在转基因苜蓿植株中的蛋白生产的制作方法

专利名称：在转基因苜蓿植株中的蛋白生产的制作方法
技术领域：
本发明涉及在苜蓿植株中生产转基因蛋白。更具体地讲，本发明涉及转基因苜蓿植株中生产多聚体蛋白，以用于诸如诊断测定的多种应用。
用于多种药物相关应用的蛋白的使用要符合政府确立的严格管理要求。例如，在美国，生物制品评价和研究中心(CBER)公布了一套文件，概述了关于转基因生产的蛋白的生产和监测的要求(参见fttp∥www．fda．gov／cberftp／html)，在加拿大，有一套相似的与生物制品生产的应用相关的管理条例。CBER文件指出，应该由可靠的持续的资源生产生物制品，以确保获得一致的制品(ftp∥ftp．fda．gov／cber／ptc／ptc_mab．txt)。这是因为在批准所述制品使用之前，必须对所述制品进行多方面测试和验证，并且所述制品必须可以以同样的形式得到以用于未来的销售。有几个建立成熟的表达系统用以生产生物制品，包括用于细胞培养物的主细胞库、转基因植物的种子库、用于转基因表达系统的病毒种子原种和用于转基因动物的建立者品系。为使用瞬时表达系统必须产生主载体种子原种，并且定期测试所述表达构成物的稳定性。如果要由细胞系生产诸如单克隆抗体的蛋白，则主细胞库和工作细胞库均需要关于亲代细胞系的特征鉴定、细胞生产方案、纯化和质量控制的文件。尤其是如果开始临床试验，对生产或配制的任何改变则需要对主细胞库和工作细胞库以及制品进行广泛的再特征鉴定，因为这些改变可能导致生物活性的显著改变。CBER文件“用于人类用途的单克隆抗体制品的生产和测试中考虑的要点”(1997年2月28日)中陈述“建议用于临床前研究的材料的生产采用的方法应该与用于或计划用于生产临床试验的材料的方法相同”。而且，如果将进行任何扩大生产，例如用于2期研究，则“可能必须证明制品的可比性…这可能需要或不需要额外的临床研究”(ftp∥ftp．fda．gov／cber／ptc／ptc_mab．txt)、已经用植物来生产转基因蛋白，然而，以上讨论的适用于主细胞系的维持的考虑同样适用于植物相当物(参见Miele，1997)。由于种子不可能无限贮存，因此用于转基因植物的种子库需要定期扩增。种子原种的贮存必须减少对所述目的转基因(the transgene of interest)的潜在的遗传损害。可能影响种子库的任何其它因素也必须加以控制，包括昆虫、真菌或细菌对种子的污染。此外，必须检测所述转基因的稳定性以及产物在一批给定种子的代表植株中的表达水平、或在再扩增种子库后产物在各批种子之间的表达水平。也可能需要比较由不同种子库生产的制品的额外的资料。这后一特征鉴定也适用于鉴定在收获种子原种中年与年之间的变异。一般而言，制品的研制需要持续检测转基因产物的生化特性和生物特性(Miele，1997)。当这些标准与用以生产多聚体蛋白植物系统结合时，问题复杂化了，因为为了生产能够生产多聚体蛋白的杂交种子，得自各批同源种子、如上概述需要再扩增和维持的转基因植株需要杂交，以生产最终的杂交种子，这又必须如上所述进行维持。显然，需要稳定的并且导致持续供应蛋白、而不需广泛维持多个种子库的替代的转基因蛋白的资源。
在文献中，充分确立了用植物制备转基因蛋白，并且已经建立了几个成功的转化系统。已经通过烟草植株的有性杂交子代生产多聚体蛋白(Hiatt 1990，Hiatt和Pinney，1992；Ma等1995)，然而，迄今为止，在药学应用方面已经用于转基因蛋白生产的所有植物来源都利用一年生植物。这必需不断地如上所述扩增并且再检验种子库原种。显然，如果利用多年生植物物种来产生转基因蛋白，则可能大大降低总体维持费用和各批之间的变异性。而且，如果收获多年生植物的营养体结构作为转基因蛋白的来源，则更降低了管理上的要求。为了确保转基因蛋白多年生来源的生产，必须考虑涉及上述关于得自稳定、持续来源的制品的可靠性一致性的要求的许多因素。
最重要的血液分组试剂之一是用以检测不凝集型抗体的抗人IgG试剂。已经获得了具有合适抗人IgG特异性的小鼠mAb，并用其逐渐取代传统用于Coombs试剂的兔多克隆抗人IgG(St Laurent等1993)。这些mAb用B细胞杂交瘤的大规模培养物生产。尽管该方法可靠，但该方法很昂贵，因为它需要复杂的设备、昂贵的培养基和受过训练的人员。与mAb其它诊断应用相比，用于血库测试的蛋白的市场是高度竞争性的；因此蛋白的价格相对低，并且mAb生产的成本效率已成为关键的问题。
