专利名称：一种抗真菌蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质，特别是涉及一种新的来源于有毒植物豆薯种籽的抗真菌蛋白及其制备和应用。
本发明所述的蛋白可被定义为具有抗真菌的活性—抗木霉菌、黄霉菌、稻瘟菌等活性。
所有高等植物都受到多种真菌的侵害。真菌病害是造成农作物减产的最严重的一类病害，全世界已发现的240种水稻病中，真菌性病害占90％(《水稻生态学》，梁光商主编，农业出版社，北京1983，322)，它每年给世界农业生产造成数十亿美元的损失。传统的育种方法虽可得到抗病品种，但耗资大、费时长，用化学杀菌剂会引起抗药性。因此，用生物工程技术得到抗病新品种是人类一直在努力进行的课题，而寻找新的抗真菌蛋白将为抗真菌转基因工程提供重要的基础和信息，为农业生产开辟植物育种的新途径。
除了几丁质和β-1，3葡聚糖等具有抗真菌能力的物质被发现外，Logcmann(Logemann，J.et al.，Biotechnology 1992，10305-308)，Woloshnk(Woloshuk C.P.et al.，Plant Cell，1991，3619-628)，Vigers(Vigers，A.J.et al.，Mol.Plant-Microbe Inter.1991，4315-323)等人在大麦、烟草、玉米等新种籽中发现了抗真菌蛋白。在萝卜、千穗谷、紫茉莉等的种籽中也发现了一类碱性小分子量蛋白也具有抗真菌活性。根据孙勇如的总结论文(《植物学报》，1997，39(1)91-96)，我国至目前只在天麻(胡忠等，《云南植物研究》1980，10373-380)和萌芽水稻种籽(陈章良等，《高技术通讯》1994，222-26)中发现抗真菌蛋白。前者可抑制小麦赤霉菌和木霉菌(抑菌量为50μg)，后者具有抗木霉菌活性的同时，也具有以抑制胰蛋白酶为主的活性(陈章良等，《植物学报》1997，39(6)561-569)，其抑制木霉菌最低量为20μg。我们从有毒植物豆薯种籽中分离出三个组分，液相色谱证明其为蛋白(吴红京等，《色谱》1997，15(2)153-155)。
本发明的目的在于从有毒植物豆薯种籽中分离纯化含有较强的抑制木霉菌、黄霉菌、稻瘟菌等活性的抗真菌蛋白。
本发明采用简化、温和的分离纯化方法，包括盐溶液粗提、S-SFF强阳离子交换层析、DEAE-纤维素阴离子交换过滤、CM-纤维素阳离子交换梯度洗脱和G-75凝胶过滤(或Sephacryl S200)，由此得到高纯度、高活性的豆薯种籽的抗真菌蛋白，暂命名为PE3。
豆薯蛋白PE3的分离纯化流程见附图3，具体操作如下[1]粗提将豆薯种籽100克粉碎，匀浆，用含0.6～0.9％NaCl的pH6.8～7.2 5mM磷酸盐缓冲液浸泡，4℃过夜。预处理粗提液用双层滤布去掉粗渣，用40～50％HAc调pH至3.5～4.0，在4℃下静置2小时，高速离心得上清液。上S-SFF柱洗脱粗提液的上清液上S-SFF阳离子交换柱(预先用pH4.0～4.5，0.01M NaAc缓冲液平衡)，用同样缓冲液洗杂蛋白后，用含约1N NaCl的平衡液洗脱，收集洗脱峰。上DE-52柱由[3]所得洗脱峰溶液，经蒸馏水透析48h后，上预先用平衡液平衡过的DE-52阴离子交换柱，收集穿过峰。上CM-52柱由[4]所得穿过峰溶液上CM-52阳离子交换柱(先用5mM～10mM PB液，pH6.0～6.5平衡)。用平衡液洗去杂蛋白，再用含0～0.2MNaCl的同样PB液进行洗脱，收集洗脱峰C1(见附
图1)。上G-75柱将[5]所得C1峰溶液，经浓缩、透析后，上预先用平衡液平衡过的G-75柱，用平衡缓冲液洗脱，收集洗脱峰C1G(见附图2)。冻干由[6]所得C1G峰溶液，经充分透析后，冷冻干燥得冻干粉即为豆薯蛋白PE3。
