专利名称：一种用作生物传感器固定载体的复合导电高分子膜的制备方法
技术领域：
蛋白质的接枝改性，复合导电高分子膜的制备，生物传感器背景技术高分子一直被视为绝缘材料，直到1977年6月在纽约举行的低维物质合成和性质学术会上报告了“聚乙炔化学掺杂后，电导急剧增加，可以达到金属铋的导电性”后，引起了学术界和工业界的极大兴趣，聚合物导电性能的研究成了热门领域，并取得了较大的进展。瑞典皇家科学院宣布了2000年诺贝尔化学奖授予日本筑波大学的白川英树、美国宾夕法尼亚大学的艾伦.马克迪尔米德和美国加利福尼亚大学的艾伦.黑格尔，以表彰他们在导电聚合物这一新兴领域做出的开创性贡献。导电聚合物作为固定活性物质的载体应用到生物传感器方面也得到了科学工作者的关注。导电聚合物生物传感器主要是用导电聚合物作为载体或包覆材料固定生物活性成分(如酶、抗原、抗体、微生物等)，并以此作为敏感元件，再与适当的信号转换和检测装置结合而成的器件。用作生物传感器固定活性成分载体的导电高分子材料，它必须具备以下几个特点(1)具有良好的传导电子的能力；(2)能有效的防止活性成分的流失；(3)能很好的保持活性成分的活性；(4)能延长生物传感器的使用寿命；(5)与活性成分具有良好的生物相容性；(6)能降低生物传感器的造价而且容易加工。
常来用作生物传感器固定活性成分载体的导电聚合物有聚吡咯(PPY)、聚苯胺(PAN)、聚邻(或间)苯二胺(PDAN)。PPY在广泛的PH范围内具有较高的导电性，可以加快酶与材料之间的电子传递，也由于PPY本身带正电，在制备PPY膜时能将带负电的酶固定于膜中。但由于PPY具有较为疏松的结构使酶易于从膜中流失或失活，而且PPY本身因较易被过氧化生成导电性较低的化合物，所以其具有较低的稳定性，制成的电极的寿命较短，蛋白质在自然界中储藏量丰富，它的功能性质有(1)水化性质，包括水吸收及保留、湿润性、溶胀、粘着性、分散性、溶解度和粘度。由蛋白质肽链骨架上的极性基团与水分子发生水化作用；(2)与蛋白质—蛋白质相互作用有关的性质，包括沉淀作用、凝胶作用和形成各种其他结构(如蛋白质面团和纤维)。蛋白质分子受热舒展，内部的疏水基团暴露出来，通过疏水作用(高温能提供此类作用)、静电作用(通过Ca2+和其他二价离子桥接的)、氢键(冷却能提高此类作用)或二硫交联形成空间网状结构。蛋白质与用作生物传感器的活性物质(如酶、抗原、抗体、微生物等)有很好的生物相容性，对活性物质起到很好的保护作用，保持他们的生物活性。但纯天然的蛋白质容易变质，而且在水中容易溶胀，使其包埋的生物活性物质容易流失。所以可以对蛋白质进行改性或化学修饰，在其主链或侧链上连接上疏水性基团，克服其容易变质和容易溶胀的缺点，增加其与生物活性物质的相容性，防止活性物质的流失。蛋白质的改性方法分为物理改性、化学改性和酶法改性。
因此，如果把导电的聚吡咯(或吡咯衍生物)跟蛋白质(包含经过化学改性和化学修饰的蛋白质)做成复合的导电高分子膜，使其具有良好的电子传输能力和生物相容性，将会在生物传感器方面具有更大的应用前景。
发明内容
本发明的目的正对上述问题，提供了一种复合导电高分子膜的制备方法，并把这种复合导电高分子膜应用到生物传感器中。采用电聚合的方法来制备复合导电高分子膜，即采用吡咯(或吡咯衍生物)、蛋白质(经过化学改性或化学修饰的蛋白质)为原料，通过电聚合来获得导电高分子膜。
本发明的方法利用了聚吡咯(或吡咯衍生物)的良好的电子传输能力和蛋白质与生物活性物质具有良好的生物相容性的优点。通过电聚合可以把聚吡咯(或吡咯衍生物)和蛋白质形成均匀的导电膜，聚吡咯(或吡咯衍生物)与蛋白质发生了化学交联反应，使的聚吡咯(或吡咯衍生物)渗透到蛋白质的分子内部，形成了良好的导电网络，从而使的复合高分子膜不但具有了良好的导电性能，而且还有很好的生物相容性，二者之间的网状结构相互交叉，使整个的高分子膜更加致密，从而可以有效的保持了生物活性物质的的活性，也减少了它们在与溶液接触时的流失。而且，还可以先把吡咯(或吡咯衍生物)进行电聚合，再通过电吸附把蛋白质包埋在导电膜的表面形成夹心式的分层导电膜，也具有均匀复合导电膜的优良性能。将制得的复合导电高分子膜做生物传感器的固定活性物质的载体，都有效的提高了电极的响应时间，拓宽了电极的线性响应范围，延长了电极的寿命。
