羟基苯交联大分子网络及其应用的制作方法

文档序号:3692536阅读:610来源:国知局
专利名称:羟基苯交联大分子网络及其应用的制作方法
本专利申请主张2004年7月9日提交的美国临时专利申请号60/586,585的优先权,该临时专利申请的全部内容在此并入作为本申请的一部分。
背景技术
关节软骨在健康的关节中行使基本功能。关节软骨吸收和分散冲击和摩擦载荷从而将这些载荷从骨骼上转移,保护骨骼免受伤害。软骨通过将载荷力转移至受限于关节间隙内的聚蛋白多糖分子(在下一节中有所描述)三维网络内的流体相实现该功能。聚蛋白多糖分子含有与核心蛋白相连的多达100条的硫酸软骨素(CS)链,在每条硫酸软骨素链全长上分布着多个电负性的硫酸根基团。这些硫酸根基团引起了单个聚蛋白多糖分子上的各条硫酸软骨素链之间的相互排斥(造成静态聚蛋白多糖分子占有最大的空间体积),并导致软骨聚集体中相邻的聚蛋白多糖分子互相排斥。
在健康软骨中,聚蛋白多糖分子与透明质酸长链相连,而透明质酸链被胞外胶原纤维基质限制于关节间隙内的大型软骨聚集体中。因此,即使每个聚蛋白多糖分子(和与相同或不同的透明质酸链相连的相邻聚蛋白多糖分子)中相邻的硫酸软骨素链之间相互排斥,它们仍然被限制在胶原基质中。图1描述了正常、健康的软骨。由于硫酸软骨素链之间如此排斥,透明质酸-聚蛋白多糖网络(或大分子网络)在胶原基质的限制下会尽可能大的延展从而在静态获得尽可能低的能量态,即使得相邻的电负性的硫酸根基团间的距离尽可能最大化。由此,网络分子为了避免和相邻的网络分子靠近而很难发生移动或替代。这些大型软骨聚集体被限制在体积为其自由溶液体积五分之一的胶原纤维网络中,无法继续膨胀。具有很高的负电荷密度的软骨聚集体与大量溶剂结合从而赋予软骨吸收载荷和抵抗变形的能力。在压缩下,固定在聚蛋白多糖上的负电荷基团之间的距离缩小,从而增加了电荷-电荷之间的排斥力以及自由浮动的平衡阳离子的浓度(如Ca2+和Na+)。这些效应均对软骨的粘弹性和软骨抵抗变形及吸收压缩载荷的能力有所帮助,以下将进一步加以说明。
水分子在大分子网络中提供了充分连续的流体相。如下所述,大分子网络通过将冲击和摩擦载荷转移至连续的流体(水)相将它们从骨骼上转移。当关节承受载荷时,大分子网络首先将力吸收,该力作用于网络欲使其变形或将其压缩。力在流体相中形成压力梯度从而诱导流体流动以适应由载荷造成的网络的变形或压缩。但是流体无法改变坚实的大分子网络,网络填满了相互排斥的硫酸软骨素链,足以在不移动或替代网络分子的情况下容纳大量的水。因此,虽然每个水分子可以在网络中扩散,但由于网络分子不会发生替代,因此除非流速大幅减慢,否则大量的流体相将基本被限制于网络中而无法通过。尽管存在压力梯度,但是由于水分子无法顺利流动,冲击或摩擦载荷的能量转移至流体相并被其吸收,其中该能量压缩液体水直至水发生充分的转移以适应网络形状且压力梯度发生衰减。总体效果即软骨吸收潜在有害载荷,并将其从骨骼上转移。
通过该完善的机制,正常的关节能够通过将大量的载荷力转移至受限于大分子网络内的流体相而吸收大量的载荷。在现有技术中,该过程还没有被人工或合成方法充分地重现。因此,对于软骨退行性疾病还无法进行充分的治疗,如关节炎,其中聚蛋白多糖分子从它们的透明质酸链上脱离,被消化或运出软骨聚集体。
据估计,骨性关节炎和风湿性关节炎分别影响着20.7和2.1百万美国人。仅骨性关节炎每年就造成大约7百万次的医生探访。对于严重的致残性关节炎,目前的治疗包括全关节置换手术,仅美国每年就平均进行168,000桩全髋关节置换和267,000桩全膝关节置换手术。由于软骨细胞在修复软骨中的有限能力,关节软骨的缺陷带来了复杂的治疗问题。迄今为止的治疗策略将重点放在对细胞培养中的自体软骨细胞的应用或在体内通过趋化试剂或促有丝分裂试剂对间质干细胞的募集上。这些策略的目的在于增加和/或活化软骨细胞群落从而重新合成正常的、健康的关节软骨表面。这些策略的一个主要问题是无法将这些试剂保留在缺陷位点。由于透明质酸特有的性质,包括极佳的生物相容性、可降解性和流变学及理化性质,有提议将透明质酸用作发展软骨细胞或生物活性试剂局部给药的生物材料的候选材料。然而,悬浮于组织工程透明质酸基质中的软骨细胞能否合成机械性质与正常健康的关节软骨相当的新软骨基质仍然是未知的。这是因为由透明质酸制成传统生物材料的化学制备方法与保持细胞存活力不相容。软骨细胞必须在基质形成后才能被引入基质,结果不稳定且通常很差。