编码mAb轻链和重链的cDNA克隆的分离，已经允许抗体基因在各种异源系统中表达，所述异源系统包括细菌、真菌、昆虫细胞、植物和非淋巴类哺乳动物细胞(Wang等1995；Wright等1992)。在这些系统中，植物看来是成本效率方面最有前途的系统之一。然而，根据烟草中的初步证明，重要的是发现使该技术可以满足市场性的现代要求的作物。Hiatt等(WO 96／21012，1996年7月11日公开)公开了用于在植物中制备用于抗真菌病原体的治疗免疫球蛋白(“保护蛋白”)的方法。在EP 0 657 538中，Galeffi和Natali公开了用于治疗或诊断应用、识别乳房肿瘤和卵巢肿瘤中存在的HER-2癌基因的抗体的生产。重要的是发现可以生产重组蛋白、且可以满足对市场性的现代要求的作物。这些要求不仅包括生产成本的竞争性，而且包括可靠性，这暗示除非可以建立长期稳定的纯化重组分子的供应，否则必须开发一些方法，确保可以衍生克隆群体的认可的源材料的持久性(perenniality)。对于B细胞杂交瘤，通过建立主细胞库确保持久性，所述主细胞库包括取自同源库并在液氮中冷藏的等份细胞。Hiatt(1990)提出，苜蓿、大豆、番茄和马铃薯作为繁殖抗体的宿主可能是有用的供替代的选择。苜蓿是在目前农业生态系统中生产的最便宜的植物生物质之一，在大多数气候条件下的其多年生性使得它成为持续农业的有吸引力的作物。而且，苜蓿(Medicago sativa L．)不需要每年耕种和栽种，并且建立成熟了残留植物组织用于动物饲料的用途(Austin和Bingham，1997)。然而，几项研究已经检查了青贮饲料物种中蛋白水解的程度，已知蛋白水解在豆科植物饲料物种中比禾本科植物物种中更加广泛，而苜蓿显示最高水平和程度的蛋白水解(Jones等1995；Papadopoulos和McKersie，1983)。此外，本领域众所周知，不是所有的苜蓿植物都是多年生的，在多年生苜蓿植物中，不是所有的均适合于转化方案(Desgagnés，1995)。
在文献中已经已经关注到转基因蛋白在植物组织中以及在提取时的稳定性。然而，对于抗体在植物细胞系统中的稳定性知之甚少(Wongsamuth和Doran，1997)。数位研究人员(Hiatt等(1989)、During等(1990)、Ma等(1995)、Ma和Hein(1995)、Schouten(1996))已经观察到，包含指导构成物在内质网中共同翻译插入的信号序列的嵌合构成物，提高构成物在转基因植物中的稳定性。在缺乏前导序列的情况下，转基因蛋白的得率非常低(Hiatt等，1989)。通常的作法是，在提取混合物中包括蛋白抑制剂，以便将来自转基因植物组织的蛋白得率最大化。然而，由植物适合市场地生产转基因蛋白需要简单性。例如，Austin和Bingham(1997)综述了于田间位点的大规模浸渍和汁液提取方案，并且数小时后于加工厂进行加工。这类方案使用水和机械浸渍，并且如果提取物中的蛋白水解严重，或如果在提取期间需要蛋白酶抑制剂，则这类方案可能不可行。对于已知尤其在收获后表现出高速率蛋白水解的苜蓿物种的应用而言，尤其如此(Jones等1995；Papadopoulos和McKersie 1983)。
目前1公斤的mAb的市值为＄1，000，000-＄10，000，000。在当预期产量为每年100g的250m2的温室条件下，估计产生的每克C5-1的生产成本(包括用于提取和纯化的加热、人力和消耗品在内)时，每克C5-1的成本将为＄500-＄600，而产生的市值为＄400，000。这类估计表明，在植物中可以成本有效地生产重组蛋白，然而，需要建立合适的植物系统。本发明一个实施方案的一个方面涉及确定合适转基因植物系所需的特性，所述转基因植物系可以用来生产符合CBER建议书中建立的关于生物制品化合物标准的目的转基因蛋白。
本发明也涉及生产用于血清学测定的蛋白的方法，包括用编码所述蛋白的目的基因转化苜蓿植株，并选择表达所述蛋白的转化苜蓿植株或选定苜蓿植株的子代，以及从转化植株提取所述蛋白。本发明一个实施方案的一个方面涉及用亲和层析纯化所述蛋白。
本发明也涉及用于红细胞血清学的单克隆抗体的生产方法，包括a)用包含编码单克隆抗体的基因的载体转化苜蓿，以产生转化体，b)根据所述转基因基因的存在选择转化体，c)培育所述转化体，以生产由所述转基因基因编码的单克隆抗体，d)收获所述转基因苜蓿植株的地上部分，e)从所述转基因苜蓿的所需组织提取所述单克隆抗体，f)让所述转基因苜蓿植株再生长，和g)重复步骤c)-f)，并且可任选地复制所述转基因植株。本发明也涉及该方法，其中可任选的繁殖所述转基因植物的步骤包括任何无性繁殖方法，包括茎繁殖或胚胎发生繁殖。本发明一个实施方案的再一方面涉及用亲和层析纯化所述单克隆抗体。
本发明也包括用该方法生产的单克隆抗体。
本发明也涉及在转化苜蓿中生产目的蛋白的方法，包括
a)用含编码目的蛋白的基因的载体转化合适的苜蓿基因型，以产生转化体，b)根据所述转基因基因的存在筛选合适的转化苜蓿基因型，c)培育所述转化的合适苜蓿基因型，以生产所述目的蛋白，d)收获所述合适的转基因苜蓿基因型的地上部分，e)从所述合适的转基因苜蓿基因型的所需组织提取所述目的蛋白，f)让所述合适的转基因苜蓿基因型再生长，和g)重复步骤c)-f)。
