专利名称：一种甲壳低聚糖的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种甲壳低聚糖的制备方法及应用，特别是涉及一种采用复合酶水解法的甲壳低聚糖的制备方法和甲壳低聚糖的应用，属于甲壳素深加工技术领域。
背景技术：
甲壳低聚糖(chitooligosaccharides)是一类由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)和/或D-氨基葡萄糖(GA)通过β-1，4糖苷键连结起来的水溶性低聚糖，可通过水解甲壳素(chitin)或壳聚糖(chitosan)来制备。甲壳素和壳聚糖可从虾蟹、昆虫的外壳和真菌的细胞壁中经酸碱处理而得到。这是一种再生资源，地球上资源总量仅次于纤维素。但其结构与纤维素相比，除羟基外还含有乙酰氨基或游离氨基，其功能性质和用途更加重要和广泛，被誉为“二十一世纪的生物材料”。因甲壳素或壳聚糖不溶于水，在人体内不容易被消化吸收，使其应用以及一些重要的生理活性受到限制。
大量研究表明水溶性甲壳低聚糖具有独特的生理活性和优越的功能性质。它能提高机体的免疫能力，增强机体的抗病性和抗感染能力；具有强的抗肿瘤作用，对肿瘤细胞的生长和癌细胞的转移有明显的抑制效果；它还是很有效的双歧杆菌增殖因子，可增殖肠道内有益菌如双歧杆菌等。此外，它还能促进植物细胞的活化，刺激植物生长，提高植物的抗病性；它还具有显著的抗菌性和吸湿保湿作用。因此，甲壳低聚糖在食品、医药、农业、化妆品等领域有广阔的应用前景。
甲壳低聚糖常见的制备方法有化学法和酶法。化学法一般将甲壳素或壳聚糖用浓盐酸加热水解或利用过氧化氢或HNO2氧化降解，因反应剧烈，不易控制，副产物多，产物分离纯化困难，得率低。酶法因反应条件温和，选择性强，避免了低聚糖的破坏，受到广泛重视和研究。酶法降解壳聚糖或甲壳素的一种方法是采用专一性水解酶如壳聚糖酶或甲壳素酶。目前，用微生物生产的这类酶活性偏低，且大多以复杂的酶系存在，分离纯化困难，成本高，难以用于甲壳低聚糖的商业化生产。另一种酶降解方式是采用非专一性水解酶。此类酶对甲壳素或壳聚糖有降解作用，但并非以其为天然底物。尽管非专一性酶对甲壳素或壳聚糖的水解作用机理还不十分清楚，但由于这些酶易从商业上得到，价格低廉，因此代替甲壳素酶和壳聚糖酶，可为甲壳低聚糖的生产开创一条具有商业化价值的新途径。
有关甲壳低聚糖的文献报道很多，国内大多是综述文章，介绍甲壳低聚糖的生理活性和一般制备方法。国外曾报道了木瓜蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶对壳聚糖的不同水解作用，但主要研究集中在水解特性方面。要应用这些非专一性水解酶来工业化生产甲壳低聚糖还存在一些难题一是非专一性酶对壳聚糖的水解程度有限，若单纯使用一种非专一性酶，一方面酶使用量大(一般在20％以上，酶底比达0.2～0.3∶1)，另一方面产物得率也低(20％～40％)，并且产物的相对分子质量偏大，通常只能达到10000左右，而生理活性较高的甲壳低聚糖相对分子质量在5000以下；二是由于壳聚糖不溶于水，在酸溶液中溶解后溶液粘度大，溶解量有限，一般酶作用的底物浓度只有1～3％，这样使产物的分离纯化及浓缩干燥的处理量增大，从而造成生产成本增大；三是水解产物的分离纯化方法虽有应用超滤分离，但对因酸溶解带来的过量酸和过度水解产物单糖不能被除去，产品纯度和质量不高。其工艺不够完善，难以被应用于工业化生产。
发明内容
