关T细胞克隆。如果能得到这样的克隆，就能对与RA发病相关的T细胞受体(以下称作TCR)和编码它的基因进行分析能分离、鉴定该TCR所特异识别的抗原，进一步就有可能阐明T细胞活化的结制构及RA发病时的结构，最终就有可能开发出RA的治疗、诊断和预防方法。
但是由于没有RA相关的有效的动物模型，所以还未得到明确识别RA相关自身抗原的T细胞克隆，与RA发病相关抗原的鉴定也未进行，所以浸润CD4阳性记忆型T细胞与滑膜细胞与RA发病的关系也未明确。一般情况下，与特定抗原有反应性的辅助型T细胞克隆可这样建立如在IL-2存在下持续给予抗原刺激，得到特别识别该抗原的T细胞株，在从这些细胞株用有限稀释法建立。但是由于未规定其抗原特异性(未给予特定的抗原刺激)，所以长期维持这些T细胞克隆非常困难。所以象RA这样未鉴定出与疾病相关的自身抗原的自身免疫性疾病，就不能按照上述方法建立RA特异的T细胞克隆。
发明的公开本发明人们以提供与RA发病相关的、有增殖可能的T细胞克隆为目的进行了深入研究，建立了特异性识别RA患者滑膜细胞来源的抗原的T细胞克隆，阐明了其特性。
也就是说本发明所提供的T细胞克隆以HLA-DR限制性识别类风湿性关节炎患者滑膜细胞所表达的抗原。
本发明的T细胞克隆所识别RA相关抗原是以在特定的基因型HLA-DR上呈递为条件进行特异性识别，增殖的。
本发明的T细胞克隆包括识别HLA-DR4或HLA-DR9上所呈递的RA相关抗原的HLA-DR4或HLA-DR9限制性克隆。
此外分析本发明T细胞克隆的TCR区域的结果表明，TCR Vα链的CDR3区域有精氨酸，TCRβ链是Vβ6家族成员，或者TCRβ链包含Vβ12。
作为一种状态，本发明的T细胞克隆为CD4阳性且CD45RO阳性，在HLA-DR4或HLA-DR9的类风湿性关节炎患者的滑膜细胞存在下进行增殖。
本说明书中涉及T细胞克隆“有反应性”的时候是指某一T细胞克隆，体内和体外，在一定条件下能进行抗原特异性增殖。
“自身RA滑膜细胞”是指与特定的T细胞克隆相关过，与该克隆的供给源(RA患者的滑膜组织)相同的滑膜细胞。“非自身的RA滑膜细胞”是指由与特定的T细胞克隆的供给源不同的供给源而来的滑膜细胞。即。滑膜细胞“自身”或“非自身”的区别只依赖于供给源，因而“非自身RA滑膜细胞”中不只是与特定T细胞克隆基因型不相同的细胞，也包含有相同HLA-DR的细胞。
另外，T细胞克隆的“自身反应性”是指某一T细胞克隆，在自身RA滑膜细胞的存在下显示增殖活性。但是如说明书中所表明的，本发明的“自身反应性”T细胞克隆不只对自身RA滑膜细胞对HLA-DR基因型相同的非自身滑膜细胞也具有反应性，因此，“自身反应性”从广义上讲也是指T细胞克隆在HLA-DR基因型相同的非自身RA滑膜细胞存在下显示增殖活性。
“HLA-DR限制性”是指某一T细胞克隆识别的RA相关抗原，不管它是来源于自身或非自身的RA滑膜，只要它以特定的HLA-DR呈递，该细胞克隆就能识别它、并显示增殖活性。
因此，本发明的HLA-DR限制性T细胞克隆，只在某一RA相关抗原以特定的HLA-DR方式呈递的时候才增殖，在不同基因型(异种的allogeneic)的HLA-DR呈递的时候不能增殖。
“RA相关抗原”是指考虑为类风湿性关节炎病因的自身抗原，典型地是指与特定HLA分子结合的、由T细胞识别的抗原肽片段，或者包含它的抗原。
附图简述
图1是获得自身反应性T细胞克隆的工程的流程图。
图2表示用抗HLA-DR单克隆抗体(mAb)或抗原TCRαβmAb来阻断HLA-DR限制性T细胞克隆对自身滑膜细胞的反应性。
图3表示HLA-DR限制性T细胞克隆与RA滑膜细胞来源的可溶性抗原。健康人及非RA患者的滑膜细胞来源的可溶性抗原的反应性。这里N-1及N-3表示来源于健康人，OA-1表示来源于变形性关节病患者。