本发明从有毒植物种籽—豆薯种籽—中分离纯化出一种抗真菌蛋白PE3，其分子量为14KD(SDS-PAGE检测)，等电点PI≈7.5。抑菌实验表明它具有抗木霉菌、抗黄霉菌活性，其抑菌圈分别为1.2cm和1.0cm，抑菌最低量分别为6.25μg和12.5μg。其对稻瘟菌也有一定的抑制作用。后来在其CM-52柱洗脱组份中又发现两个组分PA2，PA3具有抗木霉菌活性，其分子量范围在20～50KD之间，此两组分抑菌圈分别为3.5cm和3.0cm，抑菌量估算为8.89μg和9.24μg。
本发明的抗真菌蛋白可作为基础蛋白，将通过植物转基因工程，获得具有抗真菌能力的新的植株，在防治农作物真菌侵害方面有实用价值。本发明的抗真菌蛋白，将可在防治食用菌(香菇、草菇、磨菇等)受黄霉菌的侵害，在消除烂菇、死菇的发生方面有实用价值。
本发明与现有技术相比，有以下积极效果1.本发明从有毒植物种籽—豆薯种籽—提取抗真菌蛋白，是新发现，国内外尚未见报导。
2.本发明的有毒植物品种—豆薯—含有两种以上的不同分子量的抗真菌蛋白，其抑制木霉菌所需量比天麻和水稻萌芽种籽中的抗真菌用量要低，抑菌效果好。
3.本发明的有毒植物豆薯种籽尚可综合利用。其粗提液经硫酸铵沉淀后，沉淀用于提取抗真菌蛋白，而其滤液含有鱼藤酮等生物碱可用1∶50对水稀释，用于杀灭蔬菜上虫害。
4.豆薯种籽来源丰富、价格便宜。
现对附图作简要说明图1.豆薯种籽蛋白PE3的CM-52洗脱图(取C1峰)；图2.PE3的G-75洗脱图(取C1G峰)；图3.豆薯种籽中蛋白PE3的分离纯化流程图；图4.PE3的SDS-PAGE凝胶电泳图(Lane5PE3)；图5.PE3的等电聚焦电泳图(Lane3PE3)；图6.PE3的等电点测定(CPE3)；图7.PE3的紫外280nm色谱图(CPE3)；图8.PE3的HPLC色谱图(CPE3)；图9.豆薯种籽蛋白的CM-52柱上二个组分PA2，PA3的洗脱图；以下结合附图通过实施例进一步描述本发明实施例1.从有毒植物豆薯种籽中分离纯化抗真菌蛋白PE31.粗提液的制备称取豆薯种籽100克，用粉碎机磨碎，加入一定量的含0.9％NaCl，pH7.2、5mM磷酸盐缓冲液(PB)，用高速自控组织捣碎机(8,000转/分钟)，捣碎3分钟×2次，再加入同样的缓冲液至总体积为800ml，静置24hr后，用双重滤布过滤，滤液用50％HAc调酸至pH4.0，静置2hr后，用滤纸过滤得到粗提上清液。以上操作均在4℃下进行。
2.S-SFF强阳离子交换柱层析将粗提上清液上用pH4.5、0.01M NaAc缓冲液充分平衡的S-SFF柱(2.6×15cm)。上样后用pH7.0、5mM PB液充分洗去杂蛋白，再用含1M NaCl的相同PB阶段洗脱，得一尖峰，收集SF峰。
3.DEAE Cellulose DE-52阴离子交换柱层析将2所得SF峰溶液，经蒸馏水及pH7.4、10mM Tris-HCl缓冲液透析，离心，将上清液上预先用pH7.4、10mM Tris-HCl缓冲液平衡的DE-52柱(1.5×15cm)，收集穿过峰。
4.CM Cellulose CM-52阳离子交换柱层析将所得穿过峰对二次蒸馏水透析48小时后，上用pH6.5、5mM PB缓冲液平衡的CM-52柱(1.5×25cm)。然后用同样缓冲液洗去杂蛋白后，再用含0～0.2M NaCl的平衡缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰C1，即PE3蛋白(见附图1)。