本发明也涉及能够表达多聚体生物活性蛋白的转基因苜蓿植株。
尽管本发明以单克隆抗体C5-1的制备作为实例，但实际上可以按照本发明的方案在转化苜蓿中制备任何目的产物。现有技术中尚未公开过的、采用合适的苜蓿基因型来表达转基因蛋白的优点，包括蛋白在以下部分中的稳定性1)收获的组织，得自所述植株并让其风干，且在提取之前贮存；2)在水中收获的提取物，所述提取物于室温下且在缺乏以下物质的情况下收获稳定剂、蛋白酶抑制剂、缓冲剂、盐、抗氧化剂、还原剂、稳定剂或通常加入提取混合物中以确保蛋白稳定性和活性的其它添加剂；3)在生长季节内和生长季节之间的同一植株过度重复收获物；和4)无性繁殖体。
此外，因为苜蓿是多年生植物，能够营养繁殖，所以在跨越许多生长季节的相当长的时间内可以获得并收获无性材料。这确保在转基因苜蓿内目的蛋白的稳定来源。在用于转基因蛋白生产的其它常用的植物内没有发现这类特征，所述常用的植物往往是一年生植物，包括烟草、拟南芥属、大豆和玉米。然而，不是所有的苜蓿变种均是多年生的，并且已知许多多年生且高产(从农艺上讲)的变种不适合于转化方案。因此，本发明也涉及用于生产转基因蛋白的合适的苜蓿系或基因型的选择方法，所述方法包括a)筛选苜蓿基因型或品系的文库，以确定多年生的基因型或品系；b)根据胚胎发生潜力筛选在(a)中鉴定的所选择的品系或基因型；c)根据转化能力筛选在(b)中鉴定的所选择的品系或基因型；d)根据转基因蛋白的稳定性筛选在(c)中鉴定的所选择的品系或基因型。
本发明也涉及合适的苜蓿基因型或得自所述合适的苜蓿基因型的繁殖体，用于生产在符合生物制品管理批准要求方面有用的转基因蛋白。所述合适的苜蓿基因型在特征在于为多年生的，表现出为胚胎发生潜力，可被转化，且不降解所述转基因蛋白，使得所述蛋白在体内在干燥的气生组织中以及在提取步骤期间是稳定的。此外，本发明包括所述合适的苜蓿基因型的繁殖体，包括无性衍生的繁殖体诸如茎，或胚胎衍生的繁殖体。
图2显示C5-1肽在单转基因苜蓿植株和双转基因苜蓿植株中的表达和装配。不用巯基乙醇，在Tris-HCl(50mM)、PMSF(2mM)和NaCl(150mM)的存在下提取蛋白。将蛋白经SDS PAGE分离，并电转移至硝酸纤维素膜上。通过用兔抗小鼠IgG，然后用偶联于过氧化物酶的抗兔IgG，在印迹上检测C5-1肽。用Boehringer Manheim BM化学发光试剂盒，经化学发光检测到过氧化物酶活性。L道得自表达κcDNA的亲代植株的蛋白提取物。H道得自表达γcDNA的亲代植株的蛋白提取物。F1道得自既表达κcDNA也表达γcDNA的F1子代的蛋白提取物。Hyb道由杂交瘤细胞分离的C5-1mAb。
图3显示植株C5-1的纯化。图3A，由膨胀床亲和层析(STREAMLINETM-r蛋白A基质)纯化的C5-1的洗脱分布图。每个流分含有1．5ml流出液，由这些流出液每道上样20μl，图3B，并在非还原条件下在SDS-PAGE上分离，并用考马斯蓝染色。
图4显示在苜蓿叶或烟草叶的情况下共同提取的C5-1蛋白的蛋白质印迹。在2μg转基因植物或杂交瘤培养物生产的C5-1的存在下，提取2克苜蓿叶或烟草叶组织。于0℃用10ml水进行提取，于20，000xg离心，并于25℃温育至多3小时，然后进行蛋白质测定，以测定提取溶液中残留的C5-1的量。
图5显示得自表达C5-1的双转基因苜蓿植株地上部分的蛋白的蛋白质印迹，将所述地上部分切割并让其于室温下干燥至多5天。将等量的收获组织于20％的相对湿度下保持0h、7h、1天、2天和5天，然后提取并确定蛋白分布图(图5A)，并用蛋白质分析测定C5-1的水平(图5B)。
图6显示在静脉内注射后的一个月时期内植物衍生的C5-1(·)和杂交瘤衍生的C5-1(O)在小鼠中稳定性。用抗固定化人IgG的ELISA进行检测。
按照本发明，“目的基因”是指能够编码蛋白的基因。然而，该定义也适用于其混合的转录和翻译产物导致产生多聚体蛋白的目的基因，所述多聚体蛋白用作生物制品，诸如血清学测定内的生物制品。可以采用既立的方案(例如Desgagnés等，1995)，用目的基因转化苜蓿。尽管苜蓿基因组的复杂性，但通过农杆菌介导的基因转移获得的性状是稳定的，并按照简单的孟德尔模式进行有性传递(Desgagnés等，1995)。这种特征对于生产的蛋白(包括多聚体蛋白在内)是必需的。尽管不希望限制可以用本发明以任何方式生产的蛋白的类型，但多聚体蛋白的一个实例可以是mAb，诸如C5-1。以下例举该蛋白的生产和特性。
“启动子”是指在所述启动子区控制下基因表达的起始和调节方面有活性的DNA序列区，正如本领域技术人员所通常理解的。该DNA序列通常在结构基因编码序列的上游(5’)，通过为RNA聚合酶和／或使转录于正确位点起始所需的其它因子提供识别，而控制所述编码区的表达。