(1)要解决的技术问题本发明旨在综合国内外研究基础上，着重研究利用非专一性酶对壳聚糖的不同水解作用，寻找各种酶水解之间的协同互补效应，从而组成具有更大水解效果的复合酶来提高壳聚糖被水解的程度，并降低酶用量；同时，研究原料预处理方式对壳聚糖浓度的提高和水解程度的有利影响。此外，研究利用超滤结合离子交换或纳滤技术等方法来分离纯化水解产物，形成甲壳低聚糖的生产工艺。
(2)技术方案本发明所述一种甲壳低聚糖的制备方法是以壳聚糖为原料，经混合酸溶解和加热预处理，用复合酶水解、灭酶、过滤、超滤、离子交换处理或纳滤技术处理、真空浓缩、干燥、制得产品甲壳低聚糖。工艺过程如下述。
原料壳聚糖用虾或蟹壳以及包括昆虫外壳和菌丝体，经酸碱处理后得到。其主要指标应符合下列标准水分≤12％，脱乙酰化度≥70％，灰分含量≤3％，砷(以As计)≤2.0mg/kg，铅(以Pb计)≤10mg/kg。
酸溶解和加热预处理在反应罐中先加入1～5％(w/w)醋酸溶液，边搅拌边投放壳聚糖，同时加入2～5％(W/W)盐酸溶液，并加热至40～90℃，在高速搅拌下1～2h使其全部溶解，配制成5～10％(w/w)壳聚糖溶液。
壳聚糖溶液的浓度高低对甲壳低聚糖的生产有较重要的经济意义。因壳聚糖是大分子，在酸溶液中溶解后，其粘度随着浓度的增加而增高，特别是浓度达到5％以上时，溶液的粘度呈指数增加，外观呈粘稠凝胶状，难以搅拌，此时壳聚糖难以再溶解，浓度不能增加；另外，如果此时加酶液进行酶解，将会因过粘而严重影响酶液的扩散，不利于酶解反应的进行。有必要在酶水解之前降低体系的粘度。
壳聚糖在酸溶液中，因酸的催化作用，其β-1，4糖苷键会发生水解断裂而使溶液粘度降低，其水解程度取决于酸浓度、温度和时间。由于壳聚糖分子中含有游离氨基，在酸溶液中带正电，而使该糖基的糖苷键难以被水解。如果酸浓度太低，则粘度降低很慢，溶解量增加有限；但如果酸浓度太高，易产生过度水解产物相对分子质量500以下的小分子或单糖。因此，本方法的预处理目的是既使其有一定程度的水解，降低溶液粘度；同时又不使水解过度而产生小分子单糖。经过试验，选择用醋酸和盐酸的混合酸溶液对壳聚糖溶液进行酸溶解和加热处理，并且确定了上述合适的酸浓度和预处理温度，从而使壳聚糖溶液的浓度从一般的1～3％提高到10％，这样可有利于酶水解反应的进行，从而可在工业生产中应用。
复合酶水解将壳聚糖溶液调节pH2.5～5.5，复合酶用少量水溶解后加入到壳聚糖溶液中，复合酶用量为壳聚糖量的0.3～3％(w/w)，即酶底比为0.003～0.03∶1。在40～65℃搅拌反应1～5h，直到溶液变稀；所用复合酶为多糖水解酶系、蛋白酶、脂肪酶三类酶中三种不同酶种组成的复合酶，其组成为(1±0.2)∶(1±0.2)∶(1±0.2)(重量比)。多糖水解酶系可以是纤维素酶，淀粉酶，果胶酶等，蛋白酶为木瓜蛋白酶和胃蛋白酶。根据水解产物分子大小的要求，复合酶可选择其中两类或三类中的三种不同酶种组成。
非专一性水解酶降解壳聚糖的有关机理还不十分清楚。壳聚糖分子结构中存在4种类型的糖苷键，即NAG-NAG，NAG-GA，GA-GA，GA-NAG。有人提出中性蛋白酶降解壳聚糖时，打断NAG和GA之间的糖苷键。我们通过研究壳聚糖溶液在不同种类酶分别水解作用下的粘度变化曲线，发现其共同点是在酶水解初期溶液粘度快速下降，而随后反应缓慢，说明这些酶主要以内切方式作用于壳聚糖，使分子链上β-1，4糖苷键被打断，高聚物变成低聚物。但不同种类的酶其水解程度不一样，说明它们可能作用于不同部位的糖苷键。将其中不同种类的酶复合共同作用于壳聚糖，能增强水解作用，表明不同种类的酶水解作用的协同和互补效应比较显著。
