专利名称：螺旋藻多糖及其提取方法和在制备升白和抗癌药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及螺旋藻多糖，其提取方法以及在制备升白和抗癌药物中的用途。
近几十年来，国内外对中药材钝顶螺旋藻进行了一系列的药理和临床研究，结果表明钝顶螺旋藻具有升高白细胞、补血、提高机体免疫功能、调节血脂、抗癌、抗辐射损伤等多种药理作用。
白细胞减少症临床颇为常见，它的发病原因很多，特别是在肿瘤病人的治疗中，因术后体虚和放、化疗对骨髓造血功能的毒性更为棘手，而当前中药制剂的升白作用有待进一步提高，西药又有一定的副反应。
虽然文献报道了螺旋藻的升白作用，但并未单独对螺旋藻多糖进行这方面的研究。本发明人经研究发现，螺旋藻多糖具有显著的升白细胞作用，其疗效优于升白安，尤其可用于放化疗后的白细胞减少。而且，还具有显著的抑制肿瘤的作用。
本发明的螺旋藻多糖提取物主要是在已知螺旋藻具有的药理及临床作用有效的基础上，采用现代生物技术的理论和方法，从确有实效的单味螺旋藻提取有效部位而制成的具有较高水平的升白和抗肿瘤药物。
用本发明方法制备的多糖提取物，多糖含量大于60％。质量收率介于4.2～4.6％之间。
制备本发明的多糖提取物包括以下步骤A、多糖提取，采取稀碱温浸提取法、水溶液温浸提取法或盐溶液温浸提取法，优选水溶液温浸提取法；B、提取液调蛋白等电点，然后离心；C、离心液取上清液浓缩至一定浓度，采用乙醇沉淀，离心或过滤去除不溶物；D、上清液进行二次乙醇沉淀，再干燥，得螺旋藻多糖提取物。
关于多糖提取方法，可参阅张惟杰主编复合多糖生化研究技术，上海科学技术出版社，1987年。吴梧桐主编生物制药工艺学，中国医药科技出版社，1993年，385页。
其中提取一般用4-10倍，优选约7-8倍量的提取液，在70-90℃，优选约85℃的温度下进行约7-10小时。可以提取1-3次。
蛋白等电点一般调至4-约6.5，优选5.0左右。
离心速度通常在3000-7500转/分之间，优选约3600转/分。
多糖的醇沉浓度在约50％～80％之间，优选75％。
浓缩的倍数在2-6倍之间，优选4倍。
多糖提取物优选于60-70℃，优选60℃，真空下(约0.090Mpa)干燥5-9h，优选8h来进行干燥，如此可使多糖的含水量低于9％。但也可按普通方法进行干燥，但温度不能太高。
本发明利用多糖溶于水的特点用热水浸提，不仅可使多糖释放、溶解，而且可缩短提取时间，防止腐败并使蛋白变性。
根据蛋白在其等电点时溶解度最小的原理，提取液调pH5.0，沉淀提取液中大量杂蛋白，然后用离心的方法去除蛋白沉淀。
利用多糖难溶于高浓度乙醇的特点，用乙醇沉淀多糖；采用75％乙醇沉淀多糖同时还可以除去大量无机盐、单糖、氨基酸和小分子量的多肽。
TLC及GC分析表明此多糖提取物中多糖主要由鼠李糖、岩藻糖、葡萄糖三种单糖组成。其摩尔比为(3.9∶1.4∶11.3)。分子量为3,390～2,907,623，该多糖主链以葡萄糖为主，各单糖存在多种联结方式。通过颜色反应及红外光谱分析证明，该多糖链上有糖醛酸基团及硫酸基团。含量测定参照中国药典95版附录IV分光光度法中比色法测定。
按照药监局新药审批办法要求研究了螺旋藻多糖提取物的初步稳定性。在室温下，对三个批号970710、970815、970912进行了0月、1月、2月、3月考察，考察项目为性状、鉴别、水分、灰分、pH值、霉菌细菌总数及含量测定。各项指标均符合要求。结论螺旋藻多糖提取物在常温下稳定。
按《中药药效学研究指南》的要求进行螺旋藻多糖提取物主要药效学试验。试验结果表明(1)螺旋藻多糖提取物15～60mg/kg/d，给药12天呈剂量依赖性，使CTX所致小鼠骨髓DNA含量，有核细胞数和外周血白细胞数减少得以回升。作用优于阳性药升白安片的作用。
(2)螺旋藻多糖提取物12mg/kg/d预先给药5天，并于照射第7天(骨髓抑制最明显期)，总给药26天，对60Co-γ射线导致的犬骨髓粒细胞系统有核细胞比率和外周血细胞数减少有明显防治作用。