5.Sephadex G-75凝胶过滤将CM-52柱的洗脱峰经过浓缩、透析、离心，使体积达到7～8ml后，上Sephadex G-75柱(2.6×20cm，预先用pH6.5、5mM PB缓冲液平衡)，用平衡缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰C1G，即PE3蛋白(见附图2)。经多次透析完全去盐后，进行冷冻，在FLEXI-DRY真空冷冻干燥仪(FTSSystems Inc.，USA)上得到冻干粉(PE3蛋白)。每100g种籽得1mg蛋白。
实施例2.抗真菌蛋白PE3的生物性能1.十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶浓度7％，交联度(即甲叉双丙烯酰胺含量与丙烯酰胺含量的百分比)为3.7％，SDS浓度0.1％，电极液为Tris-HAc缓冲液，pH7.4。电泳前，将含1％SDS的样品溶液在100℃水溶液中加热3min。电泳时，每管电流恒定8mA，用溴酚蓝作指示剂，电流时间约1.5小时。电泳结束后，用含0.05％考马斯兰R250，25％异丙醇和10％醋酸的染色液染色6小时，再用10％异丙醇，10％醋酸以及7％醋酸分步脱色，结果与低分子量标准蛋白带进行比较，计算未知蛋白的分子量。其中标准蛋白为磷酸化酶(Mw.94,000D)，牛血清白蛋白(67,000D)，肌动蛋白(43,000D)，碳酸酐酶(30,000D)，烟草花叶病毒外壳蛋白(17,500D)，溶菌酶(14,400D)。电泳结果表明PE3为高纯度蛋白(见附图4)。由图可见PE3的分子量为14KD。
2.等电聚焦(Isoelecteic Focusing，IEF)将蛋白质样品和5％载体两性电解质(pH3.5～10.0)与7.5％的凝胶混合，然后聚合于凝胶管(0.5×8cm)中，正极电泳液为5％磷酸，负极为5％乙醇胺，恒压120V，聚焦时间约10小时。当电流接近零并不再下降时结束。结束后，将不含蛋白样品的标准管切成1cm长的小段，浸泡在2ml的10mMKCl溶液(预先抽气)中封口过夜。次日测定各段的pH值，制作标准曲线，其余各样品管按照SDS-PAGE的方法进行染色和脱色，然后根据蛋白带的相对位置在标准曲线上找出其等电点(见附图5和附图6)，等电点为7.5。
3.分析性高效液相色谱层析(High Performance LiquidChromatography，HPLC)将分离所得的蛋白样品用高效凝胶蛋白分离柱Protein-PAK 125(WatersCo.)，结合岛津(Shimadzu)的SPD-MIA光电二极管阵列检测器进行了组份分析和纯度分析，并给出了200～400nm范围的紫外吸收光谱图(见附图7)。同时，根据未知蛋白与标准蛋白的滞留时间的比较，测定蛋白的分子量。HPLC层析的流动相为pH6.5、0.2M PB，检测波长λ＝280nm，流速为1ml/min。标准蛋白为牛血清蛋白二聚体(Mw134,000D)，牛血清白蛋白(67,000D)，卵清蛋白(43,000D)，天花粉蛋白(27,000D)，溶菌酶(14,400D)。分析结果PE3的分子量为14KD(见附图8)，与电泳结果一致。
4.氨基酸组成分析称取1mg左右的样品，用6M HCl在110℃水解24hr后，采用邻苯二甲醛(OPA)柱后衍生荧光法，在日本岛津LC-4A高效液相色谱仪的氨基酸分析系统上测定样品的氨基酸组成。氨基酸的分离用ISC-0.7离子交换柱(4.6×150mm)，流动相柠檬酸梯度缓冲液，检测器为岛津RF-530荧光检测器。测定PE3氨基酸的组成见附表。
