用于结合dna的氧化苯乙烯聚合物的制作方法

专利名称：用于结合dna的氧化苯乙烯聚合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于化学和生物学测试和试验的实验室制品，更具体地，本发明涉及一种固定DNA的表面。
背景技术：
聚合物已经被作为容器广泛用于细胞培养、生物测试、医学研究和其它用途。某些聚合物如苯乙烯聚合物(更具体的是聚苯乙烯)最适合用作生物测试用专业产品中的基质并且通常被采用。例如，聚苯乙烯价格便宜，在光学上透明，并且能在低温下加工。
将DNA直接固定到基质表面对于分子生物学中的各种测试系统具有许多用途，例如免疫-PCR或具有特异性标记探针的核酸的检测，即靶标捕获杂交(target capturehybridization)。靶标捕获杂交依靠将捕获性寡核苷酸分子(通常是能从天然来源分离出来的或通过标准分子生物技术产生的单链DNA或RNA片段，它具有2-40个核苷酸)固定在支持物表面上，然后使标记的互补性靶DNA链和固定的分子杂交。
如果胺化的核酸分子被吸附或共价连接在支持物上，其连接强度足以使其不被水或水性缓冲液从支持物上洗去，则称该分子“固定”在固体支持物上。在用吸附作为连接方法的系统中，总是会发生捕获性寡核苷酸有一定量的释放。因此，共价结合寡核苷酸是较佳的。
通过共价键固定胺化DNA的一种方法包含将二醛基淀粉(DAS)或N-氧琥珀酰亚胺酯(NOS)连接在聚合物表面上。在具有DAS涂层的表面上，与胺化的捕获性寡核苷酸连接的NH2通过共价键与DAS的醛基团连接，从而通过该涂层将寡核苷酸分子固定在聚苯乙烯表面上。美国专利5,563,215和5,281,660中公开了一种将DAS连接到细胞培养板表面上的方法。
关于NOS涂层，具有通过合成或体外操作加入的伯胺的DNA可以直接与NOS表面偶联。当伯胺在稍偏碱性pH下和NOS基团反应时，该酯在胺攻击羰基基团并取代N-氧琥珀酰亚胺基团时经历亲核取代。该反应的特异性产生了固定效应。
将DNA固定到基质表面上的另一种技术是将仲胺共价接枝到聚苯乙烯表面上。在该技术中，首先用多核苷酸激酶和ATP使寡核苷酸的5′端磷酸化。然后用碳化二亚胺将磷酸化的DNA 50°下偶联表面上的仲胺5小时。从而通过氨基磷酸酯键固定DNA。
表面处理存在的问题涉及涂层如DAS或NOS，以及连接的仲胺。随着时间的变化，或当其受到不同的环境应力作用，表面将变得不稳定，所附涂层的固定性质将变差。另外，胺化的DNA结合到这些经处理平板上的偶联效率是非常低的，低于0.1％。而且，聚合物基质的表面处理也为生产过程增加了一个步骤，从而增加了最终成品的成本。
本发明提供了由相当纯的聚苯乙烯制得的共价结合胺化DNA的产品的使用方法。该产物象已经DAS或NOS处理过的基质一样好地工作，但是没有加入涂层的成本。本发明还能经受各种环境应力作用而不丧失任何其固定性质。另外，由于本发明的产物通常对胺基基团有活性，因此它能结合肽、用于免疫试验的低分子量抗原、以及抗体、细胞附着因子和其它生物活性分子。
发明概述本发明提供了一种将胺化的DNA固定到基质表面上的方法。该表面可广泛用于各种模制的实验室产品，包括多孔板、细胞培养皿和生物容器。该方法包括下列步骤提供一个表面氧含量在0.3至4.0原子百分数之间的聚苯乙烯基质，和将经胺修饰的寡核苷酸连接到基质表面上。所得的产品包含表面氧含量在0.3-4.0原子百分数之间的聚苯乙烯基质，以及直接连接在基质表面上的大量胺修饰的寡核苷酸。
附图简述

图1显示了不同表面对结合胺化DNA的效应。
图2显示了NOS涂覆的聚苯乙烯的结合效应和未处理的聚苯乙烯条的结合效应之比较。
图3显示了在采用不同pH的结合溶液时，聚苯乙烯表面氧含量对结合胺化DNA能力的效应。
图4显示了pH对结合胺化DNA能力的效应。
图5显示了湿度对结合胺化DNA能力的效应。
图6比较了未修饰的和胺修饰的cDNA在氧化的聚苯乙烯和NOS涂覆的聚苯乙烯上的固定化作用。
