包含具有抗体Fc链的稳定、有活性人OB蛋白的结合物的组合物及方法

专利名称：包含具有抗体Fc链的稳定、有活性人OB蛋白的结合物的组合物及方法
技术领域：
本发明涉及在高浓度和生理pH或接近生理pH条件下稳定、有活性的人OB蛋白组合物。还提供相关的组合物、制造方法和应用上述组合物的方法。
背景技术：
尽管肥胖的分子基础大体说来未知，但鉴别出的“OB基因”和所编码的蛋白(“OB蛋白”)给应用于调节机体脂肪沉积的机制投入了一些曙光。张等，自然372425-432(1994)；也见修改文章，自然374479(1995)。PCT公开号WO 96/05309，1996年2月22日出版，题目“体重调节剂，相应的核酸和蛋白，以及其诊断和治疗的用途”完整地公布了OB蛋白和相关的组合物及方法，在此引入仅作参考。人OB蛋白的氨基酸序列在WO 96/05309专利(在此引入仅作参考)的SEQ ID NOS4和6中(该出版公告的第172-174页)公布，成熟蛋白的第一个氨基酸残基在22位，是缬氨酸残基。成熟蛋白为146个残基(或者如果49位的谷氨酰胺缺乏为145个，SEQ ID NO6)。
OB蛋白在ob/ob突变小鼠(小鼠肥胖是由于产生OB基因的产物缺乏)以及正常、野生型小鼠体内均具有活性。该生物学活性表明OB蛋白在诸多事件中，OB蛋白在体重减少中体现了其生物学活性。一般见，Barinaga，“肥胖”蛋白使小鼠苗条。科学269475-476(1995)和Friedman“体重控制的入门”自然385119-120(1997)。例如，已知在ob/ob突变小鼠中，施用OB蛋白导致血清胰岛素水平和血清葡萄糖水平的降低。也已知施用OB蛋白导致体内脂肪下降。该现象在ob/ob突变小鼠以及非肥胖的正常小鼠中均观察到。Pelleymounter等，科学269540-543(1995)，Halaas等，科学269543-546(1995)。也见Campfield等，科学269546-549(1995)(外周和中枢施用微克剂量的OB蛋白降低ob/ob和食物诱导肥胖的小鼠的食物吸收和体重，但在db/db肥胖小鼠中没有这些作用)。这些报道中没有观察到毒性，甚至在最高剂量下也没有。
为制备给人体注射的药用组合物，已经观察到人该氨基酸序列在生理pH下相对高的浓度是不溶解的，例如每毫升液体大约超过2mg活性蛋白的浓度。在每公斤体重毫克蛋白的剂量范围，如0.5或1.0mg/kg/天或更低，可预期是给较大的哺乳动物如人注射用的治疗有效量。为避免大体积注射增加蛋白浓度是必要的，大体积会使患者不舒适或引起可能的疼痛。
随着重组DNA技术的进展，在蛋白制剂中治疗用途的重组蛋白的可获得性也取得了进展。描述蛋白修饰和融合蛋白的综述文章见Francis，生长因子聚焦，34-10(1992)。
上述的一种修饰是使用免疫球蛋白的Fc区。抗体包括功能上互相独立的二个部分，结合抗原熟知为“Fab”的可变结构域和熟知的“Fc”不变区结构域，不变结构域提供与效应器如补体或吞噬细胞连接的功能。免疫球蛋白Fc部分具有长血浆半衰期，而Fab是短寿的。Capon等，自然337525-531(1989)。
用Fc结构域构建治疗蛋白提供较长的半衰期或掺入如Fc受体结合、蛋白A结合、补体固着和胎盘转移的功能，所有这些功能位于免疫球蛋白的Fc蛋白。同前，例如IgG1抗体的Fc区被融合到CD30-L的N-末端，CD30-L与CD30受体结合，CD30受体在霍金森氏病肿瘤细胞、退行性淋巴瘤细胞、T细胞白血病细胞和其他恶性细胞类型中表达。见美国专利号5,480,981。为了增加细胞因子短循环半衰期，抗炎和抗排斥的药物IL-10与鼠Fcγ2a融合。郑，X等，免疫学杂志，1545590-5600(1995)。研究还评价应用肿瘤坏死因子受体与人IgG1的Fc蛋白连接物治疗患败血性休克的病人。Fisher C等，新英格兰医学杂志，3341697-1702(1996)；Van Zee K.等，免疫学杂志，1562221-2230(1996)。Fc也和CD4受体融合以产生治疗爱滋病的治疗蛋白。见，Capon等，自然337525-531(1989)。另外，白介素2N-末端也与IgG1或IgG3的Fc区融合以克服白介素2的短半衰期和其循环毒性。见Harvill等，免疫技术195-105(1995)。
