发根农杆菌a4菌株诱导人参根外植体产生人参发根及人参皂甙的生产方法

文档序号:3551035阅读:492来源:国知局
专利名称:发根农杆菌a4菌株诱导人参根外植体产生人参发根及人参皂甙的生产方法
技术领域
本发明涉及一种利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导的遗传转化技术,将A4菌株所含的Ri质粒转入人参根外植体中,产生可在无激素培养基上快速离体生长的人参发根,并通过发根的大规模培养生产天然人参皂甙的新方法。
由于人参是多年生植物(六年收获),且对栽培条件要求十分严格,人参栽培投入高,效益低。我国主要采用伐林栽参生产方式,每年毁林2000多公顷,对森林资源造成极大的破环(于得荣、赵寿经、土壤学报1991,27(2)),目前可用于栽参的森林已所剩无几。人参生产面临着新的挑战。
人参皂甙是人参的主要有效成分,对人类多种疾病具有显著疗效(王本祥,人参研究进展,天津科学技术出版社,1991)。目前药用人参皂甙主要从栽培人参的根、茎、叶中提取,生产成本高,资源浪费严重。国外有关报导有Yoshikawa(Plant Cell Report 1987(6))和Inomata(Plant Cell Report 1993(2)),其中,Yoshikawa提供的方法是利用发根农杆菌A4菌株转化人参愈伤组织,但在方法中采用纤维素酶、果胶酶酶解愈伤组织后与农杆菌A4共培养,该方法较麻烦。另外,Inomata采用的是以TACC15834菌株转化人参根获得离体条件下快速生长的人参根。虽然是直接接菌培养,但需经愈伤组织形成发根,其4周培养发根生长速率为24.5。
本发明的目的是提供一种利用发根农杆菌A4菌株,在人参根外植体上用直接接菌方法诱导出人参发根,选取人参发根无性系,大量培养和繁殖发根,并从发根中提取人参皂甙的方法,该方法简单、实用、生长速率高。
为实现上述目的,本发明采取以下设计方案一种发根农杆菌A4菌株诱导人参根外植体产生人参发根及人参皂甙的生产方法,它包括以下几个步骤取人参根外植体,将培养过夜的微量发根农杆菌A4菌液直接加到根的切面上,黑暗培养,切下浸染部位长出发根,杀菌;将诱导出的除菌发根系在不含激素的Ms液体培养基中培养,大量繁殖发根系,经多次继代建立离体发根无性系;大量培养人参发根从人参发根提取人参皂甙。
一、人参发根的诱导取生长健壮的人参根,切成0.2-0.3mm厚的薄片,接入不含激素的MS(Murashige T,Skoog S(1962)Physiol plant)固体培养基上。用注射针将培养过夜的微量A4菌液直接加到根的切面上,25℃下黑暗培养。培养约6周后,在部份浸染部位长出白色小发根。将长至1cm左右的发根切下,转至含有500mg/L羧苄青霉素的MS培养基上杀菌。每隔5-7d转移一次,直至无细菌为止。
二、将诱导出的16个无菌发根系分别培养并测定其生产速率将诱导出的16个除菌发根系分别培养在不含激素的MS固体培养基及MS液体培养基上,每4周继代一次,继代时仅切取1-2cm的根尖,接种量约0.2g鲜重,测定生长量,计算生长速率(培养后发根鲜重/培养前发根鲜重)。
经对16个发根系生长速率的比较,R98185、R98111发根系在液体培养基上(连续28天)的生长速率均高于前人报道的24.5。见表1主要发根系的生长速率。
表1人参主要发根系的生长速率
三、发根系的培养条件选择将R98111等发根系在不同的液体培养基中培养,液体培养基分别MS、2/MS和N/5 MS(KNO3、NH4NO3浓度为MS的1/5)。分别为25℃下不同转速的摇床(80r/min,110r/min,140r/min)上培养。实验结果是在1/2MS液体培养基,110r/min的摇床上获得最大生长量,28天生长速率达31.2,最短加倍时间仅5-6天。
在1/2Ms液体培养基、摇床转速110r/min培养条件下大量繁殖R98111发根系,经多次继代建立起R98111离体发根无性系。