图7比较了具有不同浓度的胺化DNA的溶液对光学透明的和黑色不透明聚苯乙烯的固定化性质。
图8比较了胺化的cDNA在光学透明和黑色不透明的反应性聚苯乙烯上的结合。
发明详述本发明来自发明者的偶然发现。发明者为探索胺化DNA结合到不同表面所涉及的机制而进行研究。胺化DNA指经过修饰在末端连接伯胺的DNA寡聚物。发明者用涂覆了NOS和DAS的聚苯乙烯多孔条，并将结果和作为对照的未涂覆的聚苯乙烯孔条比较。“多孔条”或“孔条”由多个孔(通常是8个)组成，其类型包括在多孔板中的孔，它们相互连接形成线性排列。美国专利3,649,464显示了一种多孔板，美国专利5.084,246显示了一种多孔条。令发明者惊讶的是，未涂覆的未经处理的对照条与DNA的结合和经处理的条一样好。然后，发明者开始进行研究来解释这看似异常的结果。首先，发明者注意到，用多孔板代替孔条与未处理的聚苯乙烯对照进行的所有其它研究，平板上的检测结果显示没有显著的结合。
在得到该观察结果后，发明者开始研究比较各种基质表面，以确定它们结合胺化DNA的能力。它们选择的基质是(1)平的未经处理的聚苯乙烯板和条，以商品名“MEDIUM BIND”购自Corning Costar Corporation，(2)已经受3mRadγ辐射的聚苯乙烯平板和条，以商品名“HIGH BIND”购自Corning Costar Corporation，(3)涂覆了NOS的聚苯乙烯板和条，和(4)由已经受电晕放电的、聚苯乙烯制成的组织培养板。应注意，商品名“HIGH BIND”和“MEDIUM BIND”指产品在ELISA试验中结合蛋白的倾向性；它并不是指结合胺化DNA的能力。
用比色检测生物素化的DNA获得结合数据的程序如下1.在平板或试条中，加入100微升/孔的胺修饰的探针寡核苷酸(以寡核苷酸结合缓冲液(50mM Na2PO4，pH8.5，1mM EDTA)配)。使该混合物4℃培育过夜，或37℃培育1小时。
2.用PBS洗涤平板三次，除去未偶联的寡核苷酸。
3.每孔加200微升配制在寡核苷酸结合缓冲液内的3％BSA，封闭未反应的活性基团。然后37℃培育平板或试条30分钟，然后倾析。
4.加入100微升/孔含有目标核酸的杂交溶液。然后49℃培育平板或试条1小时。
5.用预热的2XSSC(3.0M NaCl；0.3M柠檬酸钠，pH7.0)0.1％SDS洗涤孔两次，再49℃浸泡5分钟。
6.加入100微升/孔含有1∶1000稀释的链霉亲和素-过氧化物酶偶联物的封闭液。37℃培育平板或试条30分钟。
7.用PBS洗涤孔三次。
8.加入100微升/孔新鲜的底物溶液。在10、20和30分钟读取405nm的OD读数。OD读数不作校正，作为本底吸收值。
在产生图1所示结果的试验中，将胺化DNA施加到平板上至浓度为1.0pmol/孔，并在37℃培育1小时。加入新鲜的底物溶液后20分钟，记录结果。所取的读数是四个不同孔的读数平均值。噪声是DNA探针没有连接时读取的读数，信号是有DNA探针时测得的读数。本底噪声读数通过按照上述所有列出的制备步骤只是不加入任何探针DNA来获得。从加入探针DNA获得的信号中减去该噪声水平，就可以消除所有非特异性的结合信号，获得结合效率的真实测定值。
从图1可以观察到，未经处理的聚苯乙烯条(Med St.)与胺化DNA的结合比未经处理的平板(Med Pl.)或任何经处理的表面都更为有效。
作为进一步的描述，进行以下实验，其结果显示在图2中。将不同浓度的胺化DNA(以寡核苷酸结合缓冲液(对于NOS涂覆的平板，pH8.5，1M NaCl，50mM磷酸；对于未经处理的试条，0.1M磷酸，pH11.0)配制)施加到NOS涂覆的聚苯乙烯平板和未经处理的聚苯乙烯试条上，37℃培育1小时。加入底物溶液后20分钟，读取405nm的OD读数，取4个孔的平均值。如结果所示，未经处理的聚苯乙烯试条表现出更多信号，尤其在较低浓度下，因此结合性质比在这些条件下的NOS涂覆的表面更佳。