因此,本领域需要一种能够以有效的方式将载荷力从骨骼上有效转移的人工或合成基质。优选地,此基质在整形外科手术过程中可以在原位点或在体内修复或置换关节软骨。更优地,人工或合成基质以一种液体或多种液体的形式提供在原位点或体内靶点,在位点与病人体内已经存在的软骨或骨骼组织形成基本密实的整合。
本发明也希望提供一种能够用于或适用于合成多种替代组织的人工或合成基质。

发明内容
发明综述本发明提供的大分子网络包含以下结构 其中R1和R2分别是或者包含选自聚羧酸酯、聚胺、聚羟基苯分子以及它们的共聚体的结构,其中R1和R2的结构可以相同也可以不同。
本发明提供了多种合成、可移植的、包括或由上述组织基质材料组成的组织材料,该组织材料包括合成的、可移植的软骨材料,合成的、可移植的声带材料,合成的、可移植的玻璃体材料,合成的、可移植的软组织材料,以及合成的、可移植的二尖瓣(mitral valve)材料。


图1是正常健康的人体软骨的示意图。
图2是本发明的二羟基苯交联大分子网络的示意图。
图3是透明质酸分子的结构式。
图4a-4c显示的是根据本发明的T-HA(图4a)、T-Aggrecan(聚蛋白多糖)(图4b)和50%T-HA/50%T-Aggrecan混合物(图4c)的水凝胶在封闭抗压测试机械测试中(平衡应力对施加张力)的结果与已公开的关节软骨栓的结果(实施例3)的比较图表。图4d中显示了糖胺聚糖(GAG)浓度与材料抗压强度之间的关系。
图5是埋于T-HA水凝胶中(1.7%和4.7%T-HA)的软骨细胞与在组织培养塑胶上培养的软骨细胞(对照)关于葡萄糖利用的比较数据的图表。
图6是根据本发明实施例6的四张系列图片,图片显示的是在关节软骨缺损中植入T-HA水凝胶的外科手术过程。
图7是T-HA水凝胶移植到实施例6中所述的Yucatan猪的中间滑车面(medial trochlar facet)以及对侧(关节)膝盖面中1个月后的两张系列图片。
图8的系列图片显示的是对照侧(未填充)和试验侧(填充了TB-HA水凝胶)的犬声带的组织学结果,3个月后,使用实施例7所述的T-HA水凝胶作成的合成声带材料进行声带修复工艺。
图9的系列图片显示的是使用实施例7所述的T-HA水凝胶作成的合成声带材料在兔子模型中的外科手术增加声带的组织学结果。
图10显示的是手术一个月后试验眼睛(外科手术替换的)和对照眼睛(未手术的)的系列图片,接着用实施例8所述的用T-HA水凝胶作成的合成陶瓷材料进行陶瓷替换工艺。
图11显示的是记录实施例8中所述的兔子模型中对照眼睛和陶瓷替换的眼睛对闪光反应的比较网膜电图结果(ERG)。
图12显示的是手术一个月后试验眼睛(外科手术替换的)和对照眼睛(未手术的)四个象限中的视网膜的电子显微图片,接着用实施例8所述的用T-HA水凝胶作成的合成陶瓷材料进行陶瓷替换工艺。
图13显示的是实施例9所述的手术一个月后将100mg/ml的T-HA水凝胶塞皮下移植到免疫竞争力鼠中的代表性组织学结果的系列图片。
图14显示的图片是实施例10所述的、二尖瓣修复所用的用于说明T-HA水凝胶材料的死犬心脏的图片。
具体实施例方式
在此所用的术语聚羧酸酯指链长含有至少两个功能基团或单位的分子、结构或类,其链中的至少两个这样的基团或单位是或者包含羧酸基团,在所述的亲核取代反应中,该羧酸基团在空间上是可以接近的。同样在此所用的术语聚胺指链长含有至少两个功能基团或单位的分子、结构或类,其链中的至少两个这样的基团或单位是或包含可用于亲核取代反应的一级胺基团。同样在此所用的聚羟基苯分子指链长含有至少两个功能基团或单位的分子,其链中的至少两个这样的基团或单位是或包含羟基苯基团,它们能通过C-C键与另一个羟基苯基团相连。同样用于此的水凝胶是制备的一种含有大分子网络的材料,大分子网络用于组织置换或工程应用,例如作为人工软骨、作为手术器材的包被材料以防止组织发炎、或作为人工肾的半透膜等。