对胰岛素来说，已经报道了其悬浮制备物。但应用胰岛素的那些病情，对可用于任何其他蛋白包括OB蛋白的那些病情没有预测性。胰岛素是一种相当小的蛋白，具有独特的物理和化学特性，这些特性对确定配制制剂的条件是重要的。Brange，Galenics的胰岛素，Springer-Verlag 1987描述了胰岛素悬浮液(p.36)；也见，Schlichtkrull等，具有延长效应的胰岛素制备物729-777页，在Hassellblatt等实验药理学手册新系列XXXII-1/2卷Springer-Verlag Berlin，Heidelburg，纽约(1975)。
迄今为止，没有报道在生理pH下至少约2mg/ml浓度的人OB蛋白的稳定制备物，而更进一步，未见报道至少约50mg/ml或以上稳定浓度的活性人OB蛋白。再者，冷冻或冻干形式可用于改善自身稳定性，但比本发明描述的现成可用型悬浮液形式更不合乎需要。冷冻形式需要稳定冷冻温度下的贮存条件，由于用户级冰箱和冷冻器的去霜循环，稳定冷冻温度是不可能的。再者，冻干形式必须稀释和混合，是不方便的，可能损害病人的顺从性。从生产商的观点看，冷冻液的制造，贮存和船运花费昂贵，比现成可用型制剂的销售方式需要更多的监管工作。另外，为冻干制剂制造或否则制取可得到的合适稀释剂比不需要上述稀释剂的方法花费更多，并且效率更差。通过小体积注射传输含活性OB蛋白的人药用组合物的浓缩形式，一直来有需求。本发明完全满足这些需求。
发明概述本发明源于以下观察，某些悬浮制剂允许在生理pH下至少大约2mg/ml的浓度制备稳定的OB蛋白。至于在此所用的术语“生理pH”指的是大约6.0至大约8.0的pH。应用上述组合物允许OB蛋白治疗药以相对小体积传输。正如本发明进一步披露的内容，沉淀药物的应用使得制备的人OB蛋白悬浮液具有如下特性1.与以溶液形式相同的人OB蛋白相比较，改善了在生理pH下的稳定性。在如下操作性实施例中阐明的是在10mg/ml或较高浓度的人OB蛋白悬浮液，当与溶液中允许溶解的最高pH下相同浓度相比较时(人OB蛋白的天然形式在pH4时溶解，这不是生理pH)，在pH7下具有较好的HPLC(高压液相层析)图谱。以下还阐明的是在大约pH7下浓度为5mg/ml的Fc-OB融合蛋白悬浮液，该结果显示与可比较的Fc-OB融合蛋白溶液相比的贮存条件下较少的降解产物。
2.与溶液形式相同的人OB蛋白相比较持续的注射时间释放特征。下面的操作性实施例显示了，使用本发明高度浓缩的人OB蛋白悬浮液的持续释放效应。上述持续释放效应对该材料的活性维持相对较长的时期是有益的，因此与溶液中的人OB蛋白相比较具有相对较高的效力而需要注射的次数更少。
因此，本发明的一个目的是一种在生理pH下活性人OB蛋白的稳定制备物，其具有的浓度至少大约2mg蛋白/ml。例如，提供一种浓度至少2.0mg/ml和pH为7.0的活性人OB蛋白稳定制备物。浓度的上限是对人施用有效的那种悬浮液形式，正如下面所述，操作性实施例提供在生理pH下(例如，pH6.0～8.0)浓度高达100mg/ml。
在另一方面，本发明涉及一种稳定的人活性OB蛋白的制备物，其pH范围大约6.0～8.0，浓度至少约10mg/ml。