然后，发明者试图确定未经处理的聚苯乙烯平板与未经处理的相同聚苯乙烯试条相比有何不同。发现用于本实验的多孔试条由一模塑过程产生，该过程与用来形成多孔板的模塑过程稍有不同。第一，在模塑试条过程中，模具中没有用润滑剂。相反，模塑平板时需要在模具空腔内有润滑剂(例如硬脂酸锌)以便将器具适当的挤出。第二，试条模塑采用的通气比平板模塑更多。考虑到这些，发明者开始密切关注未经处理的试条和平板的表面化学性质，更具体地说，是聚苯乙烯的表面氧含量。
发现制备孔条的方法产生了一种表面氧含量约为0.6％的产物，而用润滑剂和较少通气制得的平板的表面氧少大约4倍。随后的测试揭示，存在一个产生有效结合或固定胺化DNA的基质的表面氧最适水平。
图3显示了表面氧和结合胺化DNA能力之间的关系。将四种不同pH水平的结合溶液配制的、以1.0pmol/孔浓度的胺化DNA施加到聚苯乙烯表面上，并于37℃培育1小时。通过从有效结合表面的标记的寡核苷酸收回的信号量测定结合胺化DNA的能力。这些结果是在加入底物溶液后20分钟读取405nm读数获得的，它们表示从四个不同孔读数的平均值。表1显示了图3所示的测试结果。
表1<
>从图3看出，结合胺化DNA的条件在约0.3-2.0原子百分数下的未处理聚苯乙烯条中最优，其随结合溶液的pH稍有变化。在调查的四个pH水平中，用pH为11的寡核苷酸结合缓冲液在每个测试点提供了最佳的结合效果。
当聚苯乙烯条经过磨蚀以致接触模具的表面被刮去，氧含量和结合能力均下降，从而证实了表面上的氧的重要性。当用1.5mRadγ消毒照射聚苯乙烯平板时，氧原子含量以及平板的结合能力均显著增加。然而，当聚苯乙烯经受更高剂量的γ辐照(即3.0mRad)后，表面氧含量增加，而结合能力却渐渐减少。该数据提示了一个结合胺化DNA最优水平的表面氧含量。
应当注意，尽管最优的表面氧原子百分数大约在0.3-4.0之间，但是当用pH3、6或11的结合溶液时，表面氧原子百分数在4.0-8.0之间的结合能力仍有一定程度的增强(如图3所示)。另外，表面氧原子百分数在0.2-0.3之间的聚苯乙烯有一些有利的结合。结合信号低于0.5的聚苯乙烯基本上丧失了其作为制品用于需要固定胺化DNA的试验中的用途。
除了用制备孔条的方法来模制聚苯乙烯制品，还可用本领域技术人员已知的几种方法来提高表面氧含量。一个例子是用合适量的γ辐射处理。影响表面氧含量的其它已知方法包括UV辐照、臭氧处理和电晕放电。表面氧含量可以根据这些处理的强度和时间而不同。
图4描述了pH对具有最优表面氧原子百分数的未涂覆的聚苯乙烯板的结合能力的效应。在产生图4所示结果的实验中，将胺化DNA以1.0pmol/孔的浓度施加到板上，并和不同pH的缓冲液一起在37℃下培育1小时。在加入新鲜的底物溶液后20分钟，读取405nm的OD读数，获得结果。图示的数值是四个不同孔的结果的平均值。这些结果表明，与DAS或NOS涂覆的表面不同，胺化DNA将在不同pH水平下和该表面结合。
图5描述了湿度在一段时间内对胺化DNA结合的效应。在试验前，将未处理的聚苯乙烯条以及涂覆了NOS的条和板于25℃、85％湿度下保藏4周。将胺化DNA以1.0pmol/孔的浓度施加到板上，并于37℃培育1小时。在加入新鲜的底物溶液后20分钟，读取405nm下的OD读数，获得结果。图示数值为四个不同孔的结果的平均值。从图5可以看出，在各测试点上，未处理的聚苯乙烯条与胺化DNA的结合比涂覆了NOS的试条更佳。
产生的数据进一步表明，连接伯胺和DNA分子的连接臂是DNA结合表面氧原子百分数在0.3-4.0之间的未处理的聚苯乙烯所必需的。如本文所述实验中所采用的，用长度在6和12个碳原子之间的碳链分子作为连接臂。已经发现，与有连接臂时的结合结果相比，没有连接臂时获得的信号低25％。还进一步发现，连接臂的长度不会显著地影响DNA结合。此数据提示，胺化DNA固定到具有最佳表面氧含量的聚苯乙烯上非常可能是通过NH2和聚苯乙烯表面之间的化学或物理键而发生的。它还消除了连接臂中非极性碳-碳链和非极性聚苯乙烯表面之间疏水性结合有强促进作用的可能性。