本发明包括大分子网络的一种新颖的结构,大分子网络通过相邻长链大分子上的羟基苯基团之间的连接形成,这些连接使得大分子之间形成有效的交联从而生成一个巨大的网络。网络的基本交联结构如下所示 其中R1和R2分别是长链大分子。R1和R2可以是相同的或不同的分子,但将了解到为了生成合适的网络,本发明的网络中至少有部分二羟基苯键中的R1和R2是不同的分子。R1和R2不必需但却优选地是同类分子。
通过相邻大分子之间形成的大量二羟基苯键,生成了如图2中所示的二羟基苯交联大分子网络。在图中,大分子用圆柱形带表示,每个大分子含有至少两个与其相连的羟基苯基团。需要注意的是并不是每个羟基苯基团都必须与另一个羟基苯基团相连。
简要地,所记载的发明包括含有羟基苯的化合物经过碳化二亚胺介导的反应通过它们的一级胺(或羧基)基团共价连接到各种聚合支架材料上的羧基(或一级胺)基团上,所述化合物包括但不限于酪胺,所述聚合支架材料包括但不限于透明质酸或硫酸软骨素(例如以聚蛋白多糖的形式)。在分离和纯化羟基取代聚合支架后,在极稀的过氧化氢的存在下,山葵过氧化物酶(HRP)使得羟基苯残基选择性地发生交联生成水凝胶。明显的,此处所述的水凝胶可以用作完全移植的、非免疫原的合成组织基质材料,如下所述,这些材料可以多种目的移植到体内。此处使用的“可移植的”指的是通过外科切口进行水凝胶的外科移植和通过如用注射器在体内注射水凝胶。无论是外科移植或注射,可移植的水凝胶可以在体内进行交联或下文所述的在体内移植的原位进行交联。
制备大分子网络的第一步是制备或提供周期性地带有羟基苯基团的长链大分子。在一个具体实施方案中,大分子为带有多个或周期性带有羟基苯基团的聚羟基苯分子,如多酚。合适的多酚包括聚氨基酸(例如聚酪氨酸)、表没食子儿茶酚(EGC)和从绿茶中分离出的表没食子儿茶酚没食子酸(EGCG)、其他次优的多酚。
在进一步的具体实施方案中,通过化学反应可将羟基苯基团周期性地或随机地添加到大分子的长链上。将羟基苯基团添加到大分子上的一个优选方法是利用碳二亚胺介导的取代反应途径在带有一个羟基苯基团的一级胺和大分子上的羧酸基团之间形成酰胺键。在此方法中,优选的长链大分子是周期性带有羧酸基团的聚羧酸酯分子。羟基苯基团是带有一级胺基团的小分子中的一部分,通过碳二亚胺途径可以连接到长链大分子的羧酸基团中的羧基碳原子上。反应进行如下
其中结构A是碳二亚胺;结构B是聚羧酸酯(虽然仅标明了一个CO2H基团);结构C是反应A的产物,活化的O-酰基异脲;结构D是含有羟基苯基团的一级胺;结构E是羟基苯取代聚羧酸酯;结构F是酰基脲副产物;其中各个R可以分别选择,彼此相同或不同,可以是直链或支链烷基或酰基基团,或其他任何结构,只要这些结构不会干扰碳二亚胺反应途径在NH2和CO2H之间生成上述结构E中的酰胺键即可。
在以上示意的途径中,反应A代表了碳二亚胺对羧基基团的活化进而生成活化的O-酰基异脲中间体。该中间体中正电性的碳原子可以接受相邻的带有羟基苯基团的一级胺分子中氮原子的孤对电子的亲核攻击。该亲核取代反应(反应B)的产物是羟基苯取代聚羧酸酯和酰基脲副产物,酰基脲可以通过透析去除从而得到足够纯的羟基苯取代聚羧酸酯产物。
上述碳二亚胺反应途径中可能发生特定的副反应,该领域的普通技术人员应该对此加以考虑。首先,碳二亚胺可与其它亲核试剂反应,而不是与生成理想的O-酰基异脲所必需的聚羧酸酯分子的羧酸氧原子发生反应(反应A)。其它的亲核试剂可以包括上述结构D中的胺和/或羟基苯基团。特别地,反应A会发生3种可能的副反应从而降低碳二亚胺和带有羟基苯基团的一级胺的有效浓度(结构A和D),并且可能导致在聚羧酸酯(结构B)上生成非理想的加合物反应C 反应D 反应E 胺和碳二亚胺的反应产物(反应C)没有自由胺基,因此有效地减少了可以和O-酰基异脲发生反应的酪胺的量。该反应还减少了可以生成理想的O-酰基异脲的碳二亚胺的量。羟基苯反应产物(反应D)没有UV吸收,这使得在最终的羟基苯取代聚羧酸酯产物(解释见下)中用UV光谱对它们进行观察变得更加困难。但是,由于这些产物仍然带有自由胺基,它们可以通过反应B和聚羧酸酯分子生成酰胺键。反应可生成两种无效的透明质酸取代结构,由于缺乏生成自由基(解释见下)所需的可提取的酚羟基氢原子,两个结构均无法参与到制备本发明交联网络的第二步过氧化物酶交联反应中(说明见下)。最终,碳二亚胺会与水发生无效的反应(反应E)生成与上述反应B副产物相同的酰基脲,但是没有理想产物,结构E的生成。
