使用缨桃分离物提供抗氧化的、植物性或营养性益处的方法

文档序号:3551753阅读:410来源:国知局
专利名称:使用缨桃分离物提供抗氧化的、植物性或营养性益处的方法
技术领域
本发明提供一种方法,该方法使用具有营养性(nutraceutical)或植物性(phytoceutical)的樱桃分离物以便提供益处。
本发明也涉及一种方法,该方法根据需要用一种来自樱桃的组合物抑制活的生物学材料的氧化。详细地说,本发明涉及作为食物增补剂或食品添加剂的一种化合物或一种组合物。最好是一种含有花色素苷、生物类黄酮及酚类的混合物的组合物。
许多来源于植物的化合物,作为它们通过维持低水平的活性氧中间体而作为细胞的抗氧化剂、通过抑制前列腺素的合成而作为抗炎剂或作为与细胞增殖有关的酶的抑制剂的能力,也可以赋予食物重要的、好的、药理学或“营养性”特性。这些活性在改善慢性疾病中可能是重要的,所述疾病包括癌症、关节炎和心血管疾病(Kinsella等,Food Tech.85-89(1993))。因此,就天然产品而言,食物增补剂/食品行业和营养品公司有机会使用这些化合物,所述化合物不仅能够象合成的抗氧化剂一样有效地提高食品的稳定性而且也能够给消费者提供明显的健康益处。
通常认为樱桃具有有益于健康的性质。优选的樱桃是欧洲酸樱桃(Prunus Cerasus L.)(蔷薇科)MONTMORENCY栽培品种,MONTMORENCY在美国是商业种植的主要的酸樱桃。为了挑战MONTMORENCY单种栽培,在1984年将一种新的栽培品种BALATON酸樱桃(Ujferbertoi furtos)引进美国,并在密歇根洲、犹他洲和威斯康显洲试验。BALATON产生的果实较MONTMORENCY产生的果实颜色深。
最近的结果显示,花色素苷如矢车菊色素-3-葡萄糖苷具有强的抗氧化活性(Tsuda,T.等,J.Agric.Food Chem.422407-2410(1994))。加入抗氧化剂是增加食物产品的贮存期限的常用方法之一,认为产品的贮存期限与脂质的过氧化有关。天然的抗氧化剂在防止癌发生中可以起到一个重要的作用。食物抗氧化剂可以有效地对抗有生命体系中的过氧化损害(Halliwell,B.和J.M.C.Gutteridge,“生物学和医学中的自由基”。Oxford University Press,New York 416-494(1989);Osawa,T.等,“食物抗氧化剂在防御氧化损害中的作用。关于抗引起突变和抗癌发生的机理”;Kuroda,Y.;Shankel,D.M.,Waters,M.D.编著;Plenum Publishing.New York139-153(1990))。
早期的研究已经表明MONTMORENCY樱桃含有花色素苷矢车菊色素-3-龙胆二糖苷和矢车菊色素-3-芸香糖苷(Li,K.C.等,J.Am.Chem.Soc.78979-980(1956))。在七种酸樱桃品种中有六种也发现了矢车菊色素-3-葡萄糖基芸香糖苷(Harborne,J.B.等,Phytochemistry 3453-463(1964))。Dekazos(Dekazos,E.D.,J.Food Sci.35237-241(1970))报道在MONTMORENCY樱桃中的花色素苷色素为与矢车菊色素-3-槐糖苷、矢车菊色素-3-芸香糖苷及矢车菊色素-3-葡萄糖苷一起的芍药花青素-3-芸香糖苷、芍药花青素和矢车菊色素。可是,鉴定矢车菊色素-3-葡萄糖基芸香糖苷以及矢车菊色素-3-葡萄糖苷、矢车菊色素-3-槐糖苷及矢车菊色素-3-芸香糖苷为酸樱桃中的主要的色素。用HPLC保留值,Chandra等(Chandra,A等,J.Agric.Food Chem.40967-969(1992))报道在密歇根洲种植的MONTMORENCY樱桃中矢车菊色素-3-槐糖苷及矢车菊色素-3-葡萄糖苷分别是主要的和次要的花色素苷。类似地检测到在MONTMORENCY樱桃中矢车菊色素-3-木糖基芸香糖苷为次要的色素(Shrikhande,A.J.和F.J.Francis,J.Food Sci.38649-651(1973))。
在先有技术中,首先通过吸附所述色素在一根AMBERLITEXAD-2(Sigma Chemicals)柱上实现从BALATON和MONTMORENCY樱桃汁生产纯的花色素苷(

图1化合物1-3)(Chardra,A.等,J.Agric.Food Chem.411062-1065(1993))。用水洗脱该柱直到洗脱液的pH接近7.0。用MeOH洗脱与其它酚类一起吸附的色素。分别用C-18MPLC和HPLC分离和纯化产生的粗花色素苷,以便提供光谱研究用的纯的花色素苷。纯化500mg来自AMBERLITE XAD-2的粗MONTMORENCY花色素苷产生60mg纯花色素苷1-3,相比之下,来自BALATON为391.43mg。该研究指出源于MONTMORENCY、由XAD-2获得的粗花色素苷含有高百分比的其它有机化合物。AMBERLITE XAD-2不允许再生树脂。从未因任何目的尝试使用类黄酮、异黄酮类、酚类和花色素苷的粗混合物。美国专利号5,266,685(Garbutt)、5,665,783(Katzakian等)及5,817,354(Mozaffar)描述了各种吸附树脂及它们在分离无关产物时的用途。这些专利仅仅是使用吸附树脂中现有技术一般水平的例证。