我们还比较了三种酶先后分3次加入和三种酶同时一次加入对壳聚糖的水解作用，见表1。
表1三种酶水解作用的协同和互补效应
从表中看出三种酶同时一次加入比先后分次加入其水解程度要相应增加，增加程度达37.7，比分次加入增加53％。
同时，还考察了酶剂量、不同pH条件、不同温度、不同反应时间对酶水解壳聚糖的影响，确定了合适的条件。酶用量为壳聚糖的3％(w/w)，即相当于3mg/ml酶剂量，10％壳聚糖溶液浓度相当于约100mg/ml底物量。反应初期30min内，水解速度很快，随后反应速度减慢，这与单一酶水解作用特点相似；当反应5h后，反应基本趋于平衡。
灭酶将反应液加热至90℃，保持10分钟后，再冷却至40℃。
过滤将酶解反应液过滤除去不溶物。
壳聚糖在酸溶解处理和酶解过程中，添加了一定量的酸、碱和酶制剂，这部分添加物会影响甲壳低聚糖的质量指标，因此有必要对甲壳低聚糖溶液进行分离纯化，脱除过量的酸、盐以及少量未水解的大分子等物质，以保证甲壳低聚糖的纯度。
超滤过滤液用超滤进行分离。膜分子量截留值为5000～10000，以除去蛋白质及大分子。超滤设备操作简单，方便实用，占地面积小，超滤过程中没有物相的变化，不会给产品带来任何副作用，可以在分子级内进行物质的分离。采用膜分子截留值5000和10000对壳聚糖水解液进行脱除蛋白质，分别测定透过液和截留液中的蛋白质含量，计算得到蛋白质脱除率分别达到92.2％和88.5％，表明超滤能有效地脱除蛋白质，能纯化甲壳低聚糖。
离子交换处理超滤液在室温下用离子交换柱以强碱性阴离子交换树脂如717型进行离子交换，使流出液的pH值达到5.5～6.5，用水洗脱离子交换树脂后，再用酸碱液进行树脂再生。应用酶法制得的水解液，由于预处理过程中添加了一定量的酸，这些酸会与甲壳低聚糖分子中的游离氨基结合成盐，其余部分的酸为游离酸。采用离子交换树脂法对超滤液进一步处理，主要是为了脱除游离酸和部分阴离子。分析表明，经处理后的产品甲壳低聚糖保留率达到89％以上，阴离子脱除率达88％，游离酸已基本脱除。离子交换树脂法是工业上最为常用的一种分离方法，操作简单，成本低。因此，选用此法对壳聚糖水解液进行脱除阴离子和脱盐纯化处理，同时对超滤液中残留的少量蛋白质也可被树脂吸附脱除。
真空浓缩将离子交换流出液用真空吸入薄膜蒸发器中进行浓缩，直至浓缩液的可溶性固形物浓度达到20％～40％。
干燥将浓缩液在离心喷雾干燥机中进行加热脱水，控制流速，得到产品甲壳低聚糖粉末。进风温度160～180℃，出风温度70～80℃。
若上述纯化过程中不用离子交换树脂处理，也可采用纳滤技术对超滤液进行处理。纳滤是膜分离领域中一个新兴的物理分离技术，其分离性能介于反渗透和超滤之间，是近年来国际上发展较快的膜分离种类之一。纳滤膜的孔径范围在几个纳米左右，其截留分子质量通常为200～1000道尔顿，在压力驱动下允许一些无机盐和小分子有机物透过膜，既能使大分子有机物和小分子有机物分离，也能使有机物和无机物分离，兼使有机物浓缩。用纳滤技术处理同样能脱盐、脱除游离酸和部分阴离子，并还能除去单糖等相对分子质量500以下的小分子。取纳滤截留液进行真空浓缩、干燥，可得到纯度很高的甲壳低聚糖。甲壳低聚糖纳滤纯化的工艺条件为操作压力1.5～2.0MPa，温度25～50℃。
用本发明方法制备的甲壳低聚糖，它的主要应用为以壳聚糖为主要原料，经酶解，过滤，浓缩，干燥所得的以甲壳低聚糖为主要成分的粉剂充填入胶囊壳或压片制成具有调节免疫功能和调节血脂作用的功能性食品或保健食品。此外，经该方法制备的甲壳低聚糖纯度高、质量高，也可应用于医药、化妆品等行业中。