图4所示的pH实验结果还一定程度地显示了聚苯乙烯和胺化DNA之间的结合机制。该结果显示有两个最大峰，在pH6和pH11处。这提示可能有两种不同的机制涉及胺化DNA与表面氧含量在0.3-4.0原子百分数之间的聚苯乙烯表面的结合。pH6时的最大值可能表示物理或化学键合—胺化DNA上的NH3+基团和氧化的聚苯乙烯表面上的羧酸酯基团之间的离子键或胺化DNA上的NH2基团和氧化的聚苯乙烯上的羰基基团之间的化学反应。pH11上的pH最大值可能是由于胺化DNA上的胺基团和氧化的聚苯乙烯表面上的羧基之间化学键合。
然而，实施本发明不需要知道胺化DNA与具有必需表面氧含量的聚苯乙烯表面结合背后的机制的知识。
另外，如图6所示，当采用pH11的结合溶液时，表面氧含量为0.62原子百分数的聚苯乙烯与胺修饰的cDNA的结合显著优于NOS涂覆的聚苯乙烯或未修饰的cDNA。这表明，即使是100个以上核苷酸(cDNA)的胺化DNA也能有效地固定在具有最佳表面氧含量的聚苯乙烯上。另外，甚至未修饰的cDNA分子与氧化聚苯乙烯的结合都要优于修饰的cDNA分子与NOS涂覆表面的结合。这可能提示，在cDNA分子中，来自多个个别核苷酸的氨基参与了固定作用。
应当理解，具有最佳表面氧水平的聚苯乙烯表面的所述结合效应不局限于胺化的DNA。该表面通常对胺基团有反应。这暗示可以用各类侧基如羧基、胺、生物素等来衍生这些反应性的聚苯乙烯。因此，可共价连接更大的生物活性分子如抗原、抗体和细胞附着因子，从而将它们固定在聚苯乙烯表面上。实际上，反应的聚苯乙烯将和细胞附着肽反应，为内皮细胞系提供有效的细胞生长表面。该方法还可延用包括束缚肽的聚环氧乙烷。
本发明的一个应用是设计聚苯乙烯上的图案，用结合细胞和不结合细胞的交替区域、或结合DNA和不结合DNA的交替区域形成测试阵列。个别结合区可以是独立测试的对象。交替区域例如可以这样制得提供具有非结合性质的聚苯乙烯(表面氧含量最好在0.3-8.0原子百分数范围外)，仅选出部分表面用γ辐射处理来产生结合性质(表面氧含量最好在0.3-4.0原子百分数之间)。指定为非结合性的表面区域例如可以用有图案的掩模来屏蔽辐射。
也相信，在0.3-8.0原子百分数范围内的表面氧含量所显示的独特的固定化性质能延用到其它苯乙烯聚合物，例如苯乙烯丙烯腈共聚物(SAN)、ABS(丙烯腈-丁二烯-苯乙烯)、丁二烯-苯乙烯共聚物(HIP和MIP，K-resin和Kraton(R))、聚对甲基苯乙烯、苯乙烯-丙烯酸共聚物、聚α甲基苯乙烯和含有苯乙烯为基的聚合物的聚合混合物。目前，对这些聚合物的初步测试已经确认了这一观点。
还应注意，表面氧含量为0.62原子百分数的光学上透明的聚苯乙烯(MEDIUMBIND)与表面氧含量为0.62原子百分数的黑色不透明苯乙烯-丁二烯共聚物(MIPS)的寡核苷酸结合效应的比较。从图7和图8所示的固定数据可以推断，黑色不透明的和光学上透明的聚苯乙烯之间的结合胺化DNA或cDNA的能力之间没有显著不同。这提示，用来形成不透明MIPS的颜料对表面结合没有不利影响。这与在依赖不透明基质限制背景噪声的化学发光或荧光固定试验中不透明聚苯乙烯的潜在用途有很大的关系。
尽管本发明出于描述目的作了详细描述，但是应当理解，这些详细描述只是为了这个目的，本领域技术人员能在不脱离下列权利要求确定的本发明的精神和范围内对其作各种变化，例如改变其它聚合物的表面氧含量。
权利要求
1.一种将DNA固定在表面上的方法，该方法包括a)提供表面氧含量在0.2至8.0原子百分数之间的苯乙烯聚合物基质，和b)将DNA连接到该基质表面上。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA是胺修饰的寡核苷酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA是胺修饰的cDNA。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA是未经修饰的cDNA。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述苯乙烯聚合物基质具有0.3-4.0原子百分数之间的表面氧含量。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述苯乙烯聚合物基质具有0.3-2.0原子百分数之间的表面氧含量。