一旦在反应A中生成理想的O-酰基异脲产物,又可能发生某些额外的副反应反应F 反应G 反应H O-酰基异脲(结构C)可以如反应F所示发生水解,释放出原始的未修饰的聚羧酸酯(结构B)和碳二亚胺的酰基脲(结构F)。该反应是和反应E相似的无效反应,降低了碳二亚胺的有效浓度。O-酰基异脲还可以通过分子内重排(反应G)生成两种化学惰性的N-酰基脲。这些结构在羧酸酯分子上生成无效的加合物,无法用于本发明网络制备中的过氧化物酶催化交联反应(以下讨论的步骤2)。O-酰基异脲也可以和相同或不同聚羧酸酯分子上的第二个羧基基团发生反应(反应H)生成酸酐。该分子随后可与结构D发生反应形成理想的酰胺并重新获得第二个羧基基团。因此对于O-酰基异脲存在两个可能的副反应,这些副反应能降低碳二亚胺的有效浓度(反应F和G)并可能导致在聚羧酸酯分子上生成非理想的加合物。
这些副反应的负面效应并非由于不当的实验方法,而是通过常规操作就会发生。
上述途径中的大分子为聚羧酸酯(结构B),在另一种可选择的途径中,大分子可以是带有多个或周期性带有胺基基团的聚胺,其中羟基苯基团作为羧酸小分子的一部分。合适的聚胺包括聚己糖胺如壳聚糖(聚葡萄糖胺);聚氨基酸如聚赖氨酸;聚脱氧核糖核酸如聚(dA)(聚脱氧腺苷酸)、聚(dC)(聚脱氧胞苷酸)、聚(dG)(聚脱氧鸟苷酸);以及聚核糖核酸如聚(A)(聚腺苷酸)、聚(C)(聚胞苷酸)和聚(G)(聚鸟苷酸)。碳二亚胺介导反应途径完全按照以上所解释的反应途径进行,从而在胺基基团和羧酸基团之间形成酰胺键,唯一的不同是生成的产物是羟基苯取代聚胺而不是聚羧酸酯,这是本领域普通技术人员能够理解的。其他肽和/或蛋白质也可以用作本发明中的大分子,只要其带有羟基苯基团,或通过在此说明的取代反应可以获得羟基苯取代基团即可。例如,除了本发明已记载的肽,聚精氨酸可以被用作大分子。
当聚羧酸酯分子上发生取代时,用于本发明的合适的含有羟基苯的化合物包括带有自由一级胺的化合物,一级胺能够用于修饰带有多个或周期性带有CO2H基团的支架材料,包括酪氨酸(2-氨基-3-(4-羟基苯)丙酸)和酪胺(酪胺或2-(4-羟基苯)乙胺)。当聚胺上发生取代时,合适的含有羟基苯的化合物包括带有自由CO2H基团的化合物,CO2H基团可以用于修饰带有多个或周期性带有一级NH2基团的支架材料,包括酪氨酸、3-(4-羟基苯)丙酸和4-羟基苯乙酸。
根据本发明制备交联大分子网络的第二步是通过二羟基苯连接结构将获得的已经带有一个或多个羟基苯基团的大分子连接。在这一步中,不同的大分子上的羟基苯基团通过以下的反应机理在过氧化物酶的存在下利用过氧化物试剂发生连接
(应当注意的是一些二羟基苯连接也可以在同一分子的不同羟基苯基团之间形成。)在稀释的过氧化物(优选H2O2)存在下过氧化物酶可以从带有羟基苯的化合物中(如酪胺)提取酚羟基的氢原子,留给酚羟基氧原子一个孤电子,成为极端活跃的自由基。该自由基将两个等价邻位碳原子中的一个异构化,随后两个这样的结构发生二聚化形成共价键将结构有效地交联,交联结构经过烯醇化生成二羟基苯二聚体(以下说明的二羟基苯键如二酪胺键)。
简明起见,以上只显示了单个的二羟基苯连接反应,但是应该明白当把带有羟基苯基团的大分子置于反应条件下时(过氧化物和过氧化物酶)将会生成数个或多重这样的键。上述机制中使用了过氧化氢,但也可以使用其他合适的过氧化物。同样地,过氧化物酶优选山葵过氧化物酶(HRP)。可选地,能够生成自由基使带有羟基苯基团的支架材料发生交联的其它任何合适的酶(或其它试剂)均可以使用,在下述的普通代谢条件下发生作用的为优选。