图4a是HLA-DR限制性T细胞克隆(39SM1B5、39SF2A5)。由RA滑膜细胞获得的可溶性抗原的层析图，各种标准蛋白(BSA(牛血清白蛋白)、OVA(卵白蛋白)、CA(碳酸酐酶)、STI(大豆胰蛋白酶抑制剂)和ALA(牛乳α-乳球蛋白)的洗脱位置图。()内的数字为标准蛋白质的分子量。图4b是HLA-DR限制性T细胞克隆对RA滑膜细胞来源的可溶性抗原的层析级份(图4a)的反应性。可看到有反应性的级份抗原(HPLC级份31和38)的分子量，可根据由标准蛋白的洗脱位置而求出的测量线计算为50kDa和25kDa。
实施本发明的最佳状态以下就本发明的T细胞克隆的建立方法和其特性进行一般地说明。本发明并不限于特定的HLA-DR限制性的T细胞克隆，包含按照本发明说明书中的方法所得到的各种HLA-DR限制性的RA特异的T细胞克隆。
原则上，制备本发明的RA滑膜细胞中表达的抗原特异的人T细胞克隆，包括以下工程。(1)从类风湿性关节炎患者的滑膜组织或滑液而来的T细胞克隆在适当的培养基中培养来建立；(2)筛选对同一患者的自身滑膜细胞有反应性的T细胞克隆；(3)筛选对具有与该自身滑膜细胞不同HLA-DR的其它类风湿性关节炎患者来源的滑膜细胞不具反应性的T细胞克隆；和/或(4)表达与该自身滑膜细胞相同HLA-DR的、(1)中患者的滑膜细胞由来的不表达RA相关抗原的细胞，筛选与该细胞不进行反应的T细胞克隆。
首先从RA患者获取滑膜组织和滑液，用含有胶原酶、透明质酸酶和DNase的消化液进行消化，得到1次培养的单核细胞，用有限稀释法筛选T细胞克隆，在适当的培养基中培养。建立T细胞克隆时可根据要求改变该技术领域中常用的培养基，但优选本发明人所开发的培养基(含IL-2、人末梢血单核细胞PHA刺激培养上清及胎牛血清的培养基)。尤为优选的培养基为AIM-V培养基(GIBCO BRL,#87-0112)400ml中补充了RPMI1640培养基(GIBCO BRL,#22400)50-100ml，人T-STIM30-60ml(10 BRMP/ml；BRMP,BiologicalResponse Modifier Program Jurkat IL-2 reference reagent)、重组人IL-2 250-750U/ml，胎牛血清(预先56℃处理30分钟进行灭活)50-100ml及抗生素(例如青霉素约100U和约100μm/ml链霉素)的培养基。以后称为MIX-H培养基。这里的人T-STIM是在植物血凝集素的刺激下人末梢血单核细胞的培养上清(Human T-STIMwith PHA,Becton Dickinson,#40045)。
就这样建立每个RA患者的T细胞克隆，从其中的CD4阳性和CD45RO阳性克隆中，按照图1所示的方法得到自身反应性T细胞克隆。后面的实施例中，从2名患者(RA39和RA40)中共得到8个自身反应性T细胞克隆。作为开发物质的RA患者由来的滑膜细胞的一个细胞株RA39-sy(HLA-DRB1*0405/0901)，根据与专利程序相关的布达佩斯条约进行了国际保藏，以保藏号FERM BP-5681存放于茨城县筑波市东1丁目1番3号的通产省工业技术院生命工学技术研究所(保藏日平成7年10月3日)。
制备本发明的T细胞克隆时也可应用滑膜组织或滑液以外组织而来的T细胞。即，向认为能有抗原特异性增殖(或无自动增殖)的T细胞中加入有抗原呈递作用的细胞及滑膜细胞的可溶性物质，在适当的培养基(例如含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基)中37℃培养10～20天，来建立T细胞株。然后应用从滑膜组织分离自身反应性克隆时所述的工程处理所得的T细胞株，分离目的性自身反应性T细胞克隆。
所谓“抗原呈递细胞”可以例举为巨噬细胞、B细胞等，二能抗原特异性增殖(或无自动增殖)T细胞、可例举人末梢血中的T细胞、组织中浸润的T细胞。
T细胞克隆反应性(抗原特异的增殖活性)的评价，可用通常的3H-胸腺嘧啶核苷掺入法(CPM)，也可用下面的各种方法。