仍在另一方面，本发明涉及一种通过连接免疫球蛋白Fc区衍生的人活性OB蛋白的稳定制备物，其浓度至少约0.5mg/ml，pH大约6.0～8.0。更具体而言，提供了大约pH7.5，浓度5mg/ml至50mg/ml的活性Fc-OB融合蛋白的稳定制备物。
仍在其他方面，本发明提供稳定的人活性OB蛋白的制剂，其浓度为2mg蛋白/ml或更高，pH6.5至pH7.5。更具体而言，提供了pH7.0浓度为20mg/ml至100mg/ml的稳定人活性OB蛋白制剂。
在另一方面，本发明提供浓度为10mg/ml或更高，pH5.0～8.0的稳定人活性OB蛋白的制剂。
仍在另一方面，本发明提供连接免疫球蛋白Fc区而衍生的稳定人活性OB蛋白的制剂，其浓度为0.5mg/ml或更高，pH大约6.0～8.0。更具体而言，提供了大约pH7.5，浓度5mg/ml至50mg/ml的稳定活性Fc-OB融合蛋白的制剂。
而本发明的其他方面包括以上的药用组合物，制造上述组合物的方法和应用本发明组合物的治疗方法，以及制造含有本发明组合物用于上述治疗的药物的方法。
附图简述

图1A和1B是小鼠的剂量反应曲线，图(1A)为实施例1的本发明人OB悬浮液而图(1B)如在实施例1描述的人OB蛋白对照溶液。
图2是按实施例1中所描述的本发明OB蛋白悬浮液和人OB蛋白对照溶液在狗中OB血清水平图。
图3是反相高压液相色谱(RP-HPLC)图，描记37℃下7周的人OB蛋白制剂实施例1的人OB蛋白锌悬浮液为中间的描记线，实施例1的人OB蛋白对照溶液是顶线，而-80℃保存56天的人OB蛋白悬浮液在底线。
图4是描记人OB蛋白制剂在19℃下56天的RP-HPLC图实施例1的人OB溶液在顶线，实施例2人OB结晶悬浮液在中线，实施例2在-80℃下保持56天的人OB结晶悬浮液在底线。
图5A-5C是人met Fc-OB蛋白的DNA序列(SEQ ID NO1)和氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图6A-6C是人met Fc-OB蛋白变体的DNA序列(SEQ IDNO3)和氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
图7是通过反相HPLC测定的描述重组甲硫氨酰基化的人Fc-OB蛋白在108位asp(根据SEQ ID NO4用的数字为asp 335)形成异asp的速率图。
发明详述本发明稳定活性的OB蛋白组合物一般被分类为悬浮液，在该制剂中蛋白组分被沉淀悬浮在液体组分中。组合物含活性OB蛋白组分、沉淀剂、pH调节剂和液体载体。本发明的OB蛋白为无定形或结晶形式。
优选地，在人体中用作治疗或美容的组合物，用具有天然人OB蛋白的氨基酸序列的OB蛋白(见Zhang等，自然，同上)，及选择使用在细菌中表达N-末端有甲硫氨酰残基的OB蛋白。见PCT出版物WO96/05309，在此引入仅作参考，重组DNA意味着可用于制备本发明的OB蛋白。人们可选择氨基酸制造变化，只要这些变化保持该蛋白的完整折叠或活性就行。下面的表1列出了根据具体的特性(碱性、酸性、极性、疏水性、芳香族和大小(小))可使用的保守氨基酸替换。一般见，Ford等，蛋白表达和纯化295-107，1991，在此引入仅作参考。亦可出现小氨基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基，小的达到约20-25个残基的连接肽或者便于纯化的小延伸，如聚组氨酸束，抗原表位或结合结构域。
表1保守性氨基酸替换

一般来说，能显示在本发明的悬浮液中增加稳定性的人OB蛋白是那些接触生理pH时在溶液中暴露疏水区的种类。另外，通过免疫球蛋白Fc区连接到OB蛋白部分而衍生的人OB蛋白表现为在本发明的悬浮液中增加稳定性。