我们已经说明了山葵过氧化物酶(II型)和过氧化氢(H2O2)的反应适合交联大分子网络的生产。反应机理包括下述明显的四步(a)将过氧化物和过氧化酶的血红素Fe(III)络合物结合,形成不稳定的过氧化物络合物,“化合物I”;(b)氧化铁,在血红素普菲林环(porphyrinring)上生成具有多阳离子基的高铁离子物质(ferryl species),“化合物II”;(c)用一种底物(如羟基苯或水)分子还原化合物II,得到产物(如羟基苯或过氧化物)基和另一种高铁离子物质,“化合物III”;(d)用另一种底物(如羟基苯或水)分子还原化合物III,得到另一种产物(如羟基苯或过氧化物)基,并再生出天然酶。因而,过氧化物酶可以形成交联所需的羟基苯基,其中交联通过酶活性位的羟基苯基团之间的反应,直接形成所需的基,或者通过第一代过氧化酶基从酶中扩散,然后和羟基苯基团反应形成所需的基。其它潜在的具有产生同样效果的化合物包括含有化合物的卟啉(如Photofrin),其中的化合物包括过氧化酶、血红素蛋白或结构相关的氯化合物。
其它许多自由基启动子可以用于此处所述的羟基苯改型大分子的交联。这些自由基包括大多数但不限于下述的反应氧化物(ROS),如过氧化氢分子、次氯酸盐离子、自由基如羟基自由基与离子或自由基形式的过氧化物阳离子。其它起反应作用的分子如氮或硫,或其它合成聚合反应的自由基,也可以用于羟基苯的交联。
ROS通过酶和底物通常可以自然生成。其它可以用于交联工艺的酶化物系统,通常是过氧化物自由基的产物,包括但不限于黄嘌呤-黄嘌呤和NADPH-NADPH氧化酶。
另一种可用的ROS自由基启动子的种类包括金属阳离子的使用。其中的一个实施例以Fenton反应为基础,该反应在过氧化氢和2价阳离子如Fe2+之间进行。催化剂催化的情况下过氧化氢产生活泼的自由基。和Fenton反应相关的反应机理如下所示H2O2+Fe2+=>OH·+OH-+Fe3+其中,Fe2+=亚铁离子,Fe3+=铁离子,OH·=羟基自由基除了上述产生羟基自由基的引发反应外,Fenton反应也可以通过其它的链增长反应生成过氧化物自由基和过氧化氢阴离子。和过氧化物自由基和过氧化氢阴离子相比,过羟自由基是比较弱的还原剂。
H2O2+OH·=>HO2·+H2OHO2·=>H++O2·-HO2·+O2·-=>HO2-+O2其中,O2·-=过氧自由基阴离子,HO2-=过氧化氢阴离子,HO2·=过羟自由基。
我们已经在实验室用硫酸亚铁和过氧化氢验证了该反应交联酪胺取代的透明质酸的能力。不限于这些的化合物如二价的铜离子、铬离子、钒离子和钴离子可以类似的方式进行使用。值得注意的是,当羟基自由基用于形成二酪胺交联时,它也科研切开HA链,从而最终不适合水凝胶的形成。
其它可以产生ROS的分子或方法包括·铷或铯离子在有氧存在下形成过氧化物自由基。
·三价阳离子和过氧化氢形成自由基和两价阳离子,如下所述,接着可以进行Fenton反应H2O2+Fe3+=Fe2++·OOH+H+·细胞毒素和抗癌抗菌素治疗Photofrin,当用波长为630nm的激光照射时,引起了产生过氧化物和羟基自由基的自由基生成反应的增长。在没有光但有过氧化氢时,Photofrin中的普菲林环由于上述的过氧化酶而需要进行相同的反应。
·UV光和过氧化氢形成羟基和过氧化物自由基。
·过氧硫化物和TEMED结合。
如上所述,产生自由基的替代方法使用Photofrin作为替代的、非酶化的、光激活的交联试剂对此次所述的大分子网络进行交联,如酪胺取代的透明质酸(tryamine-substituted hyaluronan)形成酪胺交联的透明质酸水凝胶。本领域公知的Photofrin,产生的自由基可以引发此处所述的交联反应,方式和上述的过氧化酶-H2O2机理类似。Photofrin是Wyeth-Ayerst Lederle Parenterals,Inc.生产的一种粉状或块状的卟吩姆钠(porfimer sodium)。