(3)有益效果生产甲壳低聚糖的原料为壳聚糖或甲壳素，是从虾蟹加工下脚料中提取得到的。我国有很长的海岸线，海洋渔业和淡水水产养殖业发展很快，虾蟹甲壳资源非常丰富。自90年代以来，我国沿海地区及全国各地都建成了许多甲壳素加工厂，年产量估计近十万吨。目前甲壳素主要作为化工或医药原料供出口，或者仅加工成氨基葡萄糖盐类，附加值低，整体技术水平不高。而研究以壳聚糖为原料生产甲壳低聚糖，该产品附加值大，技术含量高。所以本发明对有效利用甲壳素资源，提高我国甲壳素工业水平，促进我国甲壳素工业的发展具有重要的意义；同时，也为我国国民经济的发展和社会服务作出贡献。
从商业酶制剂中找到几种对壳聚糖具有水解作用的非专一性酶，并发现由这些酶组成的几类复合酶具有显著的协同互补水解作用，确定了这些复合酶水解壳聚糖的最适条件。以这几种复合酶在合适水解条件下，可大大提高壳聚糖的水解程度，使产物的相对分子质量在5000以下，酶的用量降低到3％以下，为商业化生产甲壳低聚糖提供了可行性。
将壳聚糖溶于醋酸和盐酸混合酸溶液中，采用温和的预处理方式，使壳聚糖溶液的粘度降低，溶解量增加，从而使壳聚糖溶液的浓度从一般的1～3％提高到10％，使酶解反应底物浓度增加了3倍以上。在这样的处理条件下，酶水解产物中单糖含量＜5％。由于反应物浓度的提高，从而可以节省能源，降低生产成本。
采用超滤结合离子交换树脂或纳滤技术的分离纯化方法，可除去甲壳低聚糖中蛋白质、盐类和单糖，使甲壳低聚糖的纯度达到96％以上(以氨基葡萄糖含量计)。
以壳聚糖为原料，采用商业酶制剂组成的复合酶进行水解，形成了甲壳低聚糖的酶法生产工艺，已通过了500L的中试，甲壳低聚糖产品得率达到83％。产品经理化分析测定，水溶性99.9％，单糖含量3.5％，水分4.5％，灰分0.46％，脱乙酰化度81％，聚合度为2～15，分子量分布500～3000。
附图 甲壳低聚糖的制备工艺流程框图。
具体实施例方式
实施例1以壳聚糖原料30kg溶于3％醋酸和2％的盐酸溶液500L中，加热至60～90℃，不断搅拌直到壳聚糖溶解。将壳聚糖溶液调pH3.5，复合酶组成用果胶酶、胃蛋白酶、脂肪酶各0.3kg以少量水溶解后加入到壳聚糖溶液中，40℃搅拌反应5h，酶解反应结束，灭酶，过滤，滤液用超滤进行分离，膜分子截留值为5000。超滤液在室温下用离子交换柱以强碱性阴离子交换树脂717型进行离子交换，使流出液的pH值达到5.5～6.5。离子交换流出液进行真空浓缩、干燥，制得产品甲壳低聚糖粉末。
实施例2壳聚糖原料50kg，酸溶解和加热预处理时，先用3％醋酸溶液来溶解壳聚糖，同时加入4％盐酸溶液，并加热升温至90℃，来降低壳聚糖溶液粘度，其余条件同实施例1。
实施例3复合酶组成用纤维素酶、木瓜蛋白酶、脂肪酶，其余同实施例1。
实施例4复合酶组成用淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶，其余同实施例1。
实施例5复合酶组成用果胶酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶，其余同实施例1。
实施例6
酶解反应及之前的处理同实施例2。分离纯化处理条件采用超滤和纳滤技术处理，纳滤操作的压力1.5～2.0MPa，通量5～10L/min，温度35～50℃。为了提高纯化效果，可加入纯水稀释几次。随着纯化倍数的递增，截流液中小分子单糖、盐类不断减少，甲壳低聚糖纯度不断提高，最终产品单糖含量少于1％，灰分小于0.3％。