一般来说，免疫球蛋白Fc区可遗传性或化学性融合到人OB蛋白上。优选地，Fc区被融合到OB蛋白的N-末端。见共同未决的美国专利申请系列号08/770,973，提交日期1996年12月20日，针对优选的Fc-OB融合蛋白在此引入仅作参考优选地，可用具有人免疫球蛋白IgG-1重链的氨基酸序列的Fc区(见Ellison J.W.等，核酸研究，104071-4079(1982))。优选的Fc区在SEQ ID NO2(见图5)中给出。SEQ ID NO2的重组Fc-OB序列是378个氨基酸的Fc-OB蛋白(未计入甲硫氨酸残基)。在图5中Fc-OB蛋白的第一个氨基酸残基谷氨酸，以甲硫氨酸为-1位则为+1位。Fc部分的变体或类似物可通过例如进行氨基酸残基或碱基对的不同替换构建。
半胱氨酸残基能被缺失或用其他氨基酸取代，以防止Fc序列的二硫交叉联键的形成。特别是，SEQ ID NO2的第5位氨基酸是半胱氨酸残基。人们可以移去在第5位的半胱氨酸残基或用1个或多个氨基酸替换它。例如，丙氨酸残基可替换第5位的半胱氨酸残基，结果形成变异的氨基酸序列。同样地，SEQ ID NO2第5位的半胱氨酸可用丝氨酸或其他氨基酸残基替换或缺失。
变体或类似物也可通过在1、2、3、4和5位的氨基酸缺失制备，结果得到373个氨基酸的Fc-OB蛋白(未计入甲硫氨酸残基)。该序列在SEQ ID NO4中给出(见图6)。在这些部位的替换也能进行，包括在本发明的范围之中。
也可进行修饰以导入4个氨基酸替换以消除Fc受体结合位点和补体(C1q)结合位点。根据SEQ ID NO4的数字顺序，这些变异修饰包括第15位的亮氨酸用谷氨酸替换，第98位的谷氨酸用丙氨酸替换，第100和102位的赖氨酸用丙氨酸替换。
同样，一个或多个酪氨酸残基也能被苯丙氨酸残基取代。正如以上所描述，人们可选择氨基酸形成变化，只有这些变化保持融合蛋白的完整折叠或活性就可。
而且，Fc区也可通过化学或变化长度的氨基酸“接头”组分与Fc-OB融合蛋白的人OB蛋白连接在一起。上述化学接头在本领域众所周知。氨基酸接头序列包括但不局限于(a)ala，ala，ala；(b)ala，ala，ala，ala；(c)ala，ala，ala，ala，ala；(d)gly，gly；(e)gly，gly，gly；(f)gly，gly，gly，gly，gly；(g)gly，gly，gly，gly，gly，gly，gly；
(h)gly-pro-gly；(i)gly，gly，pro，gly，gly；和(j)(a)至(i)的任何组合。
本发明的沉淀剂可以是具有阳离子成分的盐类并且可从钙、镁、锌、钠、铁、钴、锰、钾和镍中选取。优选地，该盐类兼用于药用组合物中。
另外的沉淀剂可选自现在熟知沉淀蛋白药用可接受的制剂，如聚乙二醇或如下段给出的其他水溶性聚合物。有用的沉淀剂能诱导OB蛋白在中性pH下沉淀，但沉淀是可逆的或者用生理上相容的溶剂稀释能重新溶解。没有合适的沉淀剂，OB蛋白在中性pH沉淀成如下形式，该形式用生理学相容溶剂稀释是不可逆的。
pH范围优选地从大约pH4.0至大约pH8.0，而较优选地从大约6.5至大约7.5。对药用组合物最优选的pH是在该pH中，所用的OB蛋白在所选择的蛋白浓度可保持其最大的生物学活性。在非生理pH，本发明OB蛋白悬浮液也可具有优点。在pH5.0以下，本发明OB蛋白悬浮液比在相等pH溶液中相等浓度的OB蛋白更稳定(从寿命来看)。例如在pH4.0和浓度为50mg/ml时，本发明的悬浮液在体内施用时比相等浓度的溶液具有更大的生物学活性。
缓冲剂可选自能保持所需的pH而不改变组合物沉淀特性的那些类型。优选地，缓冲剂为药用制剂可接受的。Tris MES和PIPES对无定形和结晶形二种形式均可接受。磷酸盐是结晶形式的优选缓冲剂。