(3)螺旋藻多糖提取物对药物性(CTX)和放射性60Co-γ射线骨髓造血功能损伤和抑制具有明显的防治作用。
并进行毒性试验，结果如下(1)小鼠急性毒性试验螺旋藻多糖提取物水溶液以最高浓度、最大容积(大于5000mg/kg)给小鼠一次灌服和腹腔注射后，连续观察7天，未见动物发生异常表现和死亡，其最大耐受量定为5000mg/kg。
(2)大鼠长期毒性试验螺旋藻多糖提取物分别按240mg/kg、40mg/kg灌服，连续给药90天及180天，给药后，所有动物的一般状况，血液常规、生化指标，主要脏器系数及组织形态学均未出现明显异常变化。
(3)犬的长期毒性试验螺旋藻多糖提取物分别按20mg/kg和200mg/kg喂饲犬，连续给药6个月后，所有动物的一般状况、心电图、血液学及血液生化指标、病理组织学检查均未出现明显异常变化。
在500L搪玻璃罐内加40kg 100目干燥藻粉和320L水，搅匀，夹套加热至内温85℃，保温提取8小时，提取过程中每0.5小时搅拌10分钟以保持提取液均匀和各处温度恒定。温浸结束后冷却到室温，以4mol/L HCl和4mol/L NaOH调节pH5.0，静置1h待大量蛋白沉淀，SS-600离心机离心分离，离心残渣采用初提条件再提取1次，离心弃去二次残渣。清液合并后在500L薄膜浓缩设备中于70℃、0.085MPa真空度下减压浓缩至原体积的四分之一，共得140L浓缩液(折算为d20从1.12g/ml升至1.28g/ml)。待溶液冷却至室温后，加392L 95％药用乙醇使醇浓度为75％，静置8小时以上，离心过滤，并以40L 95％药用乙醇分两次淋洗滤饼后滤干。沉淀(3.5kg)用15倍(52.5L)水溶解并过滤，滤液加入95％乙醇至乙醇浓度为75％沉淀多糖，静置、过滤，用少量95％药用乙醇洗涤沉淀。所得湿固体于60℃、0.090MPa真空度下干燥8h。质量收率介于4.2～4.6％，即每1000g藻粉原料可得42～46g螺旋藻多糖提取物。以硫酸-苯酚法测定糖含量大于60％。
试验一、多糖的质量考察1、多糖的定性分析(1)称取螺旋藻多糖提取物1g加50ml水，制成水溶液。取5ml于试管中加10％α-萘酚乙醇试液2-3滴，摇匀后沿管壁加浓硫酸0.5ml，于两液界面间呈棕色环。
(2)另取上述糖溶液1ml于试管中加1ml 6％苯酚试液和5ml浓硫酸，摇匀，溶液呈棕黄色。
2、多糖含量测定取中试产品6个批号，分别精密称定100mg，置己放有滤纸的小漏斗中，用95％热乙醇(70℃)20ml洗涤，将残留物及滤纸挥去乙醇后一并放入100ml锥形瓶中，加水40ml在电炉上加热至微沸，搅拌溶解，再沿瓶壁加水30ml，冲下粘附其上的多糖，继续加热至微沸保持数分钟，趁热过滤至100ml量瓶中，用70℃水20ml分三次洗涤锥形瓶及滤纸，放冷后用水定容至刻度，从中吸取2.0ml加水稀释至50ml，作为供试品溶液。另精密称定101.2mg无水葡萄糖对照品溶于100ml量瓶中，加水至刻度，吸5.0ml再至100ml容量瓶中，定容至刻度。制备成每100ml含5.06mg葡萄糖的溶液作为对照品溶液。
精密吸取供试品溶液2.0ml；对照品溶液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml，对照品溶液不足2.0ml的加水至2.0ml；空白对照取水2.0ml代替葡萄糖溶液。分别加苯酚试液1.0ml，摇匀，再加浓硫酸5.0ml，摇匀，置冷水中冷却5分钟，再置沸水中加热20分钟，取出流水冷却至室温，按分光光度法(中华人民共和国药典，1995年版一部附录51页)操作，在490nm处测定供试品和对照品的吸收度，以随行的标准曲线计算含量，计算公式如下多糖含量％＝C×D×1/W×K×100其中C-由标准曲线计算得的样品相当于葡萄糖的微克数，μgD-稀释倍数W-样品重量，μgK＝0.9，多糖系由n个单糖脱去n-1个H2O聚合而成，其质量比约为1∶0.9。