一般有两种类型的启动子，即诱导型和组成型。“诱导型启动子”是能够直接或间接激活一种或多种DNA序列或基因对诱导物应答而转录的启动子。在缺乏诱导物时，所述DNA序列或基因将不被转录。通常，特异性地结合于诱导型启动子以激活转录的蛋白因子以无活性形式存在，然后被诱导物直接或间接地转化为活性形式。诱导物可以是化学因子，诸如蛋白、代谢物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物，或是由热、冷、盐或毒性成分直接施加的生理胁迫，或通过病原体或诸如病毒的致病因子的作用间接施加的生理胁迫。通过将诱导物诸如通过喷洒、浇水、加热或类似的方法外部应用于所述细胞或植物，可以将含有诱导型启动子的植物细胞暴露于所述诱导物。另外，诱导型启动子包括组织特异性启动子，它们以组织特异性方式起作用，以在所述植物的选定组织中调节目的基因。这类组织特异性启动子的实例包括种子、花或根特异性启动子，它们也是本领域众所周知的。
“组成型启动子”是指指导基因在植物的所有不同部分并且在整个植物发育中持续表达。已知的组成型启动子的实例包括与CaMV35S转录物和农杆菌Ti质粒胭脂碱合酶基因相关的启动子本发明的基因构成物包括3’非翻译区。3’非翻译区是指基因包含这样的DNA区段的部分，所述DNA区段含有多腺苷酸化信号和能够实现mRNA加工或基因表达的任何其它调节信号。所述多腺苷酸化信号的特征通常为实现将多腺苷酸积加至mRNA前体的3’端。根据存在与规范形式5’AATAAA-3’的同源性而识别多腺苷酸化信号，尽管变异是常见的。合适的3’区的非限制性实例是含有以下基因的多腺苷酸化信号的3’转录的非翻译区农杆菌肿瘤诱导(Ti)质粒基因诸如胭脂碱合酶(Nos基因)，和植物基因，诸如大豆贮藏蛋白基因和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基(ssRUBISCO)基因。
本发明的基因构成物也可以包括其它可任选的调节基元，诸如可能是需要的增强子或者为翻译增强子或者为转录增强子。这些增强子区对于本领域技术人员是熟知的，可以包括例如35S调节区的增强子区以及得自其它调节区的其它增强子和／或ATG起始密码子和相邻序列。起始密码子必须符合编码序列的读框，以确保翻译完整的序列。翻译控制信号和起始密码子可以得自多种起源，包括天然和合成的。翻译起始区可以由转录起始区源提供，或由结构基因提供。所述序列也可以得自选择以表达所述基因的增强子，且可以被特异性地修饰，以增加所述mRNA的翻译。
为有助于转化植物细胞的鉴别，还可以操作本发明的构成物，以包括植物选择标记。有用的选择标记包括但不限于提供对抗生素抗性的酶，所述抗生素诸如庆大霉素、潮霉素、卡那霉素等。同样，提供产生可根据颜色变化鉴别的混合物的酶诸如GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶)或提供产生可根据发光鉴别的化合物的酶诸如荧光素酶是有用的。
本发明也考虑了含有本发明嵌合基因构成物的转基因植物。本发明也涉及得自表达目的基因的转基因植株的部分，例如叶、茎、种子、花或根。这些选定的植物部分可以得自用包含或者组成型或者诱导型启动子的载体转化的植物。由植物细胞再生整个植株的方法是本领域已知的，获得转化和再生的植株的方法对于本发明不重要。一般而言，在合适的培养基中培养转化的植物细胞，所述培养基可以含有诸如抗生素的选择剂，在此选择标记用来便于转化植物细胞的鉴别。一旦形成愈伤组织，则可以通过利用合适的植物激素，按照已知方法，促进形成胚胎或苗，并且将苗转移至生根培养基以再生植株。然后，可以或者由种子或者采用营养繁殖技术用所述植株建立重复世代。
可以采用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等，将本发明的构成物引入植物细胞中。关于这类技术的综述，请参见例如Weissbach和Weissbach(1988)和Geierson和Corey(1988)。本发明还包括包含所述嵌合基因构成物和参与所述基因构成物表达的相关5’和3’调节区的合适的载体。