实施例3.抗真菌活性检测本实验在福建省农科院完成。除所采用的蛋白干粉样品外，本项实验中所使用的试剂、用具均经过高压蒸汽灭菌(15磅，30分钟)，所有操作均在无菌室的超净工作台上进行。参照Roberts(Roberts，W.K.&Selitrennikoff，C.P.Biochim.Biophys.Acta 1986，880161-170)的菌丝生长抑制法，在直径9cm的培养皿中加入PDA培养基8ml，将每种经过斜面活化培养的真菌菌丝块接种于培养皿，每个培养皿接种同样的四块，置于24℃培养。待菌丝向外蔓延的圆面直径约3cm时，取无菌滤纸圆片(直径0.5cm)，平放在菌丝生长前方约1cm处，每皿五个。待测试样品用无菌双蒸水配制成不同浓度，分别滴加在滤纸片上，每一张纸片滴加10μl，其中位于中心的滤纸片滴加等量无菌水作为对照，置于24℃，培养24hr。加有抗菌活性物质的纸片周围出现抑菌圈，以肉眼可以观察到菌丝生长被抑制的蛋白含量为抗菌指标。结果显示PE3蛋白对木霉菌、黄霉菌菌丝的生长有明显抑制作用，抑菌圈分别达1.2cm和1.0cm，抑菌最低量分别为6.25μg和12.5μg；PE3对稻瘟菌也有抑制作用。
权利要求
1.一种抗真菌蛋白，暂命名为PE3，该蛋白是从有毒的豆薯种籽中分离纯化而得，其分子量为14KD，等电点为7.5，其特征在于它对木霉菌、黄霉菌有明显的抑制作用，对稻瘟菌也有抑制作用。
2.如权利要求1所述的一种抗真菌蛋白，其特征在于它对木霉菌的抑菌圈为1.2cm，抑菌量为6.25μg。
3.如权利要求1所述的一种抗真菌蛋白，其特征在于它对黄霉菌的抑菌圈为1.0cm，抑菌量为12.5μg。
4.一种权利要求1的抗真菌蛋白的分离纯化方法，包括盐溶液粗提、S-SFF强阳离子交换层析、DEAE-纤维素阴离子交换过滤、CM-纤维素阳离子交换梯度洗脱和G-75凝胶过滤，其特征在于采用了DEAE-纤维素阴离子交换过滤和G-75凝胶过滤。
5.一种抗真菌蛋白，暂命名为PA2，该蛋白来源于有毒的豆薯种籽，其特征在于该蛋白通过盐溶液粗提、硫酸铵沉淀、CM-纤维素阳离子交换柱梯度洗脱分离纯化而得，其分子量为20～50KD，对木霉菌有较强的抑制作用。
6.如权利要求5所述的一种抗真菌蛋白，其特征在于它对木霉菌的抑菌圈为3.5cm，抑菌量为8.89μg。
7.一种抗真菌蛋白，暂命名为PA3，该蛋白来源于有毒的豆薯种籽，其特征在于该蛋白通过盐溶液粗提、硫酸铵沉淀、CM-纤维素阳离子交换柱梯度洗脱分离纯化而得，其分子量为20～50KD，对木霉菌有较强的抑制作用。
8.如权力要求7所述的一种抗真菌蛋白，其特征在于它对木霉菌的抑菌圈为3.0cm，抑菌量为9.24μg。
9.一种权利要求1或5或7的抗真菌蛋白的应用，其特征在于这些抗真菌蛋白可给抗真菌植物转基因工程提供主要信息，将可通过转基因得到具有抗真菌能力的转基因植株，开辟新的植物育种新途径，在为防治真菌对农作物的侵染方面有实用的价值。
全文摘要
一种抗真菌蛋白,暂命名为PE3,其分子量约为14KD,等电点为7.5,对木霉菌、黄霉菌丝的生长有明显的抑制作用,其抑菌圈分别达到1.2cm和1.0cm,抑菌最低量分别为6.25μg和12.5μg;对稻瘟菌也有一定的抑制作用。后来又发现其CM－52柱分离的另外二种组分PA2和PA3对木霉菌也有较强的抑制作用,其抑菌圈分别达到3.5cm和3.0cm,其抑菌量约为8.89μg和9.24μg,分子量约在20～50KD。抗真菌蛋白作为一种基础蛋白将可通过转基因工程得到具有抗真菌病害能力的新植株,开辟了植物育种新途径。
文档编号C07K2/00GK1247871SQ98119100
公开日2000年3月22日 申请日期1998年9月14日 优先权日1998年9月14日
发明者郝冰, 叶晓明, 林玉娟, 陈明晃, 宋立军 申请人:中国科学院福建物质结构研究所