1．DNA聚合酶等与核酸合成相关的酶活性的测定2．溴化乙锭与DNA所形成的复合体的测定3．培养液中葡萄糖消耗量的测定4．形态学观察(活细胞数的测定)如图l所示，首先在自身RA滑膜细胞存在的条件下培养建立的T细胞克隆，筛选具有反应性的克隆，之后筛选与HLA-DR不相同的RA滑膜细胞不具反应性的克隆。此时，用γ-干扰素刺激滑膜细胞，使HLA-DR大量表达。
然后筛选对转入了HLA-DRB1的小鼠纤维母细胞(HLA-DR转化体)无反应性的克隆。通过这一步骤可除去对无抗原呈递的HLA-DR具有反应性的克隆，可得到识别抗原呈递的H-LA-DR。具有自身反应性的克隆。
本发明克隆的特征可列举以下几点。1)不仅对自身RA滑膜细胞对非自己RA滑膜细胞呈HLA-DR限制性反应、增殖，但对有与自身相同HLA-DR健康人末梢血的抗原呈递细胞(PB-APC)无反应(参照后面表1)。2)对自身末梢血中的抗原呈递细胞(PB APC)无反应。
1)和2)中的结果表明本发明的T细胞克隆识别HLA-DR限制性抗原，该抗原具有滑膜细胞特异性。3)对多个RA患者由来的滑膜细胞有反应(参照表1)。4)自身反应性可被抗HLA-DR及抗TCRαβ抗体(均为小鼠IgG)完全阻断，而无关的小鼠IgG无影响(参照表2)。5)TCR的氨基酸序列分析结果表明，有TCRα链的CDR3区中含精氨酸的克隆，其中均使用TCR Vβ6，以及，其它的克隆α链无特征，均使用TCR Vβ12(参照表2)。6)在末梢血由来的抗原呈递细胞的存在下，与RA滑膜细胞抽提出的可溶性抗原进行反应，但与非RA滑膜细胞抽提出的可溶性抗原无反应(参照表3)。
3)～6)中的结果为本发明的T细胞克隆能识别各种共同的或类似的抗原，且该抗原具有RA特异性，并且表明多个患者间可能存在共同的、普遍的RA相关抗原。
如上所述，本发明的自身反应性T细胞克隆是以HLA-DR限制性识别RA相关抗原的人T细胞克隆，它对于阐明RA的发病机制、开发治疗、正确的诊断及预防方法有很大益处。例如，应用本发明的T细胞克隆，可根据对RA可疑患者滑膜组织中获得的滑膜细胞的反应性检测出RA相关抗原。因此应用本发明或本发明的T细胞克隆，以其反应性为指标可提供检测类风湿性关节炎相关抗原的方法，并可提供如此检测出的类风湿性关节炎的相关抗原。抗原的栓测方法是从可疑为类风湿性关节炎的被检者滑膜细胞入手，将其可溶化，将上述本发明的人T细胞克隆和被检者由来的有抗原呈递作用的细胞与所得的可溶化物进行反应，通过测定该克隆的反应性来检测类风湿性关节炎的相关抗原。
以按本发明方法检测出的类风湿性关节炎相关抗原为例，应用PBS以流速0.5ml/分作流动相，通过TSK胶、G300SW柱的HPLC测定出分子量为25kDa或50kDa的抗原。这样所得的抗原对开发病灶特异性RA治疗方法、阐明发病机制、或RA的治疗、诊断等有益。
此外，由于本发明类风湿性关节炎(RA)相关抗原特异的T细胞克隆的TCR的部分序列已经明确，应用该序列就能得到全TCR分子或与识别RA相关抗原相关的部分肽以及编码该肽片段的DNA或DNA片段，将之转入宿主细胞进行表达，利用DNA重组技术就能得到研究中必要量的、具有TCR活性的分子。这样所得的TCR分子对于阐明RA特异的RA相关抗原-HLA-DR复合体的构造、进一步表明RA相关抗原的情况有益。
临床上应用RA相关抗原可由诱导患者的耐受(自身免疫耐受)，从而抑制或消除症状。再者，可按MS所述，将自身的T细胞克隆或TCR与适当的估剂一起施与患者，就能选择性去除引起炎症的T细胞克隆。另外，应用与TCR相拮抗的与抗原-HLA-DR复合体相结合的物质可阻断T细胞对滑膜细胞所呈递的抗原的识别，从而可以抑制症状的发生、或者得到与T0细胞克隆的TCR相对应的单克隆抗体，将该单克隆抗体，施与RA患者，这样可通过体内去除诱发RA的T细胞而进行治疗。