美国专利号5,503,867(Pleva)描述了碎肉中全磨碎的樱桃和燕麦糠的用途。所使用的樱桃的量为10到15%(重量)并且相信加入燕麦糠是为了抵偿樱桃中的果汁。无论如何,樱桃肯定使肉具有风味,然而该产品的可口性不能普遍被接受。这个专利并没有描述营养性或植物性益处。最近关于含有樱桃组织的低脂牛肉末的稳定性研究提示该植物源含有有效的抗氧化剂,其不仅抑制脂质的过氧化而且也抑制在油炸食物期间杂环芳香胺及胆甾醇氧化产物的形成(Gomaa等,IFT Abstracts No.68E-7(1996))。为了解释这些观察的结果,而采用的假设是经常在高等植物如樱桃的液泡中发现的多酚如类黄酮、花色素苷和花色素产生所述的抗氧化作用。
需要尤其用作食物增补剂/营养或食品添加剂的源于天然樱桃的组合物。
发明概述本发明涉及一种方法,该方法提供给活的哺乳动物营养性或植物性益处,包括抗氧化的益处,该方法包括
喂给哺乳动物一种由樱桃分离的组合物,该组合物选自花色素苷、生物类黄酮、酚类及其混合物,所喂给的量能给哺乳动物提供营养或植物性能。
本发明涉及一种抑制需要此处理的活的生物材料中氧化的方法,该方法包括提供一种选自由樱桃分离的花色素苷、生物类黄酮、酚类及其混合物的组合物给活的生物材料,所提供的量能够在活的生物材料中抑制氧化。
术语“活的生物材料”意指在培养基中的活的组织,在动物或人的体外或体内的活的组织。
术语“花色素苷”意指在樱桃中赋予颜色的化合物。从本申请的目的出发,该定义也包括苷元矢车菊色素。
术语“生物类黄酮”意指樱桃中含有的异黄酮和类黄酮化合物。
术语“酚类”涉及具有苯基并具有一个或多个羟基的来自樱桃的化合物。
术语“营养性”意指对活的哺乳动物有好处,以维生素的方式影响哺乳动物长期的健康。
术语“植物性(产品)”意指一种源于植物的产物,该产物可提供营养性。目的因此,本发明的一个目的是提供一种可用于食品或作为象防止活组织中氧化的抗氧化剂一样的食物增补剂或营养剂的天然来源的樱桃组合物。通过参考以下说明和附图该目的及其它目的将变得显而易见。
附图简述图1显示从BALATON和MONTMORENCY樱桃中分离的、精选的花色素苷(着色剂)的结构。苷元矢车菊色素在3位有一个羟基。
图2和图3为显示从樱桃中分离的主要生物类黄酮的图。
图4显示从酸樱桃中分离的、精选的酚类。
图5显示从樱桃中分离花色素苷、生物类黄酮和酚类方法的步骤。
图6为示意图,显示在图5所示的方法中可能使用的设备。
图7为曲线图,显示花色素苷和商业上的抗氧化剂在脂质体模式体系中的抗氧化功效。通过加入亚铁离子引发氧化反应。在试验化合物存在下,荧光的衰变速率减慢。对照品不含有加入的Fe2+和含有Fe2+不含有加入的试验化合物。其它样品含有Fe2+和2μM的试验化合物。
图8为曲线图,显示分离的化合物1-4、7和8与商业上的抗氧化剂TBHQ及BHT在10μM浓度时的抗氧化活性。数据为双份实验的平均值。化合物1为柚苷元(R1-OH,R4-OH和R6-OH;R2、R3、R5和R7-H)。化合物2为染料木黄酮(图3)。化合物3为绿原酸。化合物4为五羟黄酮3-鼠李糖苷(图2)。化合物7为染料木黄酮7-葡萄糖苷(图3)。化合物8为6,7-二甲氧基-5,8,4’-三羟基黄酮(图2)。
图9为曲线图,显示分离的化合物1、3和4(图4)与一些商业上的抗氧化剂在20μM浓度下的抗氧化活性。化合物2的抗氧化活性是在100μM下测量的。通过作为时间函数的荧光强度的减少监测过氧化速率。相对强度为在所给出的时间的荧光强度以测定开始时的初始荧光强度除。数值为双份测量的平均值。
优选实施方案的描述一种优选的生产作为一种组合物的包含源于樱桃的花色素苷、生物类黄酮和酚类的混合物的方法,该方法包括提供一种含有源于樱桃的花色素苷、生物类黄酮和酚类的水溶液;从该水溶液中将花色素苷、生物类黄酮和酚类转移到树脂表面;用洗脱剂洗脱树脂表面以便从树脂表面移去花色素苷、生物类黄酮和酚类;并且分离洗脱剂和花色素苷、生物类黄酮和酚类。
详细地说,一种优选的生产作为一种组合物的源于樱桃的花色素苷、生物类黄酮和酚类的方法提供第一批樱桃,其中的樱桃为新鲜的或快速冷冻并解冻;破坏樱桃并使果肉与果汁分离;从果肉中将花色素苷、生物类黄酮和酚类提取进入水溶液;从含有从果肉分离的花色素苷、生物类黄酮和酚类的水溶液中将花色素苷、生物类黄酮和酚类转移到吸附树脂颗粒上;用低级链烷醇洗涤该树脂颗粒以便从树脂颗粒上移去花色素苷、生物类黄酮和酚类;分离低级链烷醇与花色素苷、生物类黄酮和酚类;第二批樱桃用分离后的链烷醇和移去了花色素苷、生物类黄酮和酚类的树脂颗粒重复以上步骤。
另外,用于该方法的优选可供消费的组合物以混合物的形式包含干燥的由樱桃分离的花色素苷、生物类黄酮和酚类的混合物;和食品级的载体,其中所述混合物与载体的重量比在大约0.1比100和100比0.1之间。
最后,提供一种优选的抑制哺乳动物中的氧化的方法,该方法包括喂给哺乳动物一种可供消费的组合物,所述组合物以混合物的形式包含干燥的由樱桃分离的花色素苷、生物类黄酮和酚类的混合物;和食品级的载体,其中所述混合物与载体的重量比在大约0.1比100和100比0.1之间。最好该组合物含有至少一部分干燥的樱桃果肉。
用于本发明的樱桃可以是甜的或酸的。酸樱桃除了含有其它的有机酸以外还含有高水平的苹果酸,苹果酸使酸樱桃具有酸味。该方法分离苹果酸和其它含有机酸的糖,可将它们用于食品以便提供酸味和风味。最优选的是BALATON和MONTMORENCY樱桃。
分离的花色素苷、生物类黄酮和酚类的混合物可用作一种天然的营养性/食物增补剂。关于这一点,可以用粉末、液体或固体的形式提供所述分离的混合物。例如,该混合物可以为可复制的粉末组合物,例如当用水、牛奶或其它类似的液体复制时,将提供一种饮料。或者,该混合物可以为固态如片剂、凝胶胶囊、软凝胶等。另外,也可将该混合物掺入食料中。
