专利名称：聚烯亚胺凝胶的光化学合成方法
技术领域：
本发明涉及一种聚胺类化合物，特别是聚烯亚胺凝胶的光化学合成方法。
背景技术：
聚胺类高分子化合物，如包括聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)、聚丙烯亚胺(polypropyleneimine，PPI)等的聚烯亚胺(Polyalkylene imine)，以及聚异丙烯酰胺(poly N-isopropylacrylamide)等被广泛地用于基因转染载体及高分子凝聚剂、分散剂等领域。自1995年Boussif等(O.Boussif，F.Lezoualc’h，M.A.Zanta，M.D.Merbny，D.Scherman，B.Demeneix，J.P.Behr，Aversatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and invivopolyethyleneimine，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)7297-7301)首先报道了聚乙烯亚胺可作为非病毒载体后，PEI等阳离子聚烯亚胺类聚合物成为重要的真核细胞的基因转染载体，并成为研究最为广泛的非病毒型基因转染载体之一。大量的体内和体外的转染实验证实PEI具有显著的基因转染效率，在转导过程中能够更好地保护DNA不受其它酶类如DNase1和DNase2的攻击而降解。
目前国内外已有商品化的聚烯亚胺(PEI及PPI等)，其大多为凝胶水溶液，也可冷冻真空干燥成粉末，部分可用于基因转染。它们的光化学合成方法通常为传统的化学方法，如微乳液聚合(Xin Chen et al.，The synthesis andcharacterizations of monodisperse cross-linked polymer microspheres withcarboxyl on the surface，Polymer 43(15)(2003)4147-4152)、多步化学合成等。而这些合成方法有些步骤较多并繁杂、反应时间长；有些副反应多且不可控制，产率低；有些危险性较大(如国外常采用氮丙啶单体合成聚乙烯亚胺时)。如果利用PEI、PPI等聚烯亚胺预聚体合成更高分子量的聚烯亚胺凝胶，则由于其结构[结构式如下，R为(CH2)m，m为≥2的整数，常见的是2～5]中不含有双键或不稳定环，所以用常规的化学法很难引发其聚合。另外，在 这些常规的化学合成工艺中，通常需要一些具有生物毒性的有机溶剂作为反应溶剂，或添加一些化学引发剂和催化剂，如常用溶剂之一二氯甲烷(YoungHeui Kim，Jeong Hyun Park，et al.，Polyethylenimine with acid-labile linkages asa biodegradable gene carrier，Journal of Controlled Release(2004)(In press))；又如有些是从2-氨基乙醇为起始原料合成，产品中有毒的反应物难以除尽，且反应物产率很低(Anke von Harpe，et al.，Characterization of commerciallyavailable and synthesized polyethylenimines for gene delivery，Journal ofControlled Release(2000))。这不仅使产品的纯化工艺复杂，严重地污染环境，而且影响其作为载体在生物医药领域应用的安全性。
另一方面，由于同一类型载体的基因转染效果及安全性等方面可因其理化性质不同而有差异，如载体的分子量，分子量的分布，颗粒粒径大小及其分布等。载体纳米粒子在体内及体外的吸收对粒径大小具有依赖性，控制载体纳米凝胶的产品在一定的尺度具有窄粒径分布，有助于提高转染效率，提高产品的利用率、减少用量、减小细胞毒性。现有聚烯亚胺合成技术还不太完善，且所得聚烯亚胺的分子量及粒径大小不易控制，分布范围较宽，粒径大小十分不均匀，分散性差，如PEl分子量有0.6～25kDa不等，但分布范围较宽，其PCS(photon correlation spectroscopy，中文译名为光子相关光谱)结果提示为多峰分布，粒径分布较宽(如图1所示)。