“合适的苜蓿系”或“合适的苜蓿基因型”是指多年生的、表现出胚胎发生潜力(例如每20个叶圆盘或其它外植体组织至少1个胚胎发生愈伤组织)、可转化并且其中根据所述文件讨论的稳定性标准(参见实施例3)转基因蛋白是稳定的苜蓿基因型或系。不是所有的苜蓿基因型或系都是多年生的，众所周知，许多苜蓿多年生基因型或系是不能进行胚胎发生的，并且不能转化，或者这些特性在转化后可能改变(Desgagnés，1995)。即使由于先前所述的优点，苜蓿植株看来作为宿主植株是有前途的，但已知苜蓿植株表现出高蛋白酶活性。事实上，在表征的饲料物种中，豆科饲料在青贮中表现出比禾本科物种更高程度和速率的蛋白水解，而苜蓿在豆科饲料中显示最大程度和最高速率的蛋白水解(Jones等1995)。而且，已经证明，在诸如烟草的其它植物物种中，转基因蛋白易于被内源蛋白水解活性降解(例如Hiatt等，1989)。当人们综合考虑这两种因素时，完全未预料到，可能分离出表现出确保转基因蛋白稳定性的特性的合适的苜蓿基因型。因此，重要的是确定合适的苜蓿基因型中任何蛋白水解活性是否针对所述植株中生产的目的转基因蛋白。为了确保可接受的蛋白水解活性，应该获得某些最低标准。这些最低标准将根据所述转基因蛋白的应用需要而变化。例如，如果需要大量的所述转基因蛋白，则所述蛋白应该在水性提取物中是稳定的，最好在缺乏任何加入的组分(诸如蛋白酶抑制剂)或通常加入提取溶液中的其它试剂的情况下是稳定的。也可能要求所述转基因蛋白在干燥过程中和干的收获的组织中是稳定的，便于大规模收获所述植物。
通过筛选苜蓿植物文库，以确定多年生的苜蓿植株，然后根据胚胎发生潜力筛选这些选定基因型或系，然后根据转化能力筛选选定的基因型或系，而获得合适的苜蓿基因型或系。然后，用目的蛋白转化这些植株，并测定所述蛋白在粗提取物中和在干燥的气生组织中的稳定性。然后，可任选地，验证转基因蛋白用作生物制品的实用性。为了举例说明本发明，表征一个胚胎发生苜蓿基因型11．9，然而，也可能已经使用了其它基因型。确立该基因型为多年生、胚胎发生、可转化的并且如下指出的，表现出可忽略的针对转基因蛋白的蛋白水解活性。然而，人们会理解，该基因型将被认为是可以采用上述标准选择的可能的苜蓿基因型或系的一个实例，并且该基因型不意味着在筛选方法应用或由于该筛选方案获得的植株方面是限制性的。
为了研究可以用于试剂中的目的蛋白的成本有效的制备方法，考虑了在合适的苜蓿基因型或系中生产转基因蛋白。因为已经证明mAbC5-1可用于红细胞血清学，所以由杂交瘤细胞cDNA文库克隆了C5-1重链和轻链，并且在转化苜蓿植株之前将其置于35S启动子控制之下(参见实施例1)。然而，人们会理解，该mAb以及35S启动子的应用可以分别作为可以使用并在合适的苜蓿基因型或系中生产的嵌合基因构成物和蛋白的一个实施例提供，并且该实施例决不是限制性的。
通过RNA印迹分析(

图1)和蛋白质印迹分析(图5)证实所述基因在转基因组织中表达，确定C5-1在合适的转基因苜蓿植株中的表达。通过提取组织的蛋白质印迹测定，所述转基因表达的mAb在于室温下或在大田条件下经数天干燥的气生组织中是稳定的(实施例3，图5)。当在苜蓿叶的情况下共同提取时，该mAb也是稳定的，而与烟草叶共同提取C5-1时，该mAb显著低(实施例3，图4)。当其它抗体与苜蓿共同提取并在一段时间内温育时，也观察到类似的结果(参见实施例3，表1和表2)。此外，当静脉内注射给小鼠时，由植物衍生的C5-1表现出与由杂交瘤衍生的C5-1相同的稳定性(图6)，表明由于植物衍生蛋白的糖基化如同杂交瘤衍生蛋白的糖基化，因此获得类似程度的保护。如果考虑采用苜蓿大规模生产和收获目的蛋白，则由于这类方法通常使收获的组织暴露于长期的风干和简单的水性提取方案，所以这些特性是重要。
已知某些苜蓿变种的营养结构表现出低水平的鞣质(Morris和Robbins 1997)。尽管不希望受理论的束缚，但这些苜蓿组织提取物中蛋白的稳定性提高可能是酚类化合物和鞣质水平降低的结果。已经发现这些特征限制了苜蓿作物饲料作物的应用，正在进行的第一步是提高该植物中酚类化合物的水平，以提高其作物饲料的效率(Morris和Robbins 1997)，然而，这些特性对于本发明公开的目的是有益的。
采用粗制澄清的提取物的亲和层析纯化植物C5-1，在用考马斯蓝染色时，表明最终的制备物无污染物(参见实施例2)。对于先前报道的方法(例如During等1990)这是一个显著的改进。在纯化过程期间也没有明显的C5-1损失，因此由植物中的C5-1至纯化的C5-1的得率估计超过70％。
当在ELISA和标准化血细胞凝集测定中测试时，纯化的植物衍生C5-1的免疫反应性与其得自杂交瘤细胞的对应物类似。虽然在粗提取物中存在几种装配类型，但所公开的纯化方法产生的H2L2形式用作杂交瘤衍生C5-1在血清学试验中的反应性应答方面不可区别。这表明，植物C5-1可以与杂交瘤衍生的C5-1一样有效地用作诊断蛋白。