另外通过检测与RA相关抗原进行反应的T细胞而进行RA的诊断。还可应用ELISA检测有无RA相关抗原反应性抗体而进行RA的诊断。
另一方面，本说明书中所公开的滑膜细胞不仅对研究HLA-DR4/9限制性自身反应性T细胞克隆所识别的RA相关抗原有利，而且可用于同一HLA-DR限制性T细胞相关RA的筛选。
由此本发明首次提供了对多个患者的RA相关抗原特异的T细胞克隆，这将有利于RA发病机制的阐明以及治疗、预防、诊断方法的开发。
以下列举实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不仅限于此。实施例1当RA患者的滑膜病变部位建立T细胞克隆(1)材料1)滑膜组织及滑液的制备类风湿性关节炎(RA)的诊断按照1987年的ACR标准(F.C.Arnett等，Arthritis Rheum.,31；315(1988))，从诊断为2～4级，2～4期的RA患者(RA39)的病变部位，无菌条件下获取滑膜组织及滑液。滑膜组织在生理盐水或培养基中于4℃存放于试管中。滑液于4℃存放于试管中。以下的操作原则上在无菌条件下进行。2)消化液的制备在补充了高浓度葡萄糖(4500ml/L)的DMEM(Duibecco’sModified Eagle Medium)(GIBCO BRL,#12430-021或其它等价物)500ml中，常温下溶解胶原酶(Ⅳ型，Sigma ChemicalCo.)0.5mg、透明质酸酶(Sigma)0.5mg及DN ase(Ⅰ型，Sigma)5μg制备消化液。将该溶液10ml移入附有聚丙烯盖的试管中(CorningCostar Co.#430766或其等价物，-15℃保存于冰箱中。3)MIX-H培养基的制备向AIM-V培养基(GIBCO BRL,#87-0112)400ml中补充RPMI 1640培养基(GIBCO BRL,#22400)60ml，人T-STIM40ml(10BRMP/ml；BRMP,Biological Response ModifierProgram Jurkat IL-2reference reagent)、重组人IL-2(盐野义制药公司)500U/ml，胎牛血清(预先56℃30分钟灭活)50ml及抗生素(青霉素100U和约100μg/ml链霉素；GIBCO BRL#15140-015或其等价物)，制备MIX-H培养基。人T-STIM是在植物血凝集素的刺激下人末梢血单核细胞的培养上清(Human T-STIM with PHA,Becton Dickinson,#40045)。(2)滑膜组织的消化于37℃温浴中解东消化液。从保存滑膜组织的试管中除去生理盐水，将大约5g的组织放于塑料平皿上，用剪刀切碎。将剪碎的组织移入付有螺丝帽的试管中，加入冷却的、不含血清的RPMI 1640培养基(组织的5-10倍量)，1000rpm。4℃离心5分钟。弃上清，向试管中加入解冻了的消化液(10-20ml)，将含有组织的试管置入37℃温浴中，振荡培养2～3小时。
接着向试管中加入RPMI 1640培养基(2-3倍量)，静置，未消化的组织存于沉淀中，回收细胞悬浮液。如此重复2次。合并回收的细胞悬浮液，1000rpm、4℃离心5分钟。
对消化的细胞计数，通过苔盼兰排除试验计算单个细胞的存活率。(3)单核细胞的原代培养和滑膜细胞的分离将所得细胞的一部分悬浮于MIX-H培养基中，37℃、5％CO2条件下培养。原代培养物中含有滑膜细胞和组织中浸润的单核细胞两种。在这种条件下培养2-3周并传代，单核细胞可活化增殖，而在培养物中几乎看不到滑膜细胞。