葡萄糖标准曲线见表1。
表1葡萄糖标准曲线序号 1 2 3 4 5Cgluc，μg/ml 20.24 40.48 60.72 80.96 101.2A4900.117 0.230 0.352 0.470 0.598由表1中数据作线性回归有C(μg/2ml)＝1.24+168A490，r＝0.9997六批中试产品中的多糖含量见表2。
表2样品中多糖含量样品编号 970710 970815 970912 991008 991020 991102称重(mg) 101.7 98.7100.2 98.996.5102.4A4900.307 0.323 0.291 0.302 0.283 0.307含量(％) 64.970.362.565.763.264.4从表2可知6批产品的多糖含量均大于60％。试验二、螺旋藻多糖提取物对环磷酰胺所致小鼠造血系统抑制的影响
1、对环磷酰胺(CTX)致外周血细胞减少的影响取小鼠60只，随机分成6组。对照组每日灌胃SCMC(15ml/kg)，模型组同样每日灌胃SCMC(15ml/kg)。在受试药组中每日灌胃螺旋藻多糖提取物15mg、30mg或60mg/kg/d。阳性药组用升白安片(无锡市第六制药厂产品，批号960112)60mg/kg(SCMC混悬液)灌服。连续给药12天。给药第5天时，除对照组外，其余各组小鼠均给予腹腔注射环磷酰胺(CTX)(上海第十二制药厂，批号960501)100mg/kg，每日一次，连续3天，同时每天继续给药，于用药第12天(总天数)，从小鼠眼眶取血分别计数WBC、RBC并测定HB(表1)。结果表明环磷酰胺可使小鼠外周血白细胞(WBC)，红细胞(RBC)和血红蛋白(HB)明显减少。螺旋藻多糖提取物15mg～60mg/kg/d给药12天使降低的WBC升高15～60％，作用优于阳性对照药升白安片，对降低的RBC和HB无明显升高作用。
2、对CTX致小鼠骨髓DNA含量和有核细胞数减少的影响取小鼠60只，分组给药及模型方法同前。给药第12天，取各组小鼠两侧股骨，分别进行骨髓DNA含量测定和有核细胞计数。
骨髓DNA含量测定取右侧股骨，除净软组织。用0.005mol/LCaCl210ml将全部骨髓冲入离心管中。置4C冰箱30min，2500rpm离心15min。弃上清，将沉淀物加0.2mol/L HClO45ml充分混匀，90℃加热15min，冷却过滤，滤液用紫外分光光度计于260nm测定紫外吸收值(1OD260＝50μg/ml双链DNA)，5ml最终滤液中DNA含量(每根股骨中DNA含量)＝OD值×50×5，单位μg/股骨。
骨髓有核细胞计数取左侧股骨，用10ml 3％醋酸冲出骨髓细胞，在血细胞计数盘上计数四个大方格的细胞数，所得之数乘以2.5×104，即为一根股骨中的骨髓有核细胞数(注2.5×104表示稀释倍数。四个大方格的体积为0.4mm3，10ml＝10000mm3，10000/0.4＝2.5×104)。
结果表明CTX可使小鼠骨髓DNA含量和有核细胞数明显减少，呈现明显的骨髓抑制作用。螺旋藻多糖提取物能使减少的骨髓DNA含量和有核细胞数得以回升，其疗效优于升白安片。
试验三、螺旋藻多糖提取物对60Co-γ射线所致犬造血系统抑制的影响1、对60Co-γ射线所致犬外周血细胞减少的影响取杂种犬20只，随机分为5组。常规饲养一周后进行实验。给药方式为将药物干燥粉末夹在煮熟猪大肠段内喂饲。正常对照组和60Co-γ照射组(模型组)仅喂给不夹药物的猪肠。受试药组用螺旋藻多糖提取物干燥粉末分别按3mg和12mg/kg夹入食物喂饲，阳性药组喂饲升白安片(12mg/kg)。上述给药每日一次，连续26天。给药第5天用60Co-γ射线对屏蔽骨盆犬照射6.5Gy(剂量率为100伦/分)。具体方法为照射前用20×10×5(cm，长×宽×高)铅砖7块，平放于骨盆前2cm处，60Co-γ射线双侧照射(照射另一侧时亦同法屏蔽骨盆)。动物无屏蔽处组织吸收剂量为6.5Gy。照射后继续给药。并分别于照射后第7、14和21天用注射器在前肢皮下头静脉处取血，分别计数WBC，RBC和测定HB，结果表明60Co-γ射线可使犬外周血WBC、RBC和HB降低，以照射后第7天最明显。60Co-γ照射组(模型组)WBC下降62.5％，RBC下降26.4％，HB下降18.9％。螺旋藻多糖提取物12mg/kg使降低的WBC、RBC和HB分别升高39.5％、24％和20％。