相对于原位交联工艺,由于交联反应是酶驱动的(过氧化物酶),二羟基苯交联大分子网络优于传统的软骨或其它组织置换或取代方法和产品。酶驱动意味着交联反应在普通的体内或代谢条件下进行,温度为35℃-39℃(例如37℃)、pH范围为6-7(例如6.5),反应试剂等等。(过氧化物,如过氧化氢,是交联反应中唯一需要的反应试剂)。因此,交联反应可以在体内进行,在手术位点如整形外科手术位点提供交联的水凝胶,从而促成水凝胶和天然组织如骨骼和软骨组织之间最大程度的密实整合。由于羟基苯取代大分子支架在交联之前迅速地渗透入已经存在的软骨基质中,不仅与其它的羟基苯取代大分子支架材料发生交联,还可能与已存在于软骨基质中的蛋白的酪氨酸残基发生交联,因此新的水凝胶支架和天然软骨基质的整合可以迅速发生。这样就可以消除在使用预先制成的基质栓时发现的典型问题,即它们很难整合进天然的软骨组织。能够将水凝胶直接交联在关节表面就不再需要在手术中将伤口扩大以适应预先制好的栓,对于那些化学反应对病人有毒或否则就无法在病人体内形成的水凝胶必须事先制栓。应当注意的是由关节炎引起的大部分软骨损伤表现为关节表面不同程度的变薄而不是具有一定形状的洞。
由于交联反应需要过氧化物和过氧化物酶(优选山葵过氧化物酶),为了方便地应用于手术位点,可以制备含有所有组分而唯缺一种组分的溶液。例如,可以制备含有酪胺(或其它含有羟基苯的种类)取代聚羧酸酯(如酪胺取代透明质酸等)和过氧化物酶的溶液,并制备含有过氧化物的第二溶液。可选地,第一和第二溶液中的过氧化物和过氧化物酶可以交换,重要的是在交联反应发生之前过氧化物和过氧化物酶分开保存(即在分开的溶液中)。随后,使用第一溶液,(例如在体内手术位点),并将第二溶液在体内使用或喷洒在第一溶液上,在原位点形成酪胺残基的交联。交联反应在体内发生。根据本发明的记载,其它的组合对于本领域的普通技术人员将是显而易见的。
此外,由于交联反应在普通代谢条件下发生,因此可以将额外的活细胞,如软骨细胞、祖细胞、干细胞等,直接加入含有未交联的羟基苯取代聚羧酸酯或聚胺(或多酚)的培养基中,即前一节中的第一或第二溶液,其中将富含细胞的培养基和大分子一起应用于体内位点,分子随后在加入过氧化物酶和过氧化物后发生交联。于是交联后的大分子网络中分散了理想的细胞。由于制备传统基质时极端的温度和pH条件,这种富含细胞的网络不可能在传统组织置换基质中形成。此外,如以下实施例5中所描述,已经证实上述发明基质中的细胞在根据本发明发生酪胺取代透明质酸交联(描述见下)生成网络后仍然存活。
在特别适用于制备合成软骨及其它合成或人工组织的优选实施方案中,根据本发明用于生成网络的大分子是透明质酸(HA),且羟基苯基团以酪胺的形式提供。透明质酸(HA)是一种常见分子,主要集中在特殊的组织如软骨、声带、玻璃体、滑液、脐带和真皮中。在这些组织中,其功能是多方面的,如影响组织的粘度、振动吸收、伤口愈合和空间填充。已经表明HA影响含有HA的自然组织的胞外(ECM)中的许多过程,包括基质集中(matrix assembly)、细胞繁殖、细胞迁移和胚胎/组织发育。
如图3所示,HA由重复的以β-1,3糖苷键连接的葡萄糖醛酸(glcA)和N-乙酰葡萄糖胺(glcNAc)残基对组成。葡萄糖醛酸残基和此处所述的大分子网络特别相关,这是因为这种糖沿着HA的二糖重复结构定期的提供羰基,从而对于羟基苯如酪胺的取代有利。对于每一透明质酸链,该简单的二糖重复多达10,000次或更多,从而生成分子量为1千万道尔顿的大分子。每个相邻的二糖之间通过β-1,4糖苷键连接,如图3所示。每个glcA在其葡萄糖环的5位碳原子上连有一个羧酸基团(CO2H)。在生物条件下,HA是负充电的,任意盘绕的高分子,填充体积超过分子重量和组分的1000倍。正如注意到的一样,强负电荷洗衣阳离子和水,从而HA在体内形成强水合的胶,使其具有独特的粘弹性和振动吸收性能。由于HA是非免疫原的、无毒和没有刺激性,所以HA在组织工程中的应用是一种稳定可靠的支架材料。也是因为是一种天然生产的胞外基质(ECM)分子,HA具有可以被细胞受体识别的优点,以及可以和其它ECM分子反应、可以通过正常生理学途径代谢的优点。
酪胺是带有与苯环OH基团正对的乙胺基团的酚类分子。当使用这些分子时,将酪胺取代至HA的CO2H基团的单键氧原子上的机制如下所示,是通过上述碳二亚胺介导的反应机制进行的。优选的碳二亚胺类是所示的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。