为方便治疗施用，最终的悬浮液优选的浓度为5mg/ml至100mg/ml。
使用方法治疗治疗用途包括体重调节，治疗或预防糖尿病，降低血脂(和治疗相关的病情)，增加体内瘦物质和增加胰岛素的敏感性。此外，本发明的组合物可用于制造1或多种药物，用于治疗或减轻以上的病情。施用方法一般通过注射，尽管其他方法例如肺传输也可使用。见PCTWO 96/05309，在此引入供参考，例如83页et seq.。本发明的悬浮液可以喷雾干燥成颗粒，其平均体积小于10微米，或更优选地，0.5～5微米。
体重调节本发明的组合物和方法可用于降低体重。从另一方面考虑，本发明的组合物可用于维持所需的体重或肥胖水平。如在鼠模型所说明的那样(见上)，本发明OB蛋白的施用引起体重减少。体内物质丢失主要是脂肪组织或脂肪。上述体重减少和伴随的病情治疗有关，例如以下的那些病情，因此能组成治疗应用。此外，如果体重调节仅为了改善身体外形，本发明提供美容的用途。
治疗糖尿病本发明组合物和方法可用于预防和治疗II型糖尿病。II型糖尿病和肥胖有关，应用本发明降低体重(或维持所需的体重，或降低或维持肥胖水平)也能减轻或预防糖尿病的加重。再者，甚至缺乏足以导致体重减少的剂量，本发明的组合物可用于预防或改善糖尿病。
血脂调节本发明的组合物和方法可用于血脂水平的调节。理想地，仅希望降低血脂水平或希望维持血脂水平的情况中，该剂量不足以导致体重减少。因此，在肥胖病人治疗的初始过程中，可使用如下剂量，即获得体重减少及伴随的血脂水平降低。一旦获得足量的体重减少，可施用下列剂量即足以预防重新获得体重而足以维持所需的血脂水平或例如在此给出的其他水平。这些剂量能通过经验确定，因为OB蛋白的效应是可逆的，如Compfield等，科学269546-549(1995)547页。因此，如果观察到某剂量导致体重减少而恰恰体重减少是不希望发生的，人们可施用更低的剂量，以便获得所需的血脂水平而维持所需的体重。如见PCT出版物WO 97/06816在此引入仅作参考。
增加瘦物质或胰岛素敏感性理想地，仅希望增加体内瘦物质的情形，该剂量不足以导致体重减少。因此，在肥胖病人治疗的初始阶段，可施用的剂量为因此得到体重减少和伴随脂肪组织降低/瘦物质增加。一旦达到足量的体重减少，可施用一种剂量足以防止重新增加体重而足以维持所需的瘦物质增加(或预防瘦物质缺乏)。为增加个体对胰岛素的敏感性，可采取相似的剂量考虑方案。可获得瘦物质增加而体重不减少，足以降低胰岛素(或支链淀粉，支链淀粉拮抗剂或激动剂，或噻唑烷二酮(thiajolidinediones)，或其他潜在的糖尿病治疗药物)的用量，该个体可进行糖尿病治疗。为增加整个强度，可考虑使用相似的剂量，可达到瘦物质增加而伴随整个强度的增加，该剂量不足以导致体重减少。其他优点如增加血液红细胞(和血液载氧量)降低骨重新吸收或骨质疏松，在不缺乏体重减少的情况下也可达到。如见PCT出版物No.WO97/18833，在此引入仅作参考。
综合治疗本发明的组合物和方法可用于和其他疗法结合，如改变饮食和锻炼，其他药物，如用于治疗糖尿病的那些种类(如，胰岛素和可能的支链淀粉，其拮抗剂或激动剂，噻唑烷二酮)(如见PCT出版物No.WO 98/08512，在此引入仅作参考)，降低胆固醇和血压的药物(如那些降低血脂水平或其他心血管药物)，增加活性的药物(如苯丙胺)，利尿药(消除液体)和食欲抑制剂(如对神经肽γ受体起作用的药物或5-羟色胺重吸收抑制剂)。上述施用可同时或依次进行。此外，本发明可以和外科方法结合使用，如旨在改变身体整个外形的美容手术(如，吸脂肪或旨在降低身体内物质的激光外科手术或旨在增加身体外部物质的植入外科手术)。伴随应用本发明的组合物和方法可增加心脏手术的健康效益，如设计作缓解由如动脉斑块等脂肪沉积阻塞血管壁引起的有害病情而使用的分流手术或其他手术。消除胆石的方法如超声或激光方法也可在本发明治疗方法过程之前、之中或之后使用。而且，本发明的方法可作为辅助物，用于骨折、肌损伤的外科手术或治疗，或用于增加组织瘦物质改善病情的其他治疗。