本发明提供了一种用作生物传感器固定载体的复合导电高分子膜的制备方法，其中复合导电高分子膜的制备方法为以蛋白质(经过化学改性或化学修饰的蛋白质)溶液、吡咯(或吡咯衍生物)，在pH＝5-8的缓冲溶液中，采用三电极体系(铂电极、碳电极或金电极为工作电极，Ag/AgCl或饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极)，进行电聚合反应。其中蛋白质的重量比例为5至85％，用来进行蛋白改性的有机小分子或生物大分子的重量比例为蛋白质的15至90％，吡咯(或吡咯衍生物)的重量比例为10至95％。制备导电高分子膜采用电聚合方法，其氧化电位为0.2至1.4V，氧化时间为5-90分钟，还原电位为-1.4至0V，还原时间为0-60分钟。
采用本发明的方法获得的复合导电高分子膜作为固定生物活性物质的载体来制备的生物传感器，其响应时间快，线性响应范围宽，使用寿命长，并具有优良的重现性和高选择性。
具体实施例方式
从以下说明性实施将进一步理解本发明。
采用蛋白质(经过化学改性或化学修饰的蛋白质)溶液、吡咯(或吡咯衍生物)，通过电聚合的方法来制备复合导电高分子膜，并用获得的复合导电高分子膜作为固定生物活性物质的载体来制备生物传感器。
实施例1原料配比为取浓度为0.2g/mL的用甲基丙烯酸甲酯改性的酪蛋白溶液5mL，加入到50mL含0.1mol/L吡咯，1mol/LKNO3，pH＝6.86的磷酸缓冲溶液，采用三电极体系(铂电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极)，控制电位为0.9V，氧化30min。将得到的复合电极用二次蒸馏水淋洗后移至pH＝6.86磷酸盐缓冲溶液中，在-0.3V的电位下还原20min，得到复合导电高分子膜为载体的复合电极。控制电压为0.7V，将该电极置于100u/mL的葡萄糖氧化酶溶液中电吸附10min，便得到葡萄糖氧化酶电极。用其来测试溶液中葡萄糖的含量，其响应时间仅为8s，线性响应范围为1.0×10-6～1.43×10-2mol/L，其检测极限为1.0×10-7mol/L，使用寿命超过一个月，并具有优良的重现性和高选择性。
实施例2原料配比为在100mL含0.1mol/L吡咯，1mol/LKNO3，pH＝6.86的磷酸缓冲溶液，采用三电极体系(铂电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极)，控制电位为0.7V，氧化40min，用二次蒸馏水淋洗后移至pH＝6.86磷酸盐缓冲溶液中，在-0.5V的电位下还原10min，再放入浓度为0.3g/mL的用甲基丙烯酸甲酯改性的酪蛋白溶液中，控制电位为0.9V，电吸附20min。便得到以复合导电高分子膜为载体的复合电极。控制电压为0.7V，将该电极置于100u/mL的葡萄糖氧化酶溶液中电吸附10min，便得到葡萄糖氧化酶电极。用其来测试溶液中葡萄糖的含量，其响应时间仅为12s，线性响应范围为1.5×10-6～2.43×10-2mol/L，使用寿命超过一个月，并具有优良的重现性和高选择性。
实施例3取浓度为0.1g/mL的胶原蛋白溶液20mL，加入到50mL含0.1mol/L吡咯，0.1mol/LNaClO4，pH＝6.86的磷酸缓冲溶液，采用三电极体系(铂电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极)，控制电位为0.9V，氧化15min，得到复合导电高分子膜为载体的复合电极。再将该电极放入0.03mg/mL的酪氨酸酶的pH＝6.6的磷酸缓冲溶液中在0.9V的电压下电吸附20min，便得到酪氨酸酶电极。对以甲苯酚为底物的溶液进行测量，其响应时间快，线性响应范围为3.5×10-8～2.0×10-5mol/L，具有很好的贮藏稳定性。
实施例4取浓度为0.1g/mL的用甲基丙烯酸甲酯改性的酪蛋白10mL，加入到20mL含0.15mol/L N-甲基吡咯，0.5mol/L KCl，2mg/mL L-氨基酸氧化酶的溶液中，采用三电极体系(铂电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极)，保持温度为0℃，电解液通氮气10min，恒定电位为0.95V，电聚合15min，便得到L-氨基酸氧化酶电极。对以L-苯丙氨酸为底物的溶液进行测量，其响应时间快，线性响应范围为1.2×10-5～6.3×10-4mol/L，并具有优良的重现性和高选择性。