另一方面，清膜细胞在含有10％胎牛血清和抗生素的DMEM中培养可增殖。即，将上面(2)中所得细胞的一部分，以MIX-H培养基中相同的浓度在加入了10％胎牛血清和抗生素的、补充了高浓度葡萄糖(4500mg/L)的DMEM中培养。培养在37℃、5％CO2存在的条件下进行，分离滑膜细胞。由来于RA39的表达HLA-DR4和HLA-DR9的滑膜细胞株RA39-Sy(HLA-DRBl*0405/0901)存放于通产省工业技术院生命工学技术研究所，保藏为FERM BP-5681(保藏平成7年10月3日)。(4)来源于滑液的单核细胞的原代培养用移液管将滑液约10ml移到新的带螺丝帽试管中，2500-3000rpm,4℃离心10分钟试管底部能观察到细胞团。吸取无细胞滑液，必要时将液体保存于-15℃。将离心所得细胞悬浮于MIX-H培养基中，37℃、5％CO2条件下培养。在该条件下培养2-3周并进行传代，单核细胞能活性增殖。(5)从单核细胞而来的T细胞的克隆化可以看到上面(3)和(4)中增殖的、由滑膜组织和滑液而来的单核细胞株分别以活化细胞的大集落存在。若观察到大量的死亡细胞(＞50％)或几乎没有集落，可每3-5天，半量交换培养液(MIX-H)，有必要反复观察集落，以得到适当的单核细胞株。
从肝素处理过的末梢血中制备异种的(allogeneic)末梢血单核细胞(PBMC)，在25μg/ml丝裂霉素C存在下、37℃于RPMI 1640(不含血清)中培养1小时。用这些PBMC作支持细胞。在MIX-H培养基中将支持细胞调配成3×105/ml，以5×104细胞/100μl孔分配到96孔圆底板中。
在不含血清的RPMI 1640培养基中洗涤上述增殖了的细胞株，用苔盼兰染色计数。在MIX-H培养基中调细胞数为1×103/10ml、5×103/10ml及1×104/10ml，与支持细胞一起以10、50或100个/100μl/孔的比率分配到板的各孔中。
接着，在37℃、5％CO2的条件下将板培养2-4周。从克隆化开始每1周后检查平板。克隆化开始1周后可识别阳性孔(细胞增加了的孔)，但阳性孔的数目及阳性孔的出现时间随细胞株而有所差异。每1周间将半量MIX-H培养基与新鲜培养基交换。
将增加了的细胞移到48孔板培养，使之增殖，从自身RA滑膜组织及滑液分别建立T细胞克隆59个和53个。其中CD4阳性且CD45RO阳性克隆是108个。剩余的4个克隆为CD8阳性。(6)筛选自身反应性T细胞克隆按照图1中的工程，从上述(5)中得到的CD4阳性且CD45RO阳性T细胞克隆中筛选对(3)中分离出的RA滑膜细胞特异的克隆。
T细胞克隆对自已或非自身RA滑膜细胞的反应性是在添加了10％胎牛血清和抗生素后的RPMI1640培养基中、37℃培养72-96小时后，以3H胸腺嘧啶核苷的掺入值(CPM)作为增殖活性的拮抗来进行测定的。1)以上述方法检测与自身RA滑膜细胞(HLA-DRB1*0405/0901)的反应性，共获得17个阳性克隆。2)检测与基因型不同的异型(allogeneic)非自身滑膜细胞(HLA-DRB1*0802/0802)的反应性，得到8个阴性克隆。3)获得与表达自身HLA-DR的小鼠转化体(HLA-DRB1*0405/0901)无反应性的T细胞克隆。结果去除无抗原呈递时对HLA-DR有反应性的克隆，得到6个只对呈递RA抗原的特定HLA-DR进行特异反应、HLA-DR限制性克隆。
同样从其它患者RA40的滑膜组织和滑液入手，分别获得1个自身反应性T细胞克隆。患者RA40的HLA-DR等位基因为DRB1*0901/1502。
如此，最终从本发明的8个自身反应性T细胞克隆入手。
为了说明本发明自身反应性T细胞克隆的反应性、TCR构造、RA滑膜细胞、RA抗原识别等特性进行了下面实施例中的系列实验。这些实验结果中凡表示T细胞克隆反应性(增殖活性)的时候，若无特殊说明，均与实施例1中同样的3H胸腺嘧啶核苷掺入值(CPM)进行评价。实验例1(1)自身反应性T细胞克隆的HLA-DR限制性通过测定实施例1中所得8个自身反应性T细胞克隆(39SM1B5,39SMID4、39SM3C4,39SF1A2,39SF1D1,39SF2A5,40SM1A1,44SM2A7)对呈递RA抗原的自身和非自身滑膜细胞的反应性，以及对不呈递RA抗原的抗原呈递细胞的反应性，来探对其HLA-DR限制性。作为不呈递RA抗原的抗原呈递细胞可应用RA患者或者健康人末梢血中的抗原呈递细胞(PB-APC)。