四、发根中农杆碱的纸电泳鉴定检测诱导的人参发根及R98111发根无性系中冠瘿碱(农杆碱及甘露碱)来证明发根农杆菌A4菌株的Ri质粒T-DNA是否转化成功。因为被测样品中冠瘿碱的检出表示着细胞内冠瘿碱合成酶生成,而栽培人参根中则没有冠瘿碱。测定方法采用高压纸电泳方法(王关林等,植物基因工程原理与技术,1998)。
纸电泳结果见附

图1。
附图1经Ri质粒转化的人参发根及栽培人参根中冠瘿碱(农杆碱及甘露碱)的纸电泳鉴定图谱附图1中,A为农杆碱,M为甘露碱,1为标准品,2人参发根,3R98111发根无性系,4栽培人参五、发根中人参皂甙提取方法1、人参发根经风干或冷冻干燥后,粉碎成粉,过筛(40目);2、以10-15倍(重量比)甲醇冷浸后,80℃回流提取10-48小时,得甲醇提取物,减压回收甲醇;3、甲醇提取物以10-15倍量(重量比)的乙醚40℃下提取24-36小时,离心弃乙醚提取物(除脂);4、沉淀溶于2-3倍(体积比)的水中,以1-2倍正丁醇萃取6-7次,减压回收溶剂,得正丁醇提取物;5、萃取物用乙醚、丙酮精制得总皂甙,即先溶于乙醚中,过滤,溶液加入到200-250毫升丙酮中,沉淀过滤,得沉淀物为总皂甙,其中丙酮母液中所剩皂甙可二次回收。
以下结合实施例对本发明作进一步说明实例例1在容积为2.5L的生物反应器中(培养液为2.5L无激素的1/2MS液体培养基),转入已培养4周的R98111人参发根无性系(约40克鲜重),在25℃、空气流量0.5L/min,振荡速率110r/min的培养条件下培养。四周后,人参发根的生物产量达38.2g.d.w/L,生长速率20.5。将自然风干的人参发根用甲醇回流提取,水饱和正丁醇萃取方法制得人参总皂甙1.59g/L(人参总皂甙含量4.18g/100g发根干重)。
本发明优点本方法简便、实用、生长速率高,是一种大规模生产人参皂甙的新方法。
权利要求
1.一种发根农杆菌A4菌株诱导人参根外植体产生人参发根及人参皂甙的生产方法,其特征在于它包括以下几个步骤取人参根外植体,将培养过夜的微量发根农杆菌A4菌液直接加到根的切面上,黑暗培养,切下浸染部位长出发根,杀菌;将诱导出的除菌发根系在不含激素的Ms液体培养基中培养,大量繁殖发根系,经多次继代建立离体发根无性系;大量培养人参发根;从人参发根提取人参皂甙。
2.根据权利要求1所述的发根农杆菌A4菌株诱导人参根外植体产生人参发根及人参皂甙的生产方法,其特征在于所述的人参根外植体为0.2~0.3mm厚的薄片,它接入不含激素的MS固体培养基;所述的植体切面上的部分浸染部位长出的小发根长至约1cm左右后切下,转至含有500mg/L羧苄青霉素的MS培养基上杀菌,每隔5~7d转移一次,直至无细菌为止。
3.根据权利要求1所述的发根农杆菌A4菌株诱导人参根外植体产生人参发根及人参皂甙的生产方法,其特征在于所述的诱导出的除菌发根系为每4周继代一次,继代时切取1~2cm的根尖,接种量约0.2g鲜重。
4.根据权利要求1或2或3所述的发根农杆菌A4菌株诱导人参根外植体产生人参发根及人参皂甙的生产方法,其特征在于发根系的培养条件为1/2MS液体培养基,摇床的转速为110r/min。
5.根据权利要求1所述的发根农杆菌A4菌株诱导人参根外植体产生人参发根及人参皂甙的生产方法,其特征在于从发根中提取人参皂甙的方法包括人参发根经风干或冷冻干燥后,粉碎成粉,过筛;以10~15倍量甲醇冷浸后,80℃回流提取10~48小时,得甲醇提取物,减压回收甲醇;以10~15倍量乙醚40℃下提取24~36小时,弃乙醚提取物;沉淀溶于2-3倍的水中,以1~2倍正丁醇萃取6~7次,减压回收溶剂,得正丁醇提取物。
6.根据权利要求5所述的发根农杆菌A4菌株诱导人参根外植体产生人参发根及人参皂甙的生产方法,其特征在于正丁醇提取物用乙醚、丙酮溶液精制,得人参皂甙。
全文摘要
本发明公开了一种发根农杆菌A
文档编号C07J63/00GK1285138SQ9911166
公开日2001年2月28日 申请日期1999年8月23日 优先权日1999年8月23日
发明者赵寿经, 杨振堂, 李昌禹, 臧埔, 赵家平 申请人:赵寿经
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