实施例5取浓度为0.3g/mL的用甲基丙烯酸甲酯改性的酪蛋白溶液10mL，加入到40mL含0.2mol/L吡咯，0.5mol/L KCl的溶液中，采用三电极体系(碳电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极)，在0.7V的电位下电聚合20min，再在PH＝4.7的HAC-NAAC缓冲溶液中在电位为-0.5V下还原5min，便得到了复合导电高分子膜为载体的电极。然后将该电极放入PH＝5.3的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲溶液中，在0.6V的电位下富集30min，便得到了脲酶电极。对脲的溶液进行测量，其响应时间快，线性响应范围为4.2×10-5～1.3×10-2mol/L，并具有优良的重现性和高选择性。
权利要求
1.一种制备用作生物传感器固定载体的复合导电高分子材料的方法，其特征在于用蛋白质(或经化学修饰、改性过的蛋白质)溶液和吡咯(或吡咯的衍生物)通过电聚合来制备复合导电高分子膜并将该膜用作生物活性物质(如酶、抗原、抗体、微生物等)的固定载体来制备生物传感器。
2.根据权利要求1所描述的制备方法，其特征在于电聚合得到的复合导电高分子膜中蛋白质(或经化学修饰、改性过的蛋白质)和聚吡咯(或吡咯衍生物)形成均匀的导电膜，而且在二者之间形成了化学键。膜的颜色为淡黄至棕黑色。
3.根据权利要求1所描述的制备方法，其特征在于电聚合得到的复合导电高分子膜中蛋白质(或经化学修饰、变性过的蛋白质)和聚吡咯(或吡咯衍生物)形成分层的导电膜，而且在二者之间形成了化学键。膜的颜色为淡黄至棕褐色。
4.根据权利要求1所描述的制备方法，其特征在于该复合导电高分子膜的厚度在10-1000nm。
5.根据权利要求1所描述的制备方法，其特征在于制备导电高分子膜的合成原料吡咯的重量比例为10至95％，蛋白质(或经化学修饰、改性过的蛋白质)的重量比例为5至85％。
6.根据权利要求1所描述的制备方法，其特征在于制备导电高分子膜采用电聚合方法，其氧化电位为0.2V至1.4V，氧化时间为5-90分钟，还原电位为-1.4V至0V，还原时间为0-60分钟。
7.根据权利要求1所描述的制备方法，其特征在于通过电聚合来制备复合导电高分子膜的电极包括金属电极(如铂电极、金电极、银电极等)和非金属电极(如碳电极等)。
8.根据权利要求1所描述的蛋白质，其特征在于蛋白质可用有机小分子(如甲基丙烯酸甲酯、丙烯氰等)或生物大分子对其主链或侧链进行化学修饰、改性。
9.根据权利要求8所描述的制备方法，其特征在于蛋白质的重量比例为10至85％，用来进行蛋白改性的有机小分子或生物大分子的重量比例为15至90％。
全文摘要
复合导电高分子膜的制备方法为把蛋白质(也可以是经过化学改性或化学修饰的蛋白质)溶液和吡咯(或吡咯衍生物)按一定比例混合，并在适当的缓冲溶液中，采用三电极体系(铂电极、碳电极或金电极为工作电极，Ag/AgCl或饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极)，进行电聚合反应，在某一电位下氧化一段时间，再在某一电位下还原一段时间，便能得到均匀的复合导电高分子膜；或者将吡咯与缓冲溶液混合，采用三电极体系(铂电极、碳电极或金电极为工作电极，Ag/AgCl或饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极)，进行电聚合反应，在某一电位下氧化一段时间，再将其放入蛋白质(也可以是经过化学改性或化学修饰的蛋白质)溶液中，在某一电位下吸附一段时间，就可获得分层的复合导电高分子膜。采用本发明的方法获得的复合导电高分子膜作为固定生物活性物质(如酶、抗原、抗体、微生物等)的载体来制备的生物传感器，其响应时间快，线性响应范围宽，使用寿命长，并具有优良的重现性和高选择性。
文档编号C08J5/18GK1673257SQ20041002661
公开日2005年9月28日 申请日期2004年3月26日 优先权日2004年3月26日
发明者刘剑洪, 任祥忠, 张黔玲, 张培新, 顾宜, 罗仲宽 申请人:深圳大学