给出的下列实施例更充分地说明本发明，而不能解释为限制本发明的范围。实施例1给出pH7.0浓度为100mg/ml的无定形(与结晶形相反，如下面)的人OB蛋白悬浮液制备方法。实施例2给出结晶形OB蛋白悬浮液的制备方法。实施例3说明与OB蛋白溶液相比较，OB蛋白悬浮液改进的剂量反应。实施例4说明在狗模型中本发明的悬浮液延迟的时间作用特征。实施例5给出无定形Fc-OB蛋白悬浮液的制备方法。实施例6和7说明本发明悬浮液改进的稳定性。
实施例1无定形OB蛋白悬浮液的制备本实施例说明制备一种本发明人OB蛋白悬浮液。无定形人OB蛋白悬浮液通过用锌盐沉淀的方法制备。得到最终pH6.0～pH 8.0，浓度为100mg蛋白/ml的液体。也给出了pH4.0人OB蛋白溶液的对照组合物。
组合物蛋白组分PCT出版物WO 96/05309的SEQ ID NO4中说明的重组甲硫氨酰基人OB蛋白(“rmetHu-leptin”)，氨基酸数从22位(Val)开始而在氨基酸数167位结束，具有在N-末端一个甲硫氨酰基残基。
沉淀剂氯化锌缓冲液Tris、MES和Pipes最终pH6.0-8.0制备方法重组甲硫氨酰基人OB蛋白(“rmetHu-leptin”)溶液在水中注射浓缩到大约40mg/ml，用HCl酸化至pH3.0。加入氯化锌，然后通过加合适的缓冲液调整pH接近中性(大约pH7.0)而形成悬浮液。成功使用Tris、MES和PIPES缓冲液。最终条件一般是10-15mM缓冲液，20-1000μM锌，pH6.0～8.0和10mg/ml rmetHu-leptin。浓缩悬浮液使颗粒在4℃沉降几小时，然后移去上清液。该方法可重复几次直至达到最大浓度，使用得到的约100mg/ml的悬浮液。
对照组合物在pH4.0含有10mM乙酸盐和5％ w/v山梨醇中20mg/ml的重组甲硫氨酰基人OB蛋白(如上)溶液用作对照组合物。
实施例2制备结晶OB蛋白悬浮液本实施例说明制备本发明的结晶OB蛋白悬浮液。
蛋白组分如上实施例1用重组的甲硫氨酰基人OB蛋白。
方法浓度15mg/ml在1mM HCl中的rmetHu-leptin以1∶1比例与4M NaCl，100mM Tris，pH8.5，2％ v/v乙醇在4℃温合。通过缓慢地调整温度在14℃和25℃几小时，根据保温至最终温度的持续时间维持该温度至少2小时，自发地形成结晶。通过离心收获晶体，悬浮在合适的结晶稳定溶剂中，“母液剂”(即晶体在其中生长的液体)用注射法被更稳定的溶剂取代。合适的取代溶剂是20-25％聚乙二醇(具有分子量大约4000道尔顿至大约20,000道尔顿，措词“大约”意指商业PEG制备物的大约平均分子量)，合适中性pH缓冲液，优选地大约pH6.0至大约pH8.0，和优选的pH6.0～7.5的10mM磷酸盐缓冲液，以及2％ v/v乙醇。在一典型的制备物中，某些残留的盐类，通常小于0.25M可以保留。
实施例3与OB蛋白溶液相比OB蛋白悬浮液改进的剂量反应本实施例说明本发明OB蛋白悬浮液比溶液中OB蛋白更有效。正常瘦小鼠每天注射连续5天给予重kg体重1、10和50mg蛋白的本发明悬浮液或给予相同剂量的OB蛋白溶液。以所给的OB蛋白质量的每单位重量计算，给予悬浮液的小鼠比给予相等剂量溶液制剂的小鼠失去重量更多。该结果在图1A和图1B中说明。图1A表示当给予实施例1的悬浮液时体重变化的百分率。图1B表示当给予实施例1的对照溶液时体重变化的百分率。