通常,可以用一种形式提供混合物以便所述混合物的含量占总组合物重量的约0.01%到50%,优选约0.1%到30%,更优选约0.5%到25%。
作为一个例子,当以片剂的形式提供所述混合物时,该片剂可以提供花色素苷和生物类黄酮的日剂量大约在0.1mg到300mg之间,希望从1到200mg,优选60-100mg的日剂量。一百颗樱桃提供60到100mg的花色素苷。可以按照0.1到50mg的日剂量提供酚类(图4)。一百颗樱桃提供1-50mg的酚类。通过分离单体化合物并将它们混合在一起可以调节花色素苷、生物类黄酮和酚类的量。在一个实施方案中,可以使用花色素苷、生物类黄酮和酚类的天然混合物。也可以以等剂量的液体形式提供该组合物。
树脂具有吸附花色素苷、生物类黄酮和酚类的表面。一类优选的吸附树脂为由苯乙烯和二乙烯基苯组成的聚合交联树脂,例如AMBERLITE系列的树脂,如AMBERLITE XAD-4和AMBERLITEXAD-16,商业上可从Rohm&Haas Co.,Philadelphia.PA获得。按照本发明适合使用的其它聚合交联的苯乙烯和二乙烯基苯吸附树脂为Dow Chemical Company,Midland,Michigan等生产的XFS-4257、XFS-4022、XUS-40323及XUS-40322。
优选使用商业上可获得的、政府批准的(当要求时)苯乙烯-二乙烯基-苯(SDVB)交联共聚物树脂(例如AMBERLITE XAD-16)。因此,在优选实施方案中,将商业上从Rohm和Haas Company获得并描述于美国专利号4,297,220中的AMBERLITE XAD-16作为所述树脂使用。该树脂是非离子的疏水、交联聚苯乙烯二乙烯基苯吸附树脂。AMBERLITE XAD-16具有大网络的结构,该结构既具有连续的聚合物相又具有连续的多孔相。在一个特别优选的实施方案中,本发明所使用的树脂的粒径在100-200微米范围内。
预期,其它吸附剂,如那些AMBERLITE XAD吸附剂系列中含有疏水大网络树脂珠粒、粒径在100-200微米范围内的吸附剂,在本发明的方法中也将是有效的。此外,不同种类的AMBERLITE也适宜用于本发明,如AMERCHROM CG系列的吸附剂,其粒径在100-200微米范围内。优选AMBERLITE XAD-16,因为它可以重复使用多次(超过100次)。可是,对食品而言,预期在本发明中使用政府批准的树脂将认为是重要的和/或理想的。
可以使用任何溶剂以移去吸附的花色素苷、生物类黄酮及酚类。优选含有1到4个碳原子的低级链烷醇而最优选乙醇,因为它被批准用于食品。典型地,乙醇与水共沸,可是可以使用无水乙醇。使含有樱桃中苹果酸和糖的水通过所述柱。收集这些水并且可以用于食品中作为调味剂。
优选由BALATON和MONTMORENCY樱桃中分离花色素苷、生物类黄酮及酚类。樱桃组合物的内容部分显示于1997年2月12日申请的美国申请系列号08/799,788中和部分显示于1998年12月11日申请的美国申请系列号60/111,945中。正如这些申请中所述,在密歇根洲和美国,Montmorency(欧洲酸樱桃(Prunus cerasus))种占酸樱桃栽培品种的95%以上。可是,在几个密歇根洲果园正种植Balaton酸樱桃(P.Cerasus),一种新的酸樱桃栽培品种以便代替Montmorency。这种樱桃具有较高含量的花色素苷并且认为是一种更好的品种。已经报道过Montmorency和Balaton酸樱桃的花色素苷含量(Wang等,1997;Chandra等,1993)。可是,以前未进行过Balaton酸樱桃中其它酚类化合物的详细研究。早期的研究显示MONTMORENCY樱桃含矢车菊色素-3-龙胆二糖苷和矢车菊色素-3-芸香糖苷(Li,K.C.等,J.Am.Chem.Soc.78979-980(1956))。在七种酸樱桃品种中有六种也发现了矢车菊色素-3-葡萄糖基芸香糖苷(Harbone,J.B.等,Phytochemistry 3453-463(1964))。Dekazos(Dekazos,E.D.,J.Food Sci.35237-241(1970))报道在MONTMORENCY樱桃中花色素苷色素为与矢车菊色素-3-槐糖苷、矢车菊色素-3-芸香糖苷及矢车菊色素-3-葡萄糖苷一起的芍药花青素-3-芸香糖苷、芍药花青素和矢车菊色素。可是,矢车菊色素-3-葡萄糖基芸香糖苷以及矢车菊色素-3-葡萄糖苷、矢车菊色素-3-槐糖苷和矢车菊色素-3-芸香糖苷在酸樱桃中被证明是主要的色素。采用HPLC保留值,Chandra等(Chandra,A等,J.Agric.Food Chem.40967-969(1992))报道,在密歇根洲种植的MONTMORENCY樱桃中矢车菊色素-3-槐糖苷和矢车菊色素-3-葡萄糖苷分别是主要的和次要的花色素苷。类似地,已查明矢车菊色素-3-木糖基芸香糖苷是MONTMORENCY樱桃中较小量的色素(Shrikhande,A.J.和F.J.Francis,J.Food Sci.38649-651(1973))。
使用术语“载体”或“填充剂”意指一种组合物,加入载体或填充剂以便增加源于樱桃的纯化组成的组合物体积。最好是干燥的樱桃果肉。这些载体包括含有任何可食用淀粉的材料、蛋白质如脱脂干燥乳。在该组内有面粉、糖、大豆粗粉、麦芽糖糊精和各种调味品如盐、胡椒、香料和药草。填充剂使用量为该混合物的约10-6和106重量份之间。
按照食品的活性成分大约在0.1和10mg/g之间的量将该组合物加入食品。所述量的选择最好不影响食品的味道并且又能产生最有益的结果。正如本领域技术人员所熟悉的一样,所述食品可以是高水分(湿的)或低水分(干的)。当用作食物增补剂时,片剂含有0.1到1g的活性成分。一种特定的食品为熟肉和其它预制食品,其中所述组合物给食品提供抗氧化性质和任选的颜色。该组合物可以作为一种调味品分散到预制食品上以便提供营养性或植物性益处。