发明内容
本发明的目的是解决上述问题，提供一种聚烯亚胺(凝胶)的光化学合成方法。
本发明的目的通过下列技术方案来实现一种聚烯亚胺凝胶的光化学合成方法，其将聚烯亚胺预聚物在碱性条件下，采用抽氢剂进行紫外光照合成反应。
其中，本发明所说的聚烯亚胺预聚物是指结构式如上所示的链状或树枝分叉状的不含有双键或不稳定环的现有聚烯亚胺产品，其中结构式中R为(CH2)m，m为≥2的整数，较佳的是2～5，由此根据本发明方法合成的聚烯亚胺纳米凝胶是指聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、聚丁烯亚胺或聚戊烯亚胺等，也可以根据需要选用上述两种或两种以上预聚物合成其共聚物。本发明重点研究可作为基因转染载体的聚乙烯亚胺或聚丙烯亚胺凝胶的合成，故n优选2或3，即选用聚乙烯亚胺或聚丙烯亚胺预聚物。
该聚烯亚胺预聚物分子量相对较低，通常不超过50kDa，目前作为载体的聚乙烯亚胺预聚物的分子量一般＜25kDa；本发明中聚烯亚胺预聚物通常选用其凝胶水溶液；该聚烯亚胺预聚物在反应体系中的重量浓度为0.05-16％，较佳为1-7％。
本发明在聚烯亚胺预聚物溶液中还可以加有成核剂，所说的成核剂是指能与聚烯亚胺上的N发生络合，具有可以控制粒度大小并提高聚烯亚胺分散性，从而得到大小更均匀且储存稳定性高的纳米凝胶的物质。已知化学领域中能与N络合的物质，如过渡金属盐等均可作为本发明成核剂，例如铁、铜、稀土元素等的金属盐；优选羧酸铁、氯化亚铁、氯化铜、氯化亚铜等。
加入的成核剂在反应体系中的浓度较佳地为0.07-20mg/ml，更佳为1.5-3.5mg/ml。
而所说的碱性条件是指pH≥7，较佳的是7.6～11，更佳的是8～10。
本发明中所说的抽氢剂是指在紫外光光照下产生羟基等自由基可以从一些有机物分子上抽取C、N或S等原子上连接的H原子，从而得到新的自由基而引发一系列的交联反应的一类分子。其可为现有紫外光合成反应中常用的各种光引发剂，如过氧化物等，本发明的抽氢剂优选过氧化氢，其在反应体系中的体积浓度为0.02-3％，较佳为0.05-1％，更佳的是0.1～0.5％。
基于如图3所示的本发明合成体系的紫外分光光度吸收光谱图，本发明选用的紫外光波长为200～260nm，本发明选择能高效产生其中253.7nm短波长紫外光的低压汞灯为辐照源，其较佳的光照强度为＞0、≤18mw/cm2，更佳的是3～18mw/cm2，光照时间一般不少于5分钟，最长不超过3小时；本发明为便于观察及控制反应条件，通常选用光照强度18mw/cm2，光照时间1小时左右。
同大多数高分子有机反应一样，本发明合成过程中采用搅拌，优选采用140转/分钟左右的机械搅拌，由于本发明中需搅拌物质流动性较好，所以根据常规采用越高的搅拌速度越好，一般为140～500转/分钟，为便于观察及控制反应条件，本发明采用140转/分钟左右的机械搅拌。
而本发明中所说的紫外光照合成反应，同现有紫外光合成反应一样，在除氧条件下进行，本发明采用最简易的氮气鼓泡法。
更佳地，尤其为得到更好的基因转染载体，本发明随后还包括纯化步骤即将上述光化学合成方法制得的聚烯亚胺纳米凝胶先用0.45μm针式滤器纯化，再用分子量为10000-12000的透析袋纯化去除未经反应的成分及其它杂质。当然，也可以根据不同产品要求，采用其它的过滤、萃取等提纯方法。
利用上述本发明光化学合成方法可制备粒径≥20nm的聚烯亚胺凝胶、通常为20-600nm，更佳为30-200nm的聚烯亚胺纳米凝胶。以聚乙烯亚胺为例，其PCS结果为单峰分布，粒径分布窄，粒径均匀并分散性较好，多分散系数(Poly.Index)通常为0.100-0.700；而且其核磁共振碳谱如图4所示，说明合成的PEI纳米凝胶中含有C＝N键(δ166.35，164.92)，红外波谱中m＝1651.92处的弱中峰也证明了C＝N键的存在，和反应前预聚体所含有的官能团不一样。