7.一种用于化学和生物分析的制品，它包含表面氧含量在0.2-8.0原子百分数之间的苯乙烯聚合物基质，和直接连接在所述基质表面上的多个DNA分子。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述DNA分子是胺修饰的寡核苷酸。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述DNA分子是胺修饰的cDNA。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述DNA分子是未经修饰的cDNA。
11.根据权利要求7所述的制品，其中所述苯乙烯聚合物基质的表面氧含量在0.3-4.0原子百分数之间。
12.根据权利要求7所述的制品，其中所述苯乙烯聚合物基质的表面氧含量在0.3-2.0原子百分数之间。
13.根据权利要求7所述的制品，其中所述基质是多孔板。
14.根据权利要求7所述的制品，其中所述基质是有多个孔的条。
15.一种将胺化的生物分子固定在表面上的方法，该方法包括a)提供表面氧含量在0.2至8.0原子百分数之间的苯乙烯聚合物基质，和b)将携带生物分子的胺连接到该基质表面上。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述苯乙烯聚合物基质的表面氧含量在0.3-4.0原子百分数之间。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述苯乙烯聚合物基质的表面氧含量在0.3-2.0原子百分数之间。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物分子是肽。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物分子是抗原。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物分子是抗体。
21.根据权利要求15所述的方法，其中所述生物分子是细胞附着因子。
22.根据权利要求29所述的制品，其中所述结合区的表面氧含量在0.3-2.0原子百分数之间。
23.根据权利要求29所述的制品，其中所述生物分子是胺修饰的寡核苷酸。
24.根据权利要求29所述的制品，其中所述生物分子是肽。
25.根据权利要求29所述的制品，其中所述抗原分子是抗原。
26.根据权利要求29所述的制品，其中所述生物分子是抗体。
27.根据权利要求29所述的制品，其中所述生物分子是细胞附着因子。
28.一种用于化学或生物测试的基质的制备方法，该方法包括a)提供具有一个表面的苯乙烯聚合物基质，和b)使所述表面受0.1-3.0mRad之间的γ消毒作用。
全文摘要
本发明提供了一种将胺化DNA固定在基质表面上用于DNA杂交试验的方法。该表面可广泛用于各种模制实验室制品,包括多孔板、细胞培养皿和生物容器。该方法包括下列步骤:提供表面氧含量在0.3—4.0原子百分数之间的聚苯乙烯基质,以及将胺修饰的寡核苷酸连接到该基质表面。本发明还公开了所得的制品,该制品包含表面氧含量在0.3—4.0原子百分数之间的聚苯乙烯基质,以及多个直接连接在基质表面上的胺修饰的寡核苷酸。
文档编号C07K16/00GK1265666SQ98807810
公开日2000年9月6日 申请日期1998年7月30日 优先权日1997年7月30日
发明者D·C·布克班德, L·S·赫什, X·谢 申请人:康宁股份有限公司