为了批准基于mAb的蛋白，管理机构要求用于mAb生产的活材料必须是稳定的，以确保所述生物活性分子的质量和产量不随时间而变化(www．fda．gov／cber／cberftp／html；Miele，1997)。通过测定由F1子代两个基因型获得的再生体内C5-1的浓度，并比较这些浓度与亲代材料内的浓度(参见实施例3)，检查植物繁殖体之间C5-1的稳定性。这些结果表明，植物组织内C5-1的浓度在繁殖体之间保持恒定，并且这类转基因苜蓿系看来是稳定的C5-1mAb源。可以体外引入如11．9的具有高胚胎发生潜力的基因型，来以高比率产生无性繁殖体。可以使所述繁殖体进入休眠、干燥至15-20％含水量，用人工胚乳包被，并于-80℃贮藏(McKersie和Bowley，1993)。该克隆材料可以保持数年而不显著丧失萌发潜力，因此构成了回收(retrieve)与原始活材料相同的材料以起始新的生产循环的细胞库。也设想本领域技术人员已知的无性繁殖体的其它来源可以用来持续繁殖合适的苜蓿基因型。其它来源可以包括但不限于胚、茎或能够繁殖的其它营养结构。
此外，因为苜蓿是多年生植物且能够营养繁殖，所以可以获得无性材料，并在跨越许多生长季节的相当长的时间内直接从大田收获。这意味着一棵植株可以在10年或10年以上的时间内重复收获。同一原种材料的这种再生能力和可更新有效性，确保了在转基因苜蓿中目的蛋白的一致来源。在通常用于转基因蛋白生产的其它植物中，诸如在烟草、拟南芥、大豆、玉米或许多苜蓿基因型或系中，没有发现这类能力和特征。
作为植物体(plantibody)策略商业应用，在转基因苜蓿中大规模生产C5-1mAb是非常有前途的，因为与包括其它植物在内的许多异源系统相比，它代表一个经济的选择。而且，应用合适的苜蓿基因型提供最大限度降低根据生物制品的批准和临床试验所需的特征鉴定和维持细胞库的成本的能力。
在大田规模方面，成熟苜蓿植物地段有1-3×106单株／公顷；这确立了无性繁殖体的生产成本为约＄8，000。根据我们对繁殖的转基因苜蓿中抗体含量的估计(0．13-1．0％总可溶性蛋白)，每年一公顷的产量将为500-1000g。苜蓿是多年生作物，这种植物的田间生产性能可以维持3-4年。这将使得在开放耕地利用(open-field exploitation)方面所述原料的生产成本为＄3，000／kg mAb。用常规杂交瘤细胞培养物(约50mg C5-1mAb／L)生产1kg C5-1mAb的生产成本估计为约2×106美元。即使将杂交瘤培养物的抗体产量提高20-40倍，降低的成本(约750，000＄／kg)仍显著高于植物衍生的C5-1。
关于从转基因植物大规模纯化mAb尚未有报道。先前的关于纯化植物衍生mAb的报道表明，纯化为均质在亲和层析前后需要复杂的操作(During等1990)。利用膨胀床吸附层析，有助于按比率扩大本发明的纯化方法。该技术在缩短的时间范围内，由大体积的粗略澄清的提取物产生纯化的肽，因此看起来开创了降低从胶体提取物的纯化成本的新方法。
此外，用得自杂交瘤细胞培养物的未纯化上清液制备Coombs试剂，因此，如果观察到部分纯化的植物制备物于4℃的较长的稳定性，则它们可能适用于这种诊断。
采用在缺乏上述缓冲液(参见表1)的情况下与苜蓿共同提取的单克隆抗体(25F5，人mAb)和多克隆(hISG，人免疫球蛋白)抗体，进一步研究蛋白在苜蓿提取物中的稳定性。结果表明，在4天温育后，在于室温下贮藏的苜蓿提取物中有显著量的免疫学可检测到的蛋白。
表1与苜蓿提取物共同收获的和在苜蓿提取物中温育的蛋白的稳定性
2)在从转基因苜蓿植株提取期间重组蛋白的稳定性通过将双转基因植物叶在纯水中匀浆，也证明了粗提取物中转基因C5-1的稳定性。这类叶提取物具有小但显著的缓冲能力，这是在含100g新鲜叶的提取物中以约0．4pH单位(pH6．5-8．5)／摩尔NaOH确立的。结果表明，这些提取物可以于室温保持，而至少2小时pH不显著改变。作为转基因C5-1的提取剂，单独的水与含蛋白酶抑制剂的缓冲液(缓冲液A)一样好，在该基本提取系统中，C5-1于室温下保持100％稳定至少2小时(表2)。
表2-植物C5-1在粗蛋白提取物中的稳定性
*通过鼠IgG特异性ELISA测定3)蛋白在收获的植物组织中的稳定性为了确定将苜蓿地上部分干燥对C5-1水平和／或从转基因气生组织提取C5-1的能力是否有影响，收获了一株双转基因植株，让其于25℃、20％的相对湿度下干燥至多30天。在该干燥时期结束时，叶材料的含水量低于20％，这是在大田条件下观察到的水平。在该干燥期间收获等量的叶材料，对其提取并用蛋白质分析测定C5-1水平。正如在显示前5天数据的图5中观察到的，对于来自正在干燥或已经干燥的苜蓿叶的可提取转基因蛋白的量，没有观察到降低。当收获植株并在大田条件下保持时，在干燥30天后观察到相同的结果。4)C5-1在给予小鼠后的稳定性给小鼠静脉内给予等量的苜蓿衍生C5-1或杂交瘤衍生的C5-1，检测在28天的时期内获得的血浆样品中的蛋白的存在。该试验的结果示于图6。给予的C5-1蛋白在小鼠中的半衰期对于杂交瘤衍生蛋白或植物衍生蛋白是相同的。这提示，植物衍生C5-1通过糖基化受到保护，其程度与杂交瘤衍生蛋白相似。在5天时间内注射的蛋白损失50％后，剩余的蛋白在接下来的20天时期内再下降25％。评价时期结束时，在小鼠内可检测到原始供应的蛋白的25％。