本发明采用短波长的紫外光引发较低分子量的聚烯亚胺预聚体产生自由基，进一步聚合得到高分子量的聚烯亚胺纳米凝胶。在聚烯亚胺预聚体中不含有双键或不稳定环，用常规的化学法很难引发其聚合，而本发明光化学合成法是利用抽氢剂在253.7nm波长下产生的羟基自由基抽取预聚体上的H原子从而使其发生交联反应，生成高分子量的分叉状PEI目标产物，另外还可使用成核剂与聚烯亚胺上的N发生络合得到大小更均匀的纳米凝胶。以PEI为例，其反应过程如图2所示。
本发明的积极进步效果在于第一、本发明光化学合成方法通过紫外光辐照引发不含双键和不稳定环的物质的聚合，不需要添加引发剂及表面活性剂；具体而言，其使抽氢剂在紫外光照射下分解产生羟基自由基，抽取PEI预聚体上的氢原子使预聚体发生交联，最终得到更高分子量的PEI纳米凝胶，而PEI预聚体本身在该波长下是很难发生光降解的。另外，反应在水溶液中进行，可以提高其体内试验的安全性；而紫外光可以使大肠菌、红痢菌、伤寒菌、葡萄球菌、结核菌、枯草菌、谷物霉菌等细菌和病毒死亡，保证了样品的医用质量。第二、本发明光化学合成方法工艺简单，反应时间快，一般仅需5分钟～1小时，所用试剂生物毒性小，有利于环保。第三、本发明光化学合成方法得到了接近球状的高分子纳米凝胶，并能重复制备要求粒径大小的纳米凝胶，控制光照的时间即可控制反应的时间；由此制得的PEI纳米凝胶基因载体粒径可控，粒径分布窄，表面呈分叉状，分散性好，稳定性好，从而降低了细胞毒性和免疫原性，提高了其作为载体在生物医药领域应用的安全性及转染效率。
图1为现有PEI预聚体的PCS检测结果。
图2为本发明采用PEI预聚体光化学合成反应过程示意图。
图3为本发明各种合成体系的紫外分光光度吸收光谱图；其中，A图为现有PEI预聚体凝胶水溶液；B图为PEI预聚体凝胶水溶液加入成核剂后的反应体系；C图为抽氢剂双氧水的反应体系。
图4为本发明聚乙烯亚胺纳米凝胶的核磁共振碳(C13)谱图。
图5为本发明实施例1中3个重复样品的PCS检测结果(A图为1号样品，B图为2号样品，C图为3号样品)。
图6为小剂量聚乙烯亚胺纳米凝胶对小鼠肝脏、肾脏和心脏超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响图表；图7为小剂量聚乙烯亚胺纳米凝胶对小鼠肝脏、肾脏和心脏丙二醛(MDA)含量的影响图表；在图6～7中，生理盐水(NS)作为阴性(空白)对照，PEI预聚体作为阳性对照，其中▲P＜0.05(vs NS)，*P＜0.05(vs PEI预聚体)，n＝6。
具体实施例方式
下面以聚乙烯亚胺的合成为例，用实施例来进一步说明本发明光化学合成方法的操作步骤及其效果，但本发明并不仅限于此。
其中，PEI预聚体(Polyethyleneimine)购自日本东京化成工业株式会社，原液是30％(w/w，重量百分比)水凝胶溶液；水为二蒸水；其余试剂为常规市售AR试剂。
用英国MARLVEN公司Zetasizer 3000HS型激光粒度散射仪，对本发明PEI纳米凝胶粒子的粒径进行PCS表征，测试时的温度为25℃，入射激光的波长为633nm，其偏振方向与散射检测光平面垂直。并使用Nanoscope IIIaAFM原子力显微镜(Digital Instruments，Santa Barbara，CA)和LEO1530VP型扫描电子显微镜(SEM)对纯化后的纳米粒子的形貌进行表征。
实施例1在50ml石英烧瓶中，加入下列各种组分组成反应体系，每种组分的浓度依次为PEI预聚物的浓度为1.15％(w/w)、羧酸铁作为成核剂的浓度为1.54mg/ml，加入极少量稀盐酸溶液(0.5M)调节pH值至9.5。控制搅拌速度为140转/分钟左右，通氮气除氧30分钟后，加入3％的双氧水(过氧化氢)，使其在反应液中的浓度为0.057％(v/v)。在连续通氮气(氮气流量80ml/min)的情况下，用紫外低压汞灯，以光照强度为18mw/cm2光照1h(小时)引发反应。控制如上所述的反应条件进行三次重复试验得到1号、2号、3号三个样品，对所得三次重复样品用0.45μm针式滤器(ANPEL产品)和分子量10000-12000道尔顿的透析袋(华美生物工程公司)纯化样品。