已经发现了植物化学品的提取和分离方法(Chandra,A等,J.Agric.Food Chem.411062(1992);Wang,H.等,J.Agric.Food Chem.452556-2560(1997))以及迅速筛选抗氧化活性的方法(Arora,A.和G.M.Strasburg,J.Amer.Oil Chem.Soc.741031-1040(1997))。利用这些方法鉴别和鉴定源于BALATON和MONTMORENCY樱桃的抗氧化化合物。连续用己烷、乙酸乙酯和甲醇提取榨汁后的樱桃组织。在筛选试验中甲醇和乙酸乙酯部分皆显示强的抗氧化活性。通过硅胶真空液相色谱法进一步纯化乙酸乙酯部分得到四个亚部分,用制备性反相HPLC进一步将显示最强的抗氧化活性的亚部分分成七个部分。附图2和3显示由BALATON樱桃分离出的生物类黄酮。因此在酸樱桃中有许多类似的或同系的化合物。
鉴别两种新的酚类化合物为I)1-(3’-4’-二羟基肉桂酰基)-2,3-二羟基环戊烷和II)1-(3’-4’-二羟基肉桂酰基)-2,5-二羟基环戊烷。
由樱桃水果的乙酸乙酯提取物中分离的并用光谱方法鉴定的其它化合物包括1-(3’-甲氧基,4’-羟基肉桂酰基)奎尼酸、2-羟基-3-(2’-羟基苯基)丙酸、2-羟基-3-(2’-羟基苯基)丙酸甲酯、D(+)-苹果酸、β-谷甾醇和β-谷甾醇葡萄糖苷。附图4显示一些分离得到的酚类。也鉴别和完全鉴定由果汁部分获得的花色素苷成分(Chandra,A.等,J.Agric.Food Chem.411062(1992);Wang,H.等,J.Agric.Food Chem.452556-2560(1997));该结果表明这些化合物具有有效的抗氧化活性。
正如附图4所示,化合物 可以以一种异构体或一种纯的形式存在,其中R1和R2选自羟基和氢并且R1和R2之一为羟基。该化合物也可为上述化合物的异构体,其中R1为羟基而R2为氢。该化合物的特定异构体为1-(3’,4’-二羟基肉桂酰基)-环戊-2,5-二醇,可由酸樱桃中将其分离为一种纯化合物。所述化合物也可以是以上化合物的异构体,其中R1为氢及R2为羟基。该化合物的特定异构体为1-(3’,4’-二羟基肉桂酰基)-环戊-2,3-二醇,可由酸樱桃中将其分离为一种纯化合物。
本发明也涉及一种抑制需要此处理的材料中氧化的方法,该方法包括以抑制所述材料氧化的量,提供给该材料从酸樱桃中分离的一种化合物或一种异构体的混合物,并且以以下结构式的纯的形式提供 其中R1和R2选自羟基或氢并且R1和R2之一为羟基。在一个实施方案中,所述方法使用上述化合物的异构体,其中R1为羟基而R2为氢。该化合物的特定异构体为1-(3’,4’-二羟基肉桂酰基)-环戊-2,5-二醇,可由酸樱桃中以一种纯化合物形式分离。在另一个实施方案中,所述方法包括使用上述化合物的异构体,其中R1为氢而R2为羟基。该化合物的特定异构体为1-(3’,4’-二羟基肉桂酰基)-环戊-2,3-二醇,可由酸樱桃中作为一种纯化合物形式分离。还有另一个实施方案,所述方法包括使用所述异构体的混合物。
在本发明的一个实施方案中,所述组合物包含可从酸樱桃中分离作为一种纯化合物的1-(3’,4’-二羟基肉桂酰基)-环戊-2,3-二醇或它与1-(3’,4’-二羟基肉桂酰基)-环戊-2,5-二醇一起作为一种混合物;以及用于该化合物的一种无毒性的载体或填充剂。在本发明的另一个实施方案中,所述组合物包含可从酸樱桃中分离作为一种纯化合物的1-(3’,4’-二羟基肉桂酰基)-环戊-2,5-二醇或它与1-(3’,4’-二羟基肉桂酰基)-环戊-2,3-二醇一起作为一种混合物;以及用于该化合物的一种无毒性的载体或填充剂。所述组合物可以另外含有其它抗氧化剂如加入纯化合物中的源于樱桃的花色素苷、生物类黄酮和酚类。另外,在该组合物中使用的载体或填充剂是适于动物或人类使用的。
所述组合物由本发明的抗氧化剂和一种特定的、可食用填充剂组成,该填充剂的量为每份发明物约0.1到30份,当导入一种可氧化的材料时,本发明的产物抑制该材料的氧化。含有本发明抗氧化剂的组合物可以制成任何适宜的固态或液态剂型并且用作营养性/食物增补剂。通常,所选择的剂型以纯化合物、以含有两种异构体的混合物或以与其它抗氧化剂的混合物形式提供1-(3’,4’-二羟基肉桂酰基)-环戊-2,5-二醇或1-(3’,4’-二羟基肉桂酰基)-环戊-2,3-二醇的日剂量。本发明以一种组合物、混合物形式或以纯化的形式用作一种抗炎剂,或用于治疗慢性疾病,用于预防疾病、改善疾病的影响或刺激免疫反应以便更有效地同疾病斗争。详细地说,本发明以一种组合物、混合物形式或以纯化的形式可用于预防或治疗各种类型的疾病,所述疾病可能部分或全部由自由基引起。
正如以上所述,本发明的组合物可以另外包括一种或多种选自花色素苷、矢车菊色素、生物类黄酮、酚类及其混合物的抗氧化剂。优选从樱桃中,尤其BALATON和MONTMORENCY樱桃中分离花色素苷、生物类黄酮和酚类。
在一个优选的实施方案中,所述花色素苷选自矢车菊色素-3-2”- 吡喃葡萄糖基-6”-o--L-鼠李糖基 吡喃葡萄糖苷、矢车菊色素-3-6”-o--L-鼠李糖基 吡喃葡萄糖苷、矢车菊色素 吡喃葡萄糖苷及其混合物。在一个优选的实施方案中,所述生物类黄酮为7-甲氧基-5,8,4’-三羟基黄酮。