其中结构A是EDC;结构B是透明质酸(虽然只表明了一个CO2H);结构C是反应A的产物1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)异脲;结构D是酪胺;结构E是酪胺取代透明质酸;结构F是1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)尿素(EDU)。
在上述途径中,透明质酸分子羧基基团上的电负性的氧原子通过亲核反应机制攻击碳二亚胺分子(EDC)上缺电子的二酰亚胺碳原子生成活化的O-酰基异脲(反应A)。于是HA羧酸酯基团中的碳原子对电子的缺乏使得其易受酪胺分子中胺基团的孤对电子的攻击(反应B)。优选地,反应A由合适的催化剂催化在反应A中生成活化的酯,使得反应可以在基本中性的pH(例如pH=6.5)下进行。合适的催化剂包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、次优的1-羟基苯并三唑(HOBt)或N-羟基磺基琥珀酰亚胺(NHSS)、次优的其它通过形成活化酯有效提高碳二亚胺反应使得碳二亚胺在更高pH下的无效水解最小化的合适催化剂或它们的混合物。除了EDC外可以使用的其它次优的碳二亚胺包括1-环己基-3-[2-(4-甲基吗啡啉)乙基]碳二亚胺(CMC)以及二环己基碳二亚胺(DCC)。
上述反应A生成了O-酰基异脲取代透明质酸;EDC分子临时取代至HA分子中glcA残基的羧酸基团上,使得羧酸基团的碳原子带有弱正电性。如上一节中所解释的,酪胺分子末端胺基团的电子对随后通过亲核取代反应取代至碳原子上(反应B)。反应B生成了酪胺取代HA分子(T-HA)和副产品酰基异脲。应当了解的是反应A和B将在HA分子的周期性glcA残基上生成多个酪胺取代;出于简单明了的考虑在此只显示了单个取代。
如以上说明和解释,在生成T-HA之后,多个T-HA分子通过过氧化物和过氧化物酶发生反应生成交联的T-HA分子。即与HA分子相连的酪胺残基的羟基苯基团在过氧化物酶的存在下和过氧化物(优选H2O2)发生反应从而去除了酚羟基的氢原子生成酪胺自由基,其中酚上的氧原子带有未配对电子。该自由基发生异构化或共振,生成的共振结构(或自由基异构体)中未配对电子转移至酚环上的邻位碳原子。在该位置,未配对电子迅速地和另一个酪胺自由基上相似位置上的未配对电子生成共价键。其结果是在相同或不同的HA分子的不同glcA上的不同酪胺自由基残基之间发生自由基驱动的二聚化。该二聚体进一步发生烯醇化生成相互连接的酪胺残基,生成二酪胺键结构。应该明确的是在相邻的酪胺残基间将发生很多所述的反应,生成本发明的T-HA分子的交联大分子网络,该网络具有如下交联结构 交联的T-HA网络可以通过传统方法如通过连接蛋白加入聚蛋白多糖,生成的交联T-HA网络中聚蛋白多糖分子与HA链相连。于是,根据本发明可以获得与正常软骨聚集体中的网络相似的网络,其中二酪胺键取代正常软骨中的胶原纤维将网络连在一起并由此限制住所含的聚蛋白多糖网络。
由本发明可知,其它的粘多糖、多糖和聚羧酸也可被用作大分子生成在此记载的交联网络。例如,除了HA以外的合适的粘多糖包括软骨素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素和肝磷脂。其它合适的聚羧酸酯包括聚蛋白多糖如多功能蛋白聚糖、聚蛋白多糖和由聚蛋白多糖、透明质酸及连接蛋白组成的软骨聚集体;聚糖醛酸如聚果胶酸盐(聚半乳糖醛酸)、聚葡萄糖醛酸、果胶(聚半乳糖醛酸甲基酯)、聚唾液酸(聚[2,8-(N-乙酰神经氨酸)])和海藻酸盐(甘露糖醛酸和古洛糖醛酸共聚物);以及符合上述聚羧酸酯的定义的氨基酸(具有至少2个氨基酸单元),如聚天冬氨酸和聚谷氨酸。采用在此记载的碳二亚胺介导的反应途径,本领域的普通技术人员通过正确的实验方法可以对所有这些大分子进行一个或多个羟基苯基团的取代。
如上所述,还应当了解的是天然多酚化合物已经含有两个或多个羟基苯基团,羟基苯基团可以通过所述酶催化化学反应交联,因此多酚化合物可以替代上述必须通过化学反应加上羟基苯基团的聚羧酸酯和聚胺。