用上述激光粒度散射仪PCS法测量三个纳米凝胶样品的粒径各三次，结果示单峰分布，粒径分布窄(如图5所示)，所得平均值分别为1号，91.9nm；2号，79.4nm；3号，89.9nm，它们的多分散系数依次为0.303、0.6、0.439，平均粒径大小约为87nm。
对样品进行冷冻真空干燥后用扫描电子显微镜(SEM)和原子力显微镜(AFM)表征其形状为球形结构，整体分散性较好，局部有团聚现象。作为对照，将现有的上述PEI预聚体同样条件下进行PCS检测，结果如图1所示，多峰分布，粒径分布宽，大小十分不均匀，分散性差。
实施例2PEI预聚物浓度为4.8％(w/w)、氯化亚铁浓度为3.21mg/ml、加入极少量稀盐酸溶液调节溶液的pH值至10.0。加入3％的过氧化氢，使其在反应液中的浓度为0.12％(v/v)，余同实施例1。
将纯化后的聚乙烯亚胺纳米凝胶样品用激光粒度散射仪PCS法测量，为单峰分布(图未示)，该聚乙烯亚胺纳米凝胶的粒径平均值为172.9nm，多分散系数为0.355。在4℃条件下放置21天后再检测，其粒径的平均值为171.7nm，多分散系数为0.415。结果表明聚乙烯亚胺纳米凝胶样品在放置过程中基本保持稳定，粒径没有发生明显变化，具有一定的贮存稳定性。经真空干燥的聚乙烯亚胺纳米凝胶样品以扫描电子显微镜测试该样品的形状也同实施例1近于球形，分散性好。
实施例3PEI浓度为1.15％(w/w)、羧酸铁浓度为1.54mg/ml、加入稀盐酸溶液调节pH值至8.0。控制搅拌速度为140转/min左右，通氮气除氧30min后，加入3％的过氧化氢，使其在反应液中的浓度为0.11％(v/v)。在连续通入氮气(氮气流量80ml/min)的条件下，紫外光光照强度为18mw/cm2光照1h引发反应。控制如上所述的反应条件每隔一个月进行一次重复试验，得到4号、5号、6号三个样品，样品经0.45um针式滤器过滤和三次透析纯化后，经PCS测量三个纳米凝胶样品的粒径各三次，结果示单峰分布，粒径分布窄(图未示)，所得平均值分别为4号，136.5nm；5号，146.4nm；6号，150.4nm，它们的多分散系数依次为0.300、0.437和0.408。
实施例4每种组分的浓度依次为PEI浓度为6.3％(w/w)，不添加成核剂，加入极少量稀盐酸溶液(0.5M)调节pH值＝10.6，在通氮除氧30min后加入过氧化氢使其在反应液中的浓度为1.36％(v/v)，控制紫外光光照强度为18mw/cm2，光照反应时间为3小时，余同实施例1。纯化后用PCS测得结果示单峰分布，纳米凝胶的粒径为38nm。
实施例5PEI预聚物浓度为6％(w/w)、成核剂羧酸铁的浓度为0.1mg/ml、调节溶液的pH值至10.0，余同实施例1，用PCS测得结果示单峰分布，所得纳米凝胶的粒径为341nm。
实施例6PEI浓度为16％(w/w)，成核剂浓度为20mg/ml，调节pH值＝9.5，双氧水在反应液中的浓度为2.8％(v/v)，余同实施例1。纯化后，用PCS测得结果示单峰分布，纳米凝胶的粒径为106nm。
实施例7PEI浓度为3.7％(w/w)，成核剂氯化铜浓度为0.7mg/ml，调节pH值＝10.6，双氧水在反应液中的浓度为0.05％(v/v)，余同实施例1。纯化后用PCS测得结果示单峰分布，纳米凝胶的粒径为590nm。
实施例8PEI浓度为4.8％(w/w)，成核剂浓度为3.2mg/ml，调节pH值＝10.6，加入过氧化钠，使其在反应液中的浓度为0.13％(v/v)，控制紫外光光照强度为3mw/cm2，光照0.5小时，余同实施例1。纯化后，用PCS测得结果示单峰分布，纳米凝胶的粒径为200nm。