含有本发明抗氧化剂或本发明化合物的组合物可以加入食品中作为一般的抗氧化食品添加剂。该食品添加剂尤其可以包括作为纯化合物或作为包含两种异构体的混合物的1-(3’,4’-二羟基肉桂酰基)-环戊-2,3-二醇或1-(3’,4’-二羟基肉桂酰基)-环戊-2,5-二醇。该食品添加剂可以另外包含其它选自花色素苷、矢车菊色素、生物类黄酮、酚类及其混合物的抗氧化剂。在一个优选的实施方案中,所述花色素苷选自矢车菊色素-3-2” 吡喃葡萄糖基-6”-o--L-鼠李糖基 D-吡喃葡萄糖苷、矢车菊色素-3-6”-o--L-鼠李糖基 吡喃葡萄糖苷、矢车菊色素 吡喃葡萄糖苷及其混合物。在一个优选的实施方案中,所述生物类黄酮为7-甲氧基-5,8,4’-三羟基黄酮。优选从樱桃,尤其BALATON和MONTMORENCY樱桃中分离花色素苷、生物类黄酮和酚类。含有本发明抗氧化剂或本发明化合物的组合物可以是一般的抗氧化食品添加剂,可将该添加剂加入到食品中,所述食品为高水分(潮湿的)或低水分(干燥的)食品、新鲜的或未烹调的食品、熟化的或烹调的食品。当加入到含有脂质的食品中时,该抗氧化化合物或组合物抑制脂质氧化并且因此抑制酸败的发展。在烹调前将该组合物加到食用肉中抑制杂环芳香胺(HAA)的形成,杂环芳香胺在烹调时产生并且已经证实是致癌的物质。
实施例1和2正如附图5所示,在一个工业用的WARING混合器中将个体速冻(“IQF”)的樱桃(该樱桃已经去核)解冻并混合。以10,000rpm离心该混合物并且倾去果汁。用乳酪布进一步挤压残余物即果肉以便移去额外的果汁。
在15℃冻干所述果肉。在AMBERLITE XAD-16 HP树脂上处理果汁产生樱桃酸性物质、花色素苷、生物类黄酮和酚类。用乙醇(1-2L),然后用水(6L)洗涤1kg所述XAD-16树脂。在装入带有棉塞的玻璃柱(10ID×90cm长)之前使该XAD-16树脂在水中静置1小时。在装入欲分离的果汁之前用水(2L)洗涤该填充柱。每次纯化800ml果汁。将果汁加到柱表面上并且使其不流动而沉降。然后用水洗脱并且弃去开始的1L洗脱液。收集接着的2L洗脱液,因为其含有带酸味的樱桃果汁,该酸味是因其含有源于樱桃的苹果酸和糖。然后在BALATON樱桃果汁的情况下,另外用4L水洗柱而对于MONTMORENCY樱桃果汁另外用5 L水洗柱。一旦收集了樱桃果汁,弃去用水洗脱的其余洗脱液。然后用乙醇(1.3-1.5L)洗脱该柱并收集合有花色素苷、生物类黄酮和酚类的红色溶液(700-800ml)。然后,在重复所述过程多次(超过100次)之前放干柱子并用10L水洗涤。在真空(20毫托)下蒸发该红色醇溶液除去乙醇并且用50ppm的抗坏血酸稳定该水溶液并在10℃冻干。收集并储存该红色粉末。实施例1的结果
实施例2的结果
优选将实施例1和2的红色粉末与作为载体的干燥果肉混合并制片成1到1000mg的包括该载体的片子(一个成人的日剂量)。
可以将各种食品等级的酸加入到分离的花色素苷、生物类黄酮及酚类中以便预防分解。最好不要加入调味剂。优选抗坏血酸(维生素C)。可以在干燥该樱桃化合物前或后加入所述酸。
对于小规模的处理,可以利用冻干除去水分。对于大规模的生产,优选在一个空气循环烤箱中干燥。
实施例3正如附图6所示,提供一个敞口的容器10,其带有一根进口管线11和一根出口管线12,它们的阀门分别为13和14。在该敞口的容器10中提供树脂珠15。将水引入容器10,然后通过出口管线12转移并弃去。将如实施例1中一样的樱桃果汁(没有果肉或核)引入到容器10中并且让其停留25分钟。水和果汁的温度在约20℃到30℃之间。然后通过出口管线12转移含有苹果酸和糖的樱桃果汁残余物并将其保留作为食品调味剂。然后再用来自于进口管线11的水洗涤容器中的树脂15并通过出口管线12转移并弃去。用通过进口管线11引入的95%乙醇提取在树脂颗粒上的花色素苷、生物类黄酮和酚类。从容器10中移去含有花色素苷、生物类黄酮和酚类的乙醇。从花色素苷、生物类黄酮和酚类中除去乙醇并在氮气下快速干燥。然后如实施例1一样,优选将得到的粉末与干燥的樱桃果肉或其它载体混合。用水洗涤该树脂颗粒,然后该树脂和乙醇可以循环多次。
实施例4在各种条件下,在水溶液中用抗氧化活性的荧光测定方法试测源于樱桃的乙酸乙酯粗提物(含有花色素苷、生物类黄酮和酚类)。首先描述该荧光测定方法。
因为需要筛选大量的化合物或提取物的抗氧化活性,所以要求采用一个模型系统,该模型系统可以适度地表现单独的所述组合物或在食物产品中的组合物的结构和功能特征。该试验也必须灵敏、迅速和经济。使用一种基于荧光的测定方法评估抗氧化功效(Arora,A.和G.M.Strasburg,J.Am.Chem.Soc.1996)。制备由1-硬脂酰基-2-亚油酰基-sn-甘油-3-胆碱磷酸组成的大单室囊泡,该单室囊泡十分类似于生物膜的性质,而生物膜是过氧化的主要位点之一。将一种荧光探针即1,6-二苯基己三烯丙酸,加入该膜中以便极性首基固定该探针在水性界面附近,而疏水部分平行于脂肪酸链。该探针与过氧化期间产生的自由基反应,导致荧光强度随着时间降低。用一种过氧化引发剂(如亚铁金属离子或自由基发生剂AAPH(氮杂双-[2-脒基丙烷盐酸盐])引发该反应并且在存在或缺乏待测抗氧化组合物的情况下,测定荧光降低的动力学。测定一种给定浓度的化合物目前仅仅需要21分钟,仅仅消耗几微克脂质并且可以容易地用一个简单的荧光计进行测量。