将T细胞克隆与自身或非自身RA滑膜细胞或与该RA患者或健康人(HD)由来的PB-APC(末梢血抗原呈递细胞)一起，在添加了10％胎牛血清和抗生素的RPMI 1640培养基中、37℃、5％CO2条件下培养，检测增殖活性。结果如下文表1所示。
表1 RA关节病变部位由来的CD4+CD8-T细胞克隆在滑膜细胞识别中的HLA-DR4或HLA-DR9限制性
注·HLA-DR的两个或单个相同或二者均不同的RA滑膜细胞的HLA-DR等位基因(基因型)如下。RA36,DRB1*0101/0405；RA38,DRB1*0101/0901；RA45,DRB1*0802/0802；RA49,DRB1*0101/0405。
是3次培养所得结果的平均值cpm±SD。NT表示未做试验，一表示不能适用。从表1可看出以下几点1)从RA39来的克隆对有HLA-DR4和DR9的自身滑膜细胞显示增殖活性，对HLA-DR基因型共同的非自身RA滑膜细胞也具有反应性。2)39SM1B5、39SM3C4和39SM1D1对具有HLA-DR9的滑膜细胞有反应，39SM1D4、39SF1A2和39SF2A5对具有HLA-DR4的滑膜细胞有反应，由此可知，该反应由与自身同一HLA-DR中任一方的HLA-DR限制性引起。3)从具有HLA-DR9和HLA-DR15的RA40SM1和RA40SM2获得具有HLA-DR9限制性增殖活性的克隆。4)对RA滑膜细胞具有反应性的T细胞克隆对自身的和具有与自身同一HLA-DR的PB-APC(末梢血抗原呈递细胞)无反应性。
以上结果表明本发明的T细胞克隆从HLA-DR限制性识别RA滑膜组织中特异存在的抗原。另外，由于一个克隆可与多个RA滑膜细胞进行反应，所以可以推测各个RA滑膜细胞上的HLA-DR呈递的抗原肽是相类似的或是相同的。首次得到这样表明RA相关抗原是单一物质的实验数据。(2)T细胞克隆识别RA滑膜细胞时HLA-DR和TCRαβ分子的关系。
自身反应性T细胞克隆与经HLA-DRmAb(单克隆抗体)处理过的自身滑膜、或者自身滑膜细胞与经抗TCRαβmAb(单克隆抗体)处理过的T细胞克隆一起，在上述(1)的条件下，培养基中存在抗体的情况下进行培养。作为对照，用无关的小鼠IgG处理滑膜细胞，与T细胞克隆一起进行培养，检查T细胞克隆的增殖活性(自身反应性)。其结果如图2所示。图中是用3回培养的平均值cpm±SD来表示结果。#表示未进行试验。从图2可知以下几点1)抗HLA-DR及抗TCRαβ抗体可完全阻断T细胞克隆的自身反应性。2)无关的小鼠IgG对反应性无影响。且用无关小鼠IgG处理T细胞克隆时结果不变(数据未列出)。
以上结果表明非特异性粘附分子等的刺激自身反应性T细胞克隆不增殖，通过TCR可特异性识别滑膜细胞的HLA-DR上呈递的抗原，由此而增殖。(3)TCR结构的分析分析与自身反应性T细胞克隆识别RA滑膜细胞相关的受体结构。用衔接子连接PCR法(Y.Tsuruta，等，免疫方法学杂志161,7；1993)和链终止法测定TCR V、D及J区的核苷酸序列，根据它来确定氨基酸序列。用Koop等的方法(B.F Koop等，基因学19,487；1994；N.Kimura等，欧洲免疫学杂志，17,375；1987,B.Togonaga等，美国国家科学院院刊。82,8624；1985,S.Roman-Roman等，欧洲免疫学杂志，21,935；1991,M.Yassai等，人类免疫学，34,279,1992)来命名TCR的V及J区。结果如下面表2所示。表2自身反应性T细胞克隆的TCR氨基酸序列的比较TCRα链
TCRβ链