实施例9PEI预聚物浓度为0.05％(w/w)、成核剂浓度为0.56mg/ml、调节溶液的pH值至8，加入3％的过氧化氢，使其在反应液中的浓度为0.02％(v/v)，紫外光光照强度为18mw/cm2，光照5分钟引发反应，余同实施例1。纯化后的聚乙烯亚胺纳米凝胶用PCS测得结果为单峰分布，其粒径平均值为256nm。
实施例10PEI预聚物浓度为3.7％(w/w)、成核剂氯化亚铁浓度为0.07mg/ml、调节溶液的pH值至7.6，加入3％的过氧化氢，使其在反应液中的浓度为0.037％(v/v)，紫外光光照强度为18mw/cm2，光照0.5小时引发反应，余同实施例1。纯化后的聚乙烯亚胺纳米凝胶用PCS测得结果示单峰分布，其粒径平均值为325nm。
应用实施例1 PEI纳米凝胶作为肿瘤治疗基因转导载体的安全性在徐州医学院的协作下，我们对本发明制备得到的高分子量PEI纳米凝胶作为肿瘤治疗基因转导载体的安全性进行了验证。
给小鼠按5mg/kg体重的剂量，1次/天，连续3天注射实施例1～4制备得到的各种粒径的PEI纳米凝胶，同剂量的生理盐水(NS)作为阴性(空白)对照，PEI预聚体作为阳性对照，采用SPSS12.0统计软件LSD方法对各组数据进行方差分析及差异作统计学比较，结果如图6、7所示，提示本发明各种粒径的PEI纳米凝胶对小鼠肝脏、肾脏和心脏超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)含量无显著影响，但PEI预聚体降低了小鼠肝脏、肾脏和心脏SOD活力，并显著提高MDA含量，这说明预聚体对小鼠重要脏器有氧化性损伤。以上实验结果证实本发明的光化学合成方法制得的PEI纳米凝胶比现有PEI产品的细胞毒性更低，作为载体在生物医药领域应用的安全性更高。
权利要求
1.一种聚烯亚胺的光化学合成方法，其将聚烯亚胺预聚物在碱性条件下，采用抽氢剂进行紫外光照合成反应。
2.根据权利要求1所述的光化学合成方法，其特征在于该聚烯亚胺预聚物是指聚乙烯亚胺或聚丙烯亚胺。
3.根据权利要求1所述的光化学合成方法，其特征在于该聚烯亚胺预聚物在反应体系中的重量百分比为0.05-16％。
4.根据权利要求1所述的光化学合成方法，其特征在于该聚烯亚胺预聚物中还加入成核剂，其在反应体系中的浓度为0.07-20mg/ml。
5.根据权利要求4所述的光化学合成方法，其特征在于该成核剂为过渡金属盐。
6.根据权利要求5所述的光化学合成方法，其特征在于该过渡金属盐选自氯化亚铁、羧酸铁和氯化铜中的一种或几种，其在反应体系中的浓度为1.5-3.5mg/ml。
7.根据权利要求1所述的光化学合成方法，其特征在于该碱性环境是指pH7.6～11，该抽氢剂为过氧化物，该紫外光波长为200～260nm。
8.根据权利要求7所述的光化学合成方法，其特征在于该过氧化物为过氧化氢，其在反应体系中的体积浓度为0.02-3％。
9.根据权利要求7所述的光化学合成方法，其特征在于该紫外光波长为253.7nm，其光照强度为＞0、≤18mw/cm2，光照时间为5分钟至3小时。
10.根据权利要求1～9任一项所述的光化学合成方法，其特征在于其随后还包括纯化步骤将权利要求1～9制得的聚烯亚胺先用0.45μm针式滤器纯化，再用截留分子量10000-12000道尔顿的透析袋纯化。
全文摘要
本发明公开了一种聚胺类化合物，特别是聚烯亚胺，包括聚乙烯亚胺或聚丙烯亚胺等凝胶的光化学合成方法，其将聚烯亚胺预聚物在碱性条件下，采用抽氢剂进行紫外光照合成反应。本发明光化学合成方法工艺简单，反应时间快，所用试剂生物毒性小，有利于环保，而且可按需控制反应起始及结束；从而本发明光化学合成方法可制得聚烯亚胺的纳米凝胶，其颗粒粒径可控，粒径分布窄，比较均匀，由此降低了细胞毒性和免疫原性，提高了其可作为载体在生物医药领域应用的安全性及转染效率。
文档编号C08J3/28GK1743359SQ20051002647
公开日2006年3月8日 申请日期2005年6月3日 优先权日2005年6月3日
发明者姚思德, 徐冬梅, 刘永彪, 乔向利, 余家会, 孙汉文, 盛康龙 申请人:中国科学院上海应用物理研究所