按照MacDonald等描述的方法(MacDonald,R.C.等,Biochim.Biophys.Acta 1061297-303(1991))由1-硬脂酰基-2-亚油酰基-sn-甘油-3-胆碱磷酸制备大单室囊泡(LUVs)。简单地将脂质溶解在氯仿中并且使用一个旋转蒸发器使其干燥成一层薄膜。将干燥的膜重新悬浮在水性缓冲液中并且使用Liposofast脂质体挤压机(Avestin,Inc.,Ottawa,Canada)将其重复地挤压通过100nm孔径的聚碳酸酯滤膜。用冷冻-断裂(freeze-fracture)扫描电子显微镜证实囊泡大小的均一性(80-100nm)和单室性。在制备期间将所述荧光探针二苯基己三烯丙酸(DPH-PA)按照1∶350(探针∶脂质)的摩尔比率加入到该囊泡中。为了进行荧光实验,将含有DPH-PA的LUVs按照100μM的终浓度悬浮在100mM NaCl、pH7.0的50mM tris-HEPES缓冲液中。该荧光探针在384nm被激发并在423nm监测发射。由于加入了亚铁离子或自由基发生剂AAPH,LUVs中的脂质氧化受到抑制;通过DPH-PA的荧光强度的降低监测该过程,其荧光强度的降低是由于与经21分钟产生的自由基反应所导致的。使用作为时间函数的荧光强度降低的曲线测定脂质氧化的动力学。该结果显示用乙酸乙酯提取的粗花色素苷在抑制氧化方面是有效的。
可以使用溶剂提取的花色素苷、生物类黄酮和酚类;可是,由于该产品将作为一种食品并且因为费用的原因这并不是优选的。当使用优选的吸附树脂时,这一步是不必要的。也可以用色谱法分离和重组成分;可是,对于本发明的目的而言,这就太昂贵了,因为它涉及高压液相色谱法。
实施例5用Arora和Strasburg设计的方法测定樱桃花色素苷的抗氧化活性。随着反应的进行,荧光探针将降解,导致荧光强度的下降。因此,在抗氧化剂存在下,荧光衰变的速度将降低。实验显示花色素苷1-3和苷元矢车菊色素的抗氧化活性与商业上的抗氧化剂丁基化的羟基茴香醚(BRA)和丁基化的羟基甲苯(BHT)相比更有利(图7)。这些樱桃化合物也显示较α-生育酚更好的抗氧化活性。在2mM浓度下,含有生育酚的样品的过氧化程度与未加抗氧化剂的含Fe+2样品的过氧化程度没有差别(图7)。
花色素苷的苷元矢车菊色素比它的葡萄糖苷更有效,提示花色素苷的抗氧化活性是归因于它们的苷元部分。花色素苷1-3分别含有3、2和1个糖残基,这解释了所观察到的花色素苷1的抗氧化活性最低。在C3位的糖残基的数量似乎对抗氧化活性是十分的重要。在C3位的糖单元的数量越少抗氧化活性越高。据报道芳氧基的稳定性影响化合物的抗氧化活性并且可能引起助氧化作用。因此,矢车菊色素的抗氧化活性可能取决于它的芳氧基的稳定性。在花色素苷和矢车菊色素的B环上的邻-二羟基取代对于稳定产生的自由基是重要的,该自由基是通过3’和4’-OH部分产生的。在花色素苷中的邻-二羟基也有可能螯合金属离子并因此防止铁引起的脂质过氧化。
在矢车菊色素的制备中,在80℃,用3NHCl(20mL)搅拌含有1-3的花色素苷混合物(500mg)10小时。与花色素苷的制备一样,在XAD-4柱上纯化该反应混合物。蒸发矢车菊色素的甲醇溶液至干,得到红色的非结晶性粉末(190mg)并且使用前在-30℃储存。
在抗氧化测定中,将缓冲液储存在Chelex 100中以便移去金属离子。在真空下干燥含有5M1-硬脂酰基-2-亚油酰基-sn-甘油-3-胆碱磷酸(Avanti Polar Lipids,Inc.,Alabaster,AL)和15nM荧光探针3-(对-(6-苯基)-1,3,5-己三烯基)苯基丙酸(Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR)的混合物。将产生的薄膜悬浮在500L的缓冲液(NaCl,0.15M;EDTA0.1mM;MOPS 10mM)中并且使其在一个EtOH-干冰浴中经受10次冻-融循环。然后用Liposofast脂质体挤压机(Avestin,Inc.,Ottawa,Canada)使悬浮液通过100nm孔径的聚碳酸酯膜29次。将产生的脂质体(20nM)悬浮在2mL的缓冲液(100mM NaCl,50mM HEPES,pH7.0)中。通过加入4nM的Fe+2引发过氧化。在2-M浓度下测定花色素苷、BHT、棓酸丙酯和-生育酚(维生素E)。对照样品不含Fe+2或试验化合物。用SLM4800分光荧光计(SLM Instruments,Urbana,IL)监测有或没有试验化合物,随后立即加入Fe+2的脂质悬浮液的荧光强度21分钟。通过以t=0分钟的荧光值除以给定时间点的荧光值来测定相对荧光值。结果显示于图7中。由酸樱桃中分离的花色素苷(图1的1-3)和矢车菊色素在体外呈现可与商业产品相比的抗氧化活性。在2-mM浓度下,花色素苷1-3及其苷元矢车菊色素对脂质的过氧化抑制分别为39、70、75和57%。在2-mM浓度下,1-3和矢车菊色素的抗氧化活性可与叔丁基氢醌和丁基化羟基甲苯相比并且优于维生素E。
实施例6和7用与实施例5相同的方法,检测如图2、3和4所示精选的化合物的抗氧化活性。结果显示于图8和9中。对于实施例6,下列化合物的抗氧化活性显示于图8中化合物1=柚苷元化合物2=染料木黄酮化合物3=绿原酸化合物4=五羟黄酮3-鼠李糖苷化合物5=莰非醇3-芸香糖苷化合物6=3’-甲氧基莰非醇3-芸香糖苷化合物7=染料木黄酮7-葡萄糖苷化合物8=5,8,4’-三羟基-6,7-二甲氧基黄酮对于实施例7,下列化合物的抗氧化活性显示于图9中化合物1=绿原酸甲酯化合物2=2-羟基-3-(邻-羟基苯基)-丙酸化合物3=1-(3’-4’-二羟基肉桂酰基)-2,5-二羟基-环戊烷化合物4=1-(3’-4’-二羟基肉桂酰基)-2,3-二羟基-环戊烷在图9中,将抗氧化化合物1、2、3和4(如图4所示)与各种抗氧化剂相比较。测试的抗氧化剂为咖啡酸、阿魏酸、绿原酸、对-羟基肉桂酸和商业上可获得的抗氧化剂叔丁基氢醌(TBHQ)和丁基化羟基甲苯(BHT)。