2、对60Co-γ射线所致犬骨髓有核细胞减少的影响取犬20只，分组，给药及模型方法同前。于照射后第7、14和21天分别于股骨下端后腘肌面，用16号骨髓穿刺针穿入骨髓腔并吸取骨髓液，推成数张骨髓片，瑞氏染色，在油镜下检查骨髓象。结果表明60Co-γ射线照射后7天骨髓象粒系和红系呈明显抑制状态。螺旋藻多糖提取物12mg/kg能明显升高降低的粒细胞系统有核细胞比率(升高250％，P＜0.01)，3mg/kg剂量组虽升高粒系31％，但差异不显著。螺旋藻多糖提取物12mg/kg组亦能使降低的红细胞系统有核细胞比率升高50％，但差异不显著，结果见表3。
表3螺旋藻多糖提取物对60Co-γ射线所致犬骨髓造血细胞减少的影响(x±s)
注①有核细胞比率％＝有核细胞(个)/成熟红细胞(个)×100％(每张骨髓片计数200个有核细胞)。
②与正常对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01③与60Co照射组比较ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01④有核细胞比率％＞10％即为正常骨髓象(或增年活跃骨髓象)结论螺旋藻多糖提取物(PSP)15～60mg/kg/d，给药12天呈剂量依赖性使CTX所致小鼠骨髓DNA含量，有核细胞数和外周血白细胞数减少得以回升。作用优于阳性药升白安片的作用。
螺旋藻多糖提取物(PSP)12mg/kg/d预先给药5天，并於照射第7天(骨髓抑制最明显期)，总给药26天，对60Co-γ射线导致的犬骨髓细胞系统有核细胞比率和外周血细胞数减少有明显防治作用。
螺旋藻多糖提取物(PSP)对药物性(CTX)和放射性(60Co-γ射线)骨髓造血功能损伤和抑制具有明显的防治作用。
参考文献1.刘力生，等。螺旋藻多糖对机体免疫功能的提高作用及其机理研究。海洋科学，1991，(6)442.徐惠，等。螺旋藻多糖的分离及其免疫学作用。中国生化药物杂志，1997，(2)72-743.左绍运，等。螺旋藻多糖(PSP)对免疫功能的影响。药物生物技术，1996，(3)158-1624.张有民，等。微量量热法研究螺旋藻活性物质对癌细胞和正常细胞的作用。物理化学学报，1990；(2)435.刘力生，等。螺旋藻多糖对移植性癌细胞的抑制作用及机理研究。海洋科学，1991；(5)33-366.陈锋，等。螺旋藻对二甲肼诱导大肠变性隐窝的抑制作用。中华预防医学杂志，1995；(1)137.张成武，等。钝顶螺旋藻多糖和藻蓝蛋白对小鼠急性放射病的防护作用。营养学报，1996；(3)327-3318.阮继红，等。螺旋藻多糖抗辐射的研究。遗传，1988；(1)85-899.庞启深，等。螺旋藻多糖对核酸内切酶活性和DNA修复合成的增强作用。遗传学报，1988；(5)374-38110.刘维俊，等。海文螺旋藻健血片对动物造血功能的影响。中国海洋药物，1996，(1)1911.梁江明，等。螺旋藻对缺铁性贫血的恢复实验。营养学报，1994；(4)38612.左绍运，云南螺旋藻多糖抗氧化抗疲劳作用的实验研究。中国海洋药物，1995；(4)1813.蒋春.健康食品材料一螺藻多糖的特征及其应用。四川食品工业科技，1990，(2)4314.张宋仁，等，螺旋藻预防实验性大鼠胃溃疡作用的初步研究，中国海洋药物，1991；(4)18