注A·丙氨酸3C半胱氨酸；D天冬氨酸；E谷氨酸；F苯丙氨酸；G氨基醋酸；H组氨酸；I异亮氨酸；K赖氨酸；L亮氨酸；M甲硫氨酸；N天门冬酰胺；P脯氨酸；Q谷氨酰胺；R精氨酸；S丝氨酸；T苏氨酸；V秸氨酸；Y酩氨酸。N端是这样一区域，可通过末端脱氧核苷转移酶将核苷酸插入到TCR的V-D或D-J间(β链)、或V-J间(α链)。
从表2可得出以下结论。1)8个克隆中有5个克隆的TCRα链的CDR3区(ComplementarityDetermining Region 3指含有V-D-J或V-JN区的抗原结合部位)有精氨酸，它们均使用TCRVβ6。2)剩余的3个克隆α链无特征，均使用TCRVβ12。
上述结果表明TCR形成多样性。能对各种抗原应答的α链CDR3区有精氨酸的T细胞偏存于滑膜细胞，以及，这样的T细胞TCRβ链的使用方式有规律性。并且与该TCR有亲和性的RA相关抗原肽的构造也有相同结构特征，这表明本发明的T细胞克隆对阐明其结构特征有益。(4)自身反应性T细胞克隆与可溶性RA抗原的反应性原则上按照Meltezer等的方法(M.S Meltaer等，国家癌症研究所杂志(J.Nat.Cancer Inst.47,7033 1971)用氯化钠高胀液处理RA40滑膜细胞来制备可溶性RA抗原，具体的步骤如下。将0.005M磷酸钠缓冲液(pH3.4)中配制的3M KCl溶液3ml加入到5×107～1×108滑膜细胞的细胞板中。4℃抽提抗原16小时，之后，将上清在去离子水中透析2次(4℃、1小时)。过滤抽提物，4℃保存。
再将所得可溶性抗原与自身反应性T细胞克隆一起，在从HLA-DR9健康人得到的末梢血抗原呈递细胞(PB-APC；DRB1*0901)的存在下、或非存在下培养72小时，以3H-TdR(3H-胸腺嘧啶核苷)的掺入值为基准检查T细胞克隆的增殖活性，评价自身反应性T细胞克隆对HLA-DR所呈递的可溶性抗原有无特异性反应。结果如表3所示。表3自身反应性T细胞克隆对HLA-DR限制性可溶性RA抗原的识别
注NA不适用。
Ag可溶性抗原。从表3可知1)RA滑膜细胞HLA-DR9限制性的克隆(39SM3C4、40SM1A1及44SM2A7)在HL-DR9阳性的PB-APC存在下识别可溶性抗原、起进行增殖，但在HLA-DR9阳性PB-APC不存在的情况下不增殖。2)RA滑膜细胞HLA-DR4限制性克隆(39SM1D4及39SF1A2)即使在HLA-DR9阳性PB-APC存在下也不识别可溶性抗原。同样，用从RA滑膜细胞抽提出的可溶性抗原和HLA-DR4阳性PB-APC进行实验的结果，这些抗原与PB-APC共同存在的时候HLA-DR4限制性T细胞克隆增殖。(5)自身反应性T细胞克隆的RA滑膜细胞特异性用与上面(9)相同的方法从健康人的滑膜细胞抽提抗原，在HLA-DR9阳性PB-APC的存在下或不存在下与上面同样的方法进行培养，检查HLA-DR9限制性自身反应性T细胞克隆(39SM1B5、39SM3C4、39SF1D1、40SM1A1)的增殖活性。结果如图3所示。如图中所示，T细胞克隆与来源于RA滑膜细胞的可溶性抗原反应，但与来源于非RA患者(健康人(N-1和N-3)及变形性关节病患者(0A-1))滑膜细胞的可溶性抗原无反应。这表明本发明的自身反应性T细胞克隆所识别的抗原有特异存在于RA滑膜细胞的可能性。(6)可溶性RA抗原的鉴定在不含血清的RPMI 1640培养基中透析上述(4)中制备的抽提物(4℃1小时)通过凝胶渗透HPLC进行分级分离。进行后者的时候，用PBS作流动相，以0.5ml/分的流速，TSK凝胶、G3000SW柱(7.5×600mm,10μm,Tosoh Co.,Tokyo)对从RA滑膜抽提出的可溶性抗原(1mg/ml)进行适用于地凝胶渗透HPLC的分级分离。将各级份过滤，用与实验例1中(1)相同的方法试验自身反应性T细胞克隆对所得可溶性抗原的层析流分的反应性(增殖应答)。