采用Fe+2引起的脂质过氧化测定方法检测抗氧化活性获得显示于图8和9中的数据。为了制备在Fe+2引起的脂质过氧化测定方法中使用的底物,在真空下,用旋转蒸发器干燥含有5μmol 1-硬脂酰基-2-亚油酰基-sn-甘油-3-胆碱磷酸(从Avanti Polar Lipids,Inc.,Alabaster,Alabama获得)和0.015μmol的荧光探针3-(对-(6-苯基)-1,3,5-己三烯基)苯基丙酸(从Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oregon获得)的混合物。将产生的脂质膜悬浮在1000μL(实施例6)和500μL(实施例7)的溶液中,该溶液含有0.15M NaCl、0.1mM EDTA、和0.01M4-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲剂。用CHELEX100(从Sigma Chemicals,St.Louis,Missouri获得)以5g/100mL缓冲剂的浓度预处理MOPS缓冲剂以便除去任何微量的金属离子。然后,用干冰/乙醇浴使该悬浮液经受10次冻-融循环。然后用Liposofast挤压机(Avestin,Inc.,Ottawa,Canada)使脂质-缓冲剂悬浮液通过100nm孔径的聚碳酸酯膜29次以便产生单室脂质体。
为了进行Fe+2引起的脂质过氧化测定,用CHELEX100处理的缓冲剂(对于实施例6,含有100mM NaCl、50mM N-2-羟基乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)缓冲剂(pH7.0),对于实施例7,含有200mMNaCl、100mM HEPES缓冲剂(pH7.0))将20μL等份的上述脂质体悬浮液稀释到2mL,在室温下温育5分钟,随后在分光荧光计的恒温比色杯储蓄器中保持在23℃温育另外5分钟。在缺乏或存在任何试验化合物的情况下,通过加入20μL0.5 mM的FeCl2使Fe+2终浓度为0.5μM引发过氧化。对照样品不含有Fe2+或任何试验化合物。用荧光分光荧光计(从SLM Instruments,Inc.,Urbana,Illinois获得的SLM4800)以384nm的激发波长,在21分钟内每3分钟测量一次这些脂质体溶液的荧光强度。相对荧光强度随着时间降低显示了过氧化速度。用以下公式计算抑制脂质过氧化的百分率(PI)PI={[(Frel)Pl-(Frel)Fe]/[(Fref)c-(Frel)Fe]}×100其中(Frel)Pl为Fe(II)和试验样品在21分钟时段结束时的相对荧光强度,(Fref)c为对照样品在21分钟时段结束时的相对荧光强度,而(Frel)Fe为含有Fe(II)的样品在21分钟时段结束时的相对荧光强度(Arora et 41.(1997).J.Amer.Oil Chem.Soc.741031-1040)。
对于实施例6,在10μM浓度下测定化合物1、2、3、4、7和8的抗氧化活性。类黄酮对Fe+2脂质过氧化的抑制作用归因于它们螯合Fe+2形成惰性络合物的能力,所述惰性络合物不能够引发过氧化(Afanas’ev etal.,1989)。另外,认为类黄酮的Fe+2络合物保留它们的自由基清除活性,因此可以在脂质过氧化中清除自由基中间体。类黄酮也可以象自由基清除剂一样起作用。正如图8所示,在研究的10μM浓度下,化合物8(5,8,4’-三羟基-6,7-二甲氧基黄酮)的抗氧化活性优于1、2、4和7的抗氧化活性。
较早的报道提示,对于类黄酮有效自由基清除而言,认为B环上邻-二羟基(Bors等,1990)、C环3位羟基(Afana’s等,1989;Mora等,1990)及与4-氧代官能基共轭的C2-C3双键(Bors等,1990)的存在是必需的。即使化合物8没有3-羟基并且在B环上只有一个羟基,化合物8的抗氧化活性也高于五羟黄酮3-鼠李糖苷。五羟黄酮3-鼠李糖苷除了含有一个3-羟基和与4-氧代官能基共轭的C2-C3双键外,在B环上含有邻-二羟基。化合物8抗氧化活性的升高可能是由于该羟基和在A环上的两个甲氧基。Arora等(1997)报道7,8-二羟基黄酮与五羟黄酮显示相似的抗氧化活性,虽然它在B环上和在3位缺少任何取代。
在图9中,化合物3和4在大单室囊泡中抑制Fe+2引起的脂质过氧化活性在20μM下大约为80%。化合物1显示大约50%的抑制活性。可是,即使在100μM浓度下测试,化合物2不显示抗氧化活性。测定结果也显示与阿魏酸相比对-羟基肉桂酸是一种弱抗氧化剂。可是,咖啡酸类似物,化合物3和4在该测定中显示出最高的抗氧化活性。TBHQ和BHT抑制脂质过氧化的百分率在20μM浓度下>90%。该测定显示咖啡酸是最好的抗氧化剂,随后是化合物4、化合物3、绿原酸和绿原酸甲酯。
实施例8测试实施例1和2的组合物的抗氧化性质并且发现它们可与实施例5相比。
抗氧化剂化合物的潜在用途是减少或消除细胞氧化的损害、清除自由基以减少细胞死亡、减少动脉粥样硬化或动脉硬化、减少心脏病发作的发生率、减少与关节炎和痛风有关的疼痛的发病率及减慢衰老。
以上描述仅打算作为本发明的例证并且本发明仅受此后附带的权利要求书的限制。
权利要求
1.一种给活的哺乳动物提供营养性(nutraceutical)或植物性(phytoceutical)益处包括抗氧化益处的方法,该方法包括以提供给所述哺乳动物营养性或植物性的量,喂给哺乳动物一种自樱桃分离的组合物,所述组合物选自花色素苷、生物类黄酮、酚类及其混合物。
2.权利要求1的方法,其中所述哺乳动物为人类并且以预制食品的方式提供所述组合物。