15.许昌韶，等。螺旋藻对肿瘤放疗病人血浆超氧化物歧化酶的影响。中华放射医学与防护杂志，1996，(2)13616.周剑影，等。螺旋藻片对化疗恶性肿瘤患者保护作用的研究。苏州医学院学报，1995；(2)22317.许绍韶，等。螺旋藻对肿瘤放疗病人骨髓及免疫功能的保护作用。苏州医学院学报，1995，(5)81418.汪洪毅，等，急性白血病化疗中钝顶螺旋藻对白细胞作用。中国海洋药物，1996；(60)42-4419.中华人民共和国卫生部药政管理局。中药研究指南(药学、药理学、毒理学)-制备工艺及其研究资料。1994年，25页。
20.张惟杰主编。糖复合物生化研究技术。浙江大学出版社。1994年。
21.张惟杰主编。复合多糖生化研究技术。上海科学技术出版社。1987年。
22.吴梧桐主编。生物制药工艺学。中国医药科技出版社。1993年，385页。
23.徐惠，于志洁，苏富强，等。螺旋藻多糖的分离及其免疫学作用。中国生化药物杂志，1997，18(2)72～8024.周志刚，刘志礼，刘雪娴。极大螺旋藻多糖的分离、纯化及其抗氧化特性的研究。植物学报，1997，39(1)77～8125.左绍远。云南产螺旋藻多糖的分离纯化及其生物活性的初步研究。云南医药，1995，16(6)427～42926.Filkwill DL.Production，isolation，preliminarycharacterization of the exopolysaccharide of CyanobacteriumSpirulina platensis.Biochem Lett，1993，15(6)567～77227.中国科学院数学研究所。常用数理统计方法，1974年。
28.张龙翔主编。生化实验方法和技术。北京高等教育出版社。1981年，第一版；1997年，第二版。
29.吴东儒主编。糖类的生物化学。北京高等教育出版社。1987年。60-97页30.Stephen H and Stephen T.Solubility of inorganic andorganic compounds，Vol1，Part1，457～458
权利要求
1.螺旋藻多糖提取物，特征在于采用以下步骤制备A、多糖提取；B、提取液调蛋白等电点，然后离心；C、离心液取上清液浓缩至一定浓度，采用乙醇沉淀，离心或过滤去除不溶物；D、上清液进行二次乙醇沉淀，再干燥，得螺旋藻多糖提取物。
2.权利要求1的螺旋藻多糖提取物，其中多糖提取采用稀碱温浸提取法、水溶液温浸提取法或盐溶液温浸提取法进行。
3.权利要求1的螺旋藻多糖提取物，其中多糖提取采用水溶液温浸提取法进行。
4.权利要求1的螺旋藻多糖提取物，其中所述提取用7-9倍量的提取液，在70-90℃的温度下进行约7-10小时。
5.权利要求1的螺旋藻多糖提取物，其中所述蛋白等电点调至4-约6.5，优选5.0左右。
6.权利要求1的螺旋藻多糖提取物，其中所述离心的速度在3000-7500转/分之间。
7.权利要求1的螺旋藻多糖提取物，其中所述多糖的醇沉浓度为75％。
8.权利要求1的螺旋藻多糖提取物，其中所述浓缩的倍数在2-6倍之间。
9.权利要求1的螺旋藻多糖提取物，其中干燥于60-70℃、一定的真空度下进行5-9小时。
10.螺旋藻多糖在制备升白药物中的用途。
11.螺旋藻多糖在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及螺旋藻多糖，提取方法和在制备升白和抗肿瘤药物中的用途。其中制备方法包括以下步骤A、多糖提取；B、提取液调蛋白等电点，然后离心；C、离心液取上清液浓缩至一定浓度，采用乙醇沉淀，离心或过滤去除不溶物；D、上清液进行二次乙醇沉淀，再干燥，得螺旋藻多糖提取物。本发明的多糖提取物多糖含量在60％以上，对肿瘤放化疗的骨髓造血功能损伤和抑制具有明显的防治作用，尤其升白作用优于升白安。
文档编号C08B37/00GK1397567SQ0212589
公开日2003年2月19日 申请日期2002年8月1日 优先权日2002年8月1日
发明者殷鸿萍, 怀化 申请人:安徽古井集团九方制药有限公司