5)苜蓿繁殖体中蛋白的稳定性为了确立转基因表达在转基因苜蓿繁殖体内的稳定性，检查15株得自F1子代的两种基因型的叶组织中的C5-1浓度。通过在节间茎节(stem section)上诱导生根，制备繁殖体。分析来自这两种基因型的15株再生植株的C5-1含量，将其与亲代材料中的C5-1水平比较。表3所示数据显示这一试验的结果，并表明C5-1水平在亲代材料和繁殖的材料中观察到的水平之间保持不变。表3-可提取的C5-1在世代之间的稳定性基因型2 基因型3原材料*原材料*14．4μg／g叶 14．4g／g叶121．2μg／g 1613．4μg／g217．9μg／g 1718．2μg／g316．9μg／g 1819．7μg／g418．5μg／g 1915．1μg／g517．8μg／g 2014．5μg／g615．0μg／g 2115．6μg／g716．1μg／g 2214．6μg／g814．4μg／g 2312．4μg／g921．8μg／g 2415．6μg／g1014．2μg／g2517．5μg／g1118．4μg／g2617．4μg／g1218．2μg／g2718．0μg／g1317．3μg／g2816．8μg／g1415．1μg／g2917．2μg／g1512．7μg／g3014．6μg／g17．0±2．53μg／g 16．0±1．99μg／g*在先前的试验中已经测定了原始值为14．4实施例4抗原结合活性和血细胞凝集素活性用ELISA试验进一步测试植物衍生C5-1 mAb的抗原结合能力。来自生产C5-1的植株的叶提取物的连续稀释液用于该试验。表4A显示了用1／10稀释样品获得的光密度值。结果表明，植物C5-1mAb被抗小鼠IgG抗体识别，提示植物产生的抗体的总体构象为IgG的构象。此外，植物C5-1特异性地识别人IgG，表明H链和L链正确折叠形式抗原结合位点。初步试验表明，C5-1植物提取物可以特异性地使以人IgG致敏的红细胞凝集。对亲和纯化的物质的更完全的表征与杂交瘤衍生C5-1mAb平行进行。结果(表4B)表明，植物衍生C5-1mAb特异性地使抗D-致敏人RBC凝集，于6μg／ml下产生完全的(4+)反应，这与用杂交瘤衍生的C5-1mAb观察到的结果相似。
用抗鼠IgG作为包被抗体的ELISA测定也用来测定亲代转基因植株的反应性。表5A表明，在L-单转基因植株中没有检测到信号，而在含有H链的植株中检测到信号。这些结果用来确定粗提取物中免疫反应性物质的量。然后，在用人IgG包被的孔中测试已知量的粗提取物的反应性(表5B)。这第二个试验表明，单独的重链不与人IgG反应。它也表明，植物H2L2的比活与来自杂交瘤细胞的C5-1的比活相似。通过测定平衡下的解离常数，比较植物衍生抗体对其抗原的真正的亲和力与杂交瘤衍生抗体的亲和力。植物衍生C5-1和杂交瘤衍生C5-1的KD分别为4．7×10-10M和4．6×10-10M。表4-植物衍生C5-1mAb的反应性。(A)ELISA测定；(B)血细胞凝集A) 490nm下的光密度固定化抗体测试的材料 山羊抗小鼠 人IgG对照植株的 0．000±0．000 0．000±0．000提取物(1／10)转基因植株的 0．243±0．007 0．531±O．014提取物(1／10)C5-1杂交瘤 O．414±0．034 0．643±0．035上清液(1／10)B)血细胞凝集素强度样品 未包被的 抗-D-包被的RBC RBC- -无对照抗人IgG-++++试剂杂交瘤C5-1(6μg／ml) -++++植株C5-1(6μg／ml) -++++表5-亲代和F1转基因植株的免疫反应性(A)和比活(OD／100ng)(B)A)光密度 μg／ml提取物来自杂交瘤细胞的IgG 0．376±0．008 0．28*L(1／1) 0．000 --H(1／4) 0．560±0．049 0．10±0．01**HL(F1，1／6)0．328±0．027 0．25±0．02B)光密度 比活提取物来自杂交瘤细胞的IgG0．332±0．032 0．235±0．020L(1／1) 0．000 --H(1／4) 0．000 --HL(F1，1／6)0．334±0．011 0．267±0．080-* 来自纯化的流分，0．28μg／ml**根据H2L2结构计算的选择膨胀床吸附(STREAMLINETMr Protein A)，使得可以将部分澄清的含胶体物质的植物提取物以高流速上样。采用该技术，由非澄清的植物粗提取物纯化植物C5-1，通过在SDS-PAGE凝胶上的考马斯蓝染色，显示纯化的植物C5-1作为单一肽(图3B)。
所有科学出版物和专利文件均通过引用结合到本文中。
已经通过优选实施方案描述了本发明。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，在不偏离以下权利要求所述的本发明范围的情况下，可以进行多种变化和修改。