3.权利要求1的方法,其中所述组合物是干燥的。
4.权利要求1的方法,其中所述组合物是干燥的并且含有食品级的载体。
5.权利要求4的方法,其中所述载体为干燥的樱桃果肉。
6.权利要求1的方法,其中所述组合物含有一种载体并且组合物与载体的比率在0.1比100和100比0.1之间。
7.权利要求1的方法,其中所述组合物为液态。
8.权利要求1至7中任意一项的方法,其中所述组合物是花色素苷、生物类黄酮和酚类的混合物。
9.权利要求1的方法,其中所述组合物分离自酸樱桃。
10.权利要求1的方法,其中所述组合物分离自甜樱桃。
11.权利要求1的方法,其中所述组合物分离自MONTMORENCY樱桃。
12.权利要求1的方法,其中所述组合物分离自BALATON樱桃。
13.一种抑制需要此处理的活的生物材料中氧化的方法,该方法包括以抑制所述活的生物材料中氧化的量,提供给该活的生物材料一种选自由樱桃分离的花色素苷、生物类黄酮、酚类及其混合物的组合物。
14.权利要求13的方法,其中所述活的生物材料是在喂给所述组合物的人体内的。
15.权利要求13的方法,其中所述活的生物材料是在喂给所述组合物的动物体内的。
16.权利要求13的方法,其中所述组合物是干燥的。
17.权利要求13的方法,其中所述组合物是干燥的并且含有干燥的食品级载体。
18.权利要求13的方法,其中所述载体是干燥的樱桃果肉。
19.权利要求13的方法,其中所述组合物含有一种载体并且组合物与载体的比率在0.1比100和100比0.1之间。
20.权利要求13至19中任意一项的方法,其中所述组合物是花色素苷、生物类黄酮和酚类的混合物。
21.权利要求13的方法,其中所述组合物分离自酸樱桃。
22.权利要求13的方法,其中所述组合物分离自甜樱桃。
23.权利要求13的方法,其中所述组合物分离自MONTMORENCY樱桃。
24.权利要求13的方法,其中所述组合物分离自BALATON樱桃。
25.一种抑制活的生物材料中氧化的方法,该方法包括给予该生物材料至少一种分离自樱桃的化合物以便抑制氧化。
26.权利要求25的方法,其中所述材料是在喂给作为一种抗氧化剂的所述化合物的活的哺乳动物体内的。
27.权利要求25的方法,其中所述材料是在喂给作为一种抗氧化剂的所述化合物的作为哺乳动物的人体内的。
28.权利要求26或27中任意一项的方法,其中以预制食品的方式将所述化合物喂给该哺乳动物。
29.一种给活的哺乳动物提供营养性或植物性益处,包括抗氧化益处的方法,其中所述组合物存在于食品中并且维持食品的良好质量,该方法包括a.将分离的花色素苷、生物类黄酮、酚类及其混合物加到食品中以便提高食品的质量以及贮存期限;和b.以食品的方式喂给哺乳动物所述组合物,其中以提供给所述哺乳动物营养性或植物性的量,提供食品形式的该组合物。
30.一种可由李属(Prunus)获得的并且以下式代表的纯的形式的化合物或异构体的混合物 其中R1和R2选自羟基和氢并且R1和R2之一为羟基。
31.权利要求30的化合物,其中R1为羟基而R2为氢。
32.权利要求30的化合物,其中R1为氢而R2为羟基。
33.权利要求30的化合物,其中所述化合物可由欧洲甜樱桃(Prunus avium)、欧洲酸樱桃(Prunus cerasus)及其混合物获得。
34.作为一种纯化合物由欧洲甜樱桃、欧洲酸樱桃或其混合物获得的1-(3’,4’-二羟基肉桂酰基)-环戊-2,3-二醇。
35.作为一种纯化合物由欧洲甜樱桃、欧洲酸樱桃或其混合物获得的1-(3’,4’-二羟基肉桂酰基)-环戊-2,5-二醇。
36.权利要求30到35中任意一项的化合物,其中所述化合物还与无毒的载体混合。
37.权利要求36的化合物,其中所述无毒的载体是适于人类使用的。
38.权利要求30到37中任意一项的化合物,其中所述化合物与一种或多种选自花色素苷、矢车菊色素、生物类黄酮、酚类及其混合物的抗氧化剂混合。
39.权利要求37的化合物,其中所述花色素苷来自矢车菊色素-3-2”-O-β-D-吡喃葡萄糖基-6”-O-α-L-鼠李糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷、矢车菊色素-3-6”-O-α-L-鼠李糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷、矢车菊色素-3-β-D-吡喃葡萄糖苷及其混合物。
40.权利要求37的化合物,其中所述生物类黄酮为7-甲氧基-5,8,4’-三羟基黄酮。
41.在抑制氧化的方法中使用的、如权利要求30到39中任意一项所定义的化合物。
42.在抑制炎症的方法中使用的、如权利要求30到39中任意一项所定义的化合物。
43.作为食物增补剂使用的、如权利要求30到39中任意一项所定义的化合物。
44.使用至少一种由樱桃获得的化合物来预防在活组织中的氧化。
45.使用至少一种由樱桃获得的花色素苷、生物类黄酮或酚类化合物来预防在活组织中的氧化。
全文摘要
描述了用樱桃衍生物给哺乳动物特别是人提供营养性或植物性益处的方法。也描述了抑制活的生物材料中氧化的方法。在所述方法中使用源于樱桃的花色素苷、生物类黄酮、酚类或它们的混合物的组合物。
文档编号C07C69/732GK1334740SQ99816054
公开日2002年2月6日 申请日期1999年12月10日 优先权日1998年12月11日
发明者M·G·奈尔, H·王, G·M·斯特拉斯布格, A·M·布雷恩, J·I·格雷 申请人:密执安州大学
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