本结果说明本发明的悬浮液在相同剂量下比以溶液形式所给的蛋白更有效。尽管不希望被理论束缚，本结果可能由于与溶液相比较，悬浮液较慢的吸收率有关。悬浮液在进入血液前必须溶解，结果该维持释放的效应导致更高的效率。以质量基础考虑，悬浮液中需要被施用的蛋白比溶液更少。进一步，在溶液中，在第5天10和50mg/kg剂量之间没有差异(给剂量的最后一天)(见如下表2)。悬浮液比溶液给出更确定的剂量反应曲线。
表2从第0天起重量变化百分率

数据是每处理5只小鼠的平均值方法动物用正常CD-1小鼠基础体重大约20克施用方式动物在相同部位每天被注射SC共5天。饲养方法动物以组分笼，随意喂食。组合物溶液用实施例1的rmetHu-leptin溶液，浓度为20mg/ml。悬浮液用实施例1的rmetHu-leptin悬浮液，pH7.0，10mMMES缓冲液，500mM Zn，20mg/ml。
PBS磷酸盐缓冲液用作安慰剂。
(用单独的悬浮液液体和溶液液体不含蛋白的剂量反应与PBS相似，数据未显示)。
实施例4在狗中OB蛋白的血清水平本实施例说明本发明悬浮液的延迟时间作用特征。
方法小兔猎狗被施与悬浮液或溶液的rmetHu-leptin。在如图2说明所示的时间吸取血清，测定OB蛋白水平。
表3<

所用的组合物溶液根据实施例1使用溶液，剂量为5mg/kg/天。
悬浮液根据实施例2使用悬浮液。见表。
动物在表3中给出的数据是3只动物的平均值，动物为正常小免猎狗。
饲养方式每只动物单只笼养，随意喂食。遵守良好动物饲养操作规则。
分析用Hotta等，生物化学杂志271255327-25331(1996)中所用的抗体分析法。
结果如图2所示，溶液浓度峰值在施用蛋白后1至2小时，而悬浮液浓度峰值更晚，在施用后10-12小时。这说明悬浮液维持最低有效剂量较长的时期。
实施例5制备无定形Fc-OB蛋白悬浮液本实施例说明制备一种本发明的人Fc-OB蛋白悬浮液。无定形人Fc-OB蛋白悬浮液通过锌盐沉淀制备。也给出pH7.5人Fc-OB蛋白溶液的对照组合物。
组合物蛋白组分在SEQ ID NO4说明的重组甲硫氨酰基人Fc-OB蛋白(“rmetHu-Fc-leptin”)，是一种373个氨基酸的融合蛋白，该蛋白的Fc部分为1-227位氨基酸而该蛋白的人OB蛋白部分为228-373位氨基酸，其N-末端具有甲硫氨酰基残基沉淀剂氯化锌缓冲剂100mM Tris最终pH7.5制备方法rmetHu-Fc-leptin溶液在100mM Tris缓冲液，pH7.5中浓缩到大约5mg/ml。加入氯化锌以形成悬浮液。
对照组合物含100mM Tris pH7.5 5mg/ml的rmetHu-Fc-leptin溶液(如上)用作对照组合物。
实施例6本发明人OB蛋白悬浮液的稳定性本实施例说明本发明悬浮液的无定形和结晶形两种形式在加速稳定测定的条件下比材料在溶液中更稳定。
图3说明比较在37℃下7周时间本发明悬浮液的锌无定形(如在实施例1中)和溶液形式(也在实施例1中)的RP-HPLC描记图。可以看出，本发明的悬浮液(中线)比溶液形式(顶线)有较少的峰(显示较少的断裂产物)。作为比较，底线表示贮存在-80℃7周的锌无定形。
图4说明比较实验例2的结晶悬浮液形式与溶液形式(实施例1)的RP-HPLC描记图。材料贮存在19℃56天。(贮存在37℃不是相关条件，因为在37℃下结晶形丧失其结晶结构)，表明溶液形式(主峰＝86％)比悬浮液形式(主峰＝94％)更多的降解。在底线的对照是贮存在-80℃56天的结晶形。相似的结果在4℃也观察到，尽管降解作用发生较缓慢。
主要降解产物似乎是在108位氨基酸的天冬氨酸(参照在PCTWO 96/05309的SEQ ID NO4，用“Val”残基为位置数1)。人们可以通过实验在这个部位选择较稳定的化学组分，例如另一个氨基酸以改善该分子的稳定性。总之，本发明的悬浮液比OB蛋白在溶液中更稳定。