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权利要求
1．用于血清学测定的蛋白的生产方法，包括用编码所述蛋白的目的基因转化苜蓿植株，选择表达所述蛋白的转化的苜蓿植株，并且从所述转化的苜蓿植株中提取所述蛋白。
2．权利要求1的方法，其中所述蛋白得自所述选定的转化苜蓿植株的繁殖体。
3．权利要求2的方法，其中所述繁殖体包括茎衍生的繁殖体。
4．权利要求2的方法，其中所述繁殖体包括胚衍生的繁殖体。
5．权利要求1的方法，其中所述蛋白为单克隆抗体。
6．权利要求1的方法，其中在使用之前纯化所述蛋白。
7．权利要求6的方法，其中所述蛋白用亲和层析纯化。
8．权利要求1的方法，其中所述植株为苜蓿再生性基因型11．9。
9．用权利要求5的方法生产的单克隆抗体。
10．在转化的苜蓿中生产目的蛋白的方法，包括a)用含编码目的蛋白的基因的载体转化苜蓿，以产生转化体，b)根据所述转基因基因的存在筛选转化的苜蓿，c)培育所述转化的苜蓿，以生产所述目的蛋白，d)收获所述转基因苜蓿植株的地上部分，e)从所述转基因苜蓿的所需组织提取所述目的蛋白，f)让所述转基因苜蓿植株再生长，和g)重复步骤c)-f)。其中在水的存在下，从所述转化的苜蓿植株中提取所述目的蛋白。
11．权利要求10的方法，其中所述目的蛋白为单克隆抗体。
12．权利要求10的方法，其中步骤b)-g)用所述转基因植株的繁殖体进行。
13．权利要求12的方法，其中所述繁殖体包括茎衍生的繁殖体。
14．权利要求12的方法，其中所述繁殖体包括胚衍生的繁殖体。
15．权利要求11的方法，其中所述提取所述目的蛋白的步骤包括纯化。
16．用权利要求11的方法生产的单克隆抗体。
17．用于生产转基因蛋白的合适的苜蓿基因型的选择方法，包括a)筛选苜蓿基因型文库，以确定多年生的基因型或品系；b)根据胚胎发生潜力筛选在(a)中鉴定的所选择的基因型或品系；c)根据转化能力筛选在(b)中鉴定的所选择的基因型或品系；d)根据转基因蛋白的稳定性筛选在(c)中鉴定的所选择的基因型或品系。
18．权利要求17的方法，其中步骤(d)包括测定所述转基因蛋白在所述植物地上部分中的稳定性。
19．权利要求18的方法，其中步骤(d)包括测定在合适苜蓿基因型的粗提取物中的稳定性。
20．权利要求19的方法，其中所述转基因蛋白在干燥的气生组织中是稳定的。
21．权利要求19的方法，其中所述转基因蛋白在所述合适的苜蓿植株的水性提取物中是稳定的。
22．适用于生产能符合管理批准要求的转基因蛋白的苜蓿基因型，所述苜蓿基因型的特征在于它为多年生的，表现出为胚胎发生潜力，可被转化，且在所述苜蓿基因型中生产的转基因蛋白在体内、在干燥的气生组织中以及在提取步骤期间是稳定的。
23．如权利要求16中定义的苜蓿基因型的无性繁殖体。
24．权利要求23的无性繁殖体，其中所述繁殖体是茎衍生的繁殖体。
25．权利要求23的无性繁殖体，其中所述繁殖体是胚衍生的繁殖体。
26．得自权利要求23中定义的无性繁殖体的人工种子。
27．在权利要求22中定义的苜蓿基因型的干燥的气生组织。
全文摘要
本发明涉及特征鉴定适用于生产功能性转基因蛋白的宿主系统;所述功能性转基因蛋白用于需要政府管理批准的应用,诸如抗人IgG。众所周知;管理机构要求用于生产转基因蛋白的主细胞库和主细胞系是稳定和持久的,以确保足够的材料用于合适的特征鉴定、临床试验和潜在的销售。目前的植物生产系统需要建立用于此目的的种子库。然而;有许多缺点与用于生产持续可靠的转基因蛋白源的这种系统相关。本发明的一方面涉及特征鉴定适用于符合严格管理要求的转基因蛋白的植物生产系统。本发明的另一方面例举了通过在转基因苜蓿植株中表达相应的基因,生产和特征鉴定用作血清试剂的抗人IgG。将人IgG特异性IgG2a(κ)鼠mAb(C5—1)的重链和轻链的cDNA通过农杆菌感染转移入苜蓿中。获得了表达编码轻链和重链的mRNA的转基因植株,发现来自F1子代(通过有性杂交获得的)的植株表达完全装配的C5—1。此外,所述转基因蛋白在体内以及在提取和纯化步骤期间是稳定的。纯化产生独特的H2L2形式,在标准化血清学试验中其反应性不可与杂交瘤衍生C5—1的反应性区分。结果表明,植物衍生的转基因蛋白诸如mAb可以与杂交瘤衍生的mAb一样有效地用作诊断试剂,并且证明转化的苜蓿系统生产大量蛋白(包括诸如mAb的多体蛋白)的有用性。
文档编号C07K14/705GK1290302SQ98812925
公开日2001年4月4日 申请日期1998年11月10日 优先权日1997年11月10日
发明者L·P·维兹纳, S·拉伯格, R·巴津, H·克豪迪, R·莱米乌克斯, G·阿拉德 申请人:加拿大农业及农业食品部, 赫马-魁北克公司, 加拿大血液服务公司, 拉瓦尔大学