权利要求
1.一种甲壳低聚糖的制备方法，其特征是以壳聚糖为原料，经混合酸溶解和加热预处理，用复合酶水解，灭酶，过滤，超滤、离子交换或纳滤处理，真空浓缩，干燥，制得产品甲壳低聚糖；(1)原料壳聚糖用虾或蟹壳以及包括昆虫外壳和菌丝体，经酸碱处理后得到；(2)酸溶解和加热预处理在反应罐中先加入稀醋酸溶液，边搅拌边投放壳聚糖，同时加入稀盐酸溶液，并加热至40～90℃，在高速搅拌下使壳聚糖全部溶解，配制成5～10％(w/w)壳聚糖溶液；(3)复合酶水解将壳聚糖溶液调节pH2.5～5.5，复合酶用少量水溶解后加入到壳聚糖溶液中，复合酶用量为壳聚糖量的0.3～3％(w/w)，在40～65℃搅拌反应1～5h，直到溶液变稀；所用复合酶为多糖水解酶系、蛋白酶、脂肪酶三类酶中的三种不同酶种组成的复合酶，其组成为(1±0.2)∶(1±0.2)∶(1±0.2)(重量比)；(4)灭酶将反应液加热至90℃，保持10分钟后，再冷却至40℃；(5)过滤将酶解反应液过滤，除去不溶物；(6)超滤过滤液用超滤进行分离，膜分子量截留值为5000～10000，以除去蛋白质及大分子；(7)离子交换超滤液在室温下用离子交换柱以强碱性阴离子交换树脂717型进行离子交换，使流出液的pH值达到5.5～6.5，以除去游离酸、盐类和部分阴离子，用水洗脱离子交换树脂后，再用酸碱液进行树脂再生；(8)真空浓缩将离子交换流出液用真空吸入薄膜蒸发器中进行浓缩，直至浓缩液的可溶性固形物浓度达到20％～40％；(9)干燥将浓缩液在离心喷雾干燥机中进行加热脱水，得到产品甲壳低聚糖粉末。
2.根据权利要求1所述的一种甲壳低聚糖的制备方法，其特征是酸溶解和加热预处理时采用1～5％(W/W)醋酸和2～5％(W/W)盐酸溶液。
3.根据权利要求1所述的一种甲壳低聚糖的制备方法，其特征是所用复合酶可以是多糖水解酶系的纤维素酶、淀粉酶、果胶酶，蛋白酶的木瓜蛋白酶、胃蛋白酶以及脂肪酶，根据水解产物分子大小的要求，复合酶可选择其中两类或三类中的三种不同酶种组成。
4.根据权利要求1所述的一种甲壳低聚糖的制备方法，其特征是产品的分离纯化可以将超滤以后的滤液直接进行纳滤处理，用纳滤膜进行分离纯化，纳滤纯化的工艺条件为操作压力1.5～2.0MPa，温度25～50℃。
5.一种甲壳低聚糖的应用，其特征是以壳聚糖为主要原料，经酶解，过滤，浓缩，干燥所得的以甲壳低聚糖为主要成分的粉剂充填入胶囊壳或压片制成具有调节免疫功能和调节血脂作用的功能性食品或保健食品。
全文摘要
一种甲壳低聚糖的制备方法及应用，属于甲壳素深加工技术领域。本发明解决了采用非专一性酶来提高壳聚糖被水解的程度和水解产物的分离纯化。本发明的要点是以壳聚糖为原料，经加酸溶解和加热预处理以提高壳聚糖溶液的浓度和有利于水解，用多糖水解酶系、蛋白酶、脂肪酶三种非专一性酶组成复合酶对壳聚糖进行酶水解，灭酶，过滤，滤液进行超滤，离子交换或纳滤技术方法来分离纯化水解产物，真空浓缩，干燥，制得产品甲壳低聚糖粉末。本产品可应用于制备具有调节免疫功能和调节血脂作用的功能性食品或保健食品。用本发明方法制备的甲壳低聚糖附加值大，技术含量高。本发明所用酶易从商业上得到，价格低廉，为甲壳低聚糖的生产开创了一条具有商业化价值的新途径，对有效利用甲壳素资源，促进甲壳素加工工业的发展有重要意义。
文档编号C08B37/08GK1425696SQ03112619
公开日2003年6月25日 申请日期2003年1月7日 优先权日2003年1月7日
发明者夏文水, 陈洁, 张家骊 申请人:江南大学