实施例7本发明人Fc-OB蛋白悬浮液的稳定性本实施例说明本发明Fc-OB蛋白悬浮液的无定形在加速稳定测定条件下比材料在溶液中更稳定。
本发明悬浮液的锌无定形(如实施例5中)和溶液形(也如实施例5中)用于稳定研究，将悬浮和溶液形式贮存在4℃、29℃和37℃ 2周后进行。如图7所示，贮存在29℃和37℃的Fc-leptin悬浮液比分别贮存在相同温度的Fc-leptin溶液，显示为较低百分率的OB蛋白第108氨基酸天冬氨酸有关的降解产物。
尽管本发明已经用优选的实施方案方式描述，可以理解对本领域的技术人员来说可进行各种变化和修饰。因此，可以认为所附的权利要求书覆盖全部上述等值的变化，这些变化正如权利要求所要求的属于本发明的范围。
权利要求
1.pH大约6.0至大约8.0和浓度至少0.5mg/ml的人OB蛋白悬浮液，其中OB蛋白通过免疫球蛋白的Fc区连接到OB蛋白部分的N-末端衍生而成。
2.权利要求1的人OB蛋白悬浮液，其中所述的Fc-OB蛋白的Fc部分选自(a)在SEQ ID NOS2和4给出的Fc氨基酸序列；(b)(a)的氨基酸序列，具有在1个或多个下列位置的不同氨基酸替换或缺失(参照SEQ ID NO2用的数字编号)(i)1个或多个半胱氨酸残基被丙氨酸或丝氨酸残基所取代；(ii)1个或多个酪氨酸残基被苯丙氨酸残基所取代；(iii)在第5位的氨基酸用丙氨酸取代；(iv)在第20位的氨基酸用谷氨酸取代；(v)在第103位的氨基酸用丙氨酸取代；(vi)在第105位的氨基酸用丙氨酸取代；(vii)在第107位的氨基酸用丙氨酸取代；(viii)在第1、2、3、4和5位的氨基酸缺失；(ix)1个或多个残基取代或缺失以消除Fc受体结合位点；(x)1个或多个残基取代或缺失以消除补体(C1q)结合位点；和(xi)i-x的组合；以及(c)(a)或(b)的氨基酸序列，其N-末端具有一个甲硫氨酰基残基。
3.权利要求1的人OB蛋白悬浮液，其中所述的浓度至少为5mg/ml。
4.权利要求1的人OB蛋白悬浮液，其中所述的浓度在5mg/ml和50mg/ml之间。
5.权利要求1的人OB蛋白悬浮液，其中所述的pH为pH7.0。
6.权利要求2的人OB蛋白悬浮液，其中所述的人OB蛋白是rmetHu-Fc-leptin。
7.权利要求1的人OB蛋白悬浮液，含有药用沉淀剂。
8.权利要求1的人OB蛋白悬浮液，含有的沉淀剂选自盐类和水溶性聚合物。
9.权利要求1的人OB蛋白悬浮液，含有的沉淀剂选自钙、镁、锌、钠、铁、钴、锰、钾和镍。
10.通过施用有效剂量的根据权利要求1的人OB悬浮液治疗患某一病情的个体的方法，所述的病情选自(a)体重调节，(b)肥胖调节，(c)糖尿病，(d)血脂水平调节，(e)增加瘦物质，和(f)增加胰岛素的敏感性。
11.制备人OB蛋白悬浮液的方法，包括在合适条件下，把沉淀剂和在溶液中的人OB蛋白组合在一起，其中所述的OB蛋白通过一种免疫球蛋白的Fc区连接到OB蛋白部分的N-末端衍生而成；使所述的人OB蛋白沉淀，收集所述的沉淀人OB蛋白；和任选地，把所述的人OB蛋白重新悬浮在稀释剂中。
12.权利要求11的方法，其中所述的人OB蛋白重新悬浮在pH6.0～8.0稀释剂中。
13.权利要求11的方法，其中所述的人OB蛋白是rmetHu-Fc-leptin。
全文摘要
本发明涉及OB蛋白组合物和相关的方法。在此提供在生理pH下稳定并具有活性的OB蛋白悬浮液。上述OB蛋白悬浮液用于治疗或调节体重肥胖水平、糖尿病和其他病情。
文档编号C07K14/47GK1274289SQ98804225
公开日2000年11月22日 申请日期1998年4月16日 优先权日1997年4月17日
发明者D·N·布雷姆斯, D·L·弗伦奇, M·A·斯皮德 申请人:安姆根有限公司