即，将各流分与RA滑膜细胞HLA-DR限制性的T细胞克隆(39SM1B5、39SM1D4、39SM3C4、39SF1A2、39SF2A5、或40SM1A1)及DR一致的PB-APC(未梢血抗原呈递细胞)一起在添加了10％胎牛血清和抗生素的RPMI 1640培养基中37℃、5％CO2的条件下进行培养，检测增殖活性，然后求出有增殖活性的流分中所含抗原的分子量。代表性结果如图4所示。从图4b可知。HLA-DR9限制性T细胞克隆39SM1B5及DR-4限制性T细胞克隆39SF2A5，分别识别HPLC流分31和38的可溶性抗原，并增殖。用BSA(牛血清白蛋白)、OVA(卵白蛋白)、CA(碳酸酐酶)、STI(大豆胰蛋白抑制剂)、ALA(牛乳α-乳球蛋白)作标准蛋白制作的测量线求出这些流分中所含可溶性抗原的分子量分别为50kDa和25kDa(图4a)。
其它的HLA-DR限制性克隆(39SM3C4、39SF1A2、39SF2A5及40SM1A1)这对这些流分起反应、增殖(数据未列出)。
权利要求
1．人T细胞克隆，它以HLA-DR限制性识别来源于类风湿性关节炎患者滑膜细胞的类风湿性关节炎相关抗原。
2．权利要求1的人T细胞克隆，它与来源于该类风湿性关节炎患者的末梢血抗原呈递细胞单独作用，无反应。
3．权利要求1的人T细胞克隆，是HLA-DR4或HLA-DR9限制性的。
4．权利要求1的人T细胞克隆，其T细胞受体α链的CD3区域中有精氨酸。
5．权利要求1的人T细胞克隆，其T细胞受体的β链为Vβ6家族成员。
6．权利要求1的人T细胞克隆，其T细胞受体β链为Vβ12的家族成员。
7．权利要求1的人T细胞克隆，它在CD4阳性、有HLA-DR4或HLA-DR9的类风湿性关节炎患者来源的滑膜细胞的存在下进行增殖。
8．权利要求1-7中任一项的人T细胞克隆的制备方法，包括有以下工程(1)建立来源于类风湿性关节炎患者滑膜组织或滑液的T细胞克隆；(2)筛选与该类风湿性关节炎患者来源的自身滑膜细胞进行反应的T细胞克隆；(3)筛选与含有与该自身滑膜细胞不同HLA-DR的、来源于其它类风湿性关节炎患者的滑膜细胞不进行反应的T细胞克隆；和/或(4)筛选表达同该自身滑膜细胞相同的HLA-DR、而与不表达来源于该自身滑膜细胞的类风湿性关节炎相关抗原的细胞不进行反应的T细胞克隆。
9．自身反应性T细胞克隆的制备方法，其特征在于向只对抗原特异性增殖的T细胞中添加有抗原呈递作用的细胞和滑膜细胞的可溶性物质，在适宜的条件下进行培养来建立T细胞株，然后按照权利要求8中的(3)和(4)项工程进行。
10．以权利要求1-6中任一项中T细胞克隆的反应性为指标，检测类风湿性关节炎相关抗原的方法。
11．权利要求10的类风湿性关节炎相关抗原的检测方法，它包括从可能为类风湿性关节炎的被检者滑膜细胞入手，将其可溶化，与权利要求1～6任一项中的T细胞克隆和来源于被检者的有抗原呈递作用细胞的可溶性物质进行反应，测定该克隆的反应性。
12与权利要求1-6任一项中的人T细胞克隆具有反应性的、来源于滑膜细胞的类风湿性关节炎相关抗原。
13．权利要求12的类风湿性关节炎相关抗原，用PBS作流动相，以0.5ml/分的流速，通过TSK胶、G3000SW柱进行的HPLC测定其分子量为25kDa或50kDa。
14．权利要求12中类风湿性关节炎相关抗原的激动剂或拮抗剂的筛选方法，它包括将预计含有该激动剂或拮抗剂的样品与特异性识别抗原的权利要求1中的T细胞克隆进行反应，测定该克隆的反应性。
15．含有人白细胞介素2、人末梢血单核细胞PHA刺激培养上清和胎牛血清的培养基。
全文摘要
一种人T细胞克隆,它以HLA－DR限制性识别表达于类风湿性关节炎(RA)患者滑膜细胞的抗原,并对阐明RA的发病机制、开发治疗和预防方法极为有益。
文档编号C07K14/435GK1218506SQ9719462
公开日1999年6月2日 申请日期1997年3月12日 优先权日1996年3月13日
发明者前田朋子, 铃木隆二, 鹤田裕次, 武本浩 申请人:盐野义制药株式会社