在另一个优选具体实施方案中,用酪胺交联的硫酸软骨素分子(独立地或作为聚蛋白多糖的一部分)网络用于模拟或置换正常软骨。硫酸软骨素与透明质酸相同,除了1)重复的二糖结构包含的是N-乙酰半乳糖胺(galNAc)而不是glcNAc,唯一的差别在于接在4位碳上的羟基基团(在图3中用圆圈标明);2)O-硫酸盐发生在galNAc残基的4和/或6位和/或glcA残基的2位羟基上(图3)以及3)硫酸软骨素的链长,比透明质酸少20-100个重复的二糖单位。(聚蛋白多糖分子由多条——大约100条硫酸软骨素链通过每条链的还原末端的连接糖与核心蛋白相连)。在该具体实施方案中,相邻的(交联的)硫酸软骨素分子电负性的SO42-基团产生的排斥力使得网络聚集体具有抗压性而酪胺交联防止硫酸软骨素网络断裂或散裂。由此生成了与正常软骨中类似的不可替代的硫酸软骨素网络(以及伴随着的不透水性),但是没有正常软骨中的胞外胶原纤维基质或HA链。事实上,通过直接交联硫酸软骨素分子(而不是前述具体实施方案中的核心HA分子),相邻硫酸软骨素分子之间的排斥力增强,使得其对流体流的抵抗力较正常软骨更强。由于间隙内流体相的流动受到更大的限制,直接交联的硫酸软骨素分子对于载荷力的吸收和分散能力比正常软骨更强。在硫酸软骨素分子直接交联的该具体实施方案中,一些软骨退化的情况被彻底控制;例如某些情况下正常软骨中与硫酸软骨素分子正常相连的核心蛋白在HA结合域(G1)与第二个球形结构域(G2)之间发生断裂,于是软骨素硫酸富集区从软骨聚集体中扩散出去。在该具体实施方案中,由于硫酸软骨素分子之间直接交联而没有与聚蛋白多糖或其它蛋白聚糖分子相连,它们不会像在正常软骨中那样被切断或运走。
然而,由于HA的可利用度高,优选酪胺交联的T-HA网络(带有聚蛋白多糖分子的HA支架链,聚蛋白多糖分子包括硫酸软骨素链)。这在使用本发明进行软骨置换或修复中可能是有益的,因为身体生成软骨的正常代谢途径可以直接在植入的酪胺交联T-HA网络上形成,以下将对此进行说明。
根据本发明的交联网络进一步用于人造肾。肾通过两种机理过滤血液一种是大小排斥,另一种是通过电荷排斥。MEMS设备设计用于人造肾设备,该设备包括精确设计的微孔,可以有效的模仿肾的大小排斥特性。在健康的肾中,与电荷排斥相关的过滤是基膜中的硫酸乙酰肝素蛋白多糖导致的结果,其分离其它和肾功能相关的两种重要和明显的细胞类型。为了模拟MEMS工程中的人造肾的电荷筛选功能,制备的水凝胶可以含有硫酸乙酰肝素或肝磷脂,并通过二羟苯基(二酪胺)进行交联,从而提供MEMS设备范围内的孔。这种乙酰肝素/酪胺硫酸盐水凝胶可以用两种HA得到的水凝胶(如T-HA))以三明治的方式包裹,并含有一种正常肾中含有的正常细胞。中间的乙酰肝素/酪胺硫酸盐水凝胶为设备提供一种电荷排斥性能。外侧的两个HA水凝胶层提供免疫系统的保护,防止被正常细胞和分子碎片污染。过滤隔离对侧的两种类型的细胞在其正常的生理方向上提供细胞组分。
在其它有希望的应用中,本发明所述的水凝胶可以用于人造胰腺的发育。由于体内的探测器电极的污染,人造胰腺发育中的MEMS工程葡萄糖传感器的半衰期短。用本发明的透明质酸(如T-HA)对这些探测器的表面进行涂敷可以允许小分子量葡萄糖分子的扩散,这些小分子量葡萄糖分子设计用于探测提供免疫系统的保护,防止被正常细胞和分子碎片污染。
总之,前述的用于大分子的、形成水凝胶的支架材料包括但不限于聚碳酸酯(含有游离碳酸基团)、聚胺(含有一级游离胺基团)、多酚(含有游离羟苯基团),以及其共聚物,上面已经公开了其中的实施例。当使用多酚时,上述制备网络的第一步可以忽略,这是因为多酚含有多个或循环的羟苯基基团。此外,聚碳酸酯和聚胺必须沿着它们的长度加入或取代羟苯基基团,优选通过上述碳二亚胺(carbodiimide)反应路径。制备网络的第二步为连接到两个相邻大分子(聚碳酸酯或聚胺或多酚)的两个羟苯基之间进行酶驱动的二聚反应,从而得到交联结构。这一步在代谢条件下的温度和pH、合适的酶(优选为HRP)及使用过氧反应试剂(优选为过氧化氢)的情况下进行。
在优选的二酪胺交联T-HA网络的情况下,第一步中,高分子量的透明质酸(HA)上的羰基被酪胺取代,从而在HA分子中引入起反应作用的羟苯基基团。这种酪胺取代反应优选用碳二亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)进行控制,并通过摩尔比和反应混合物中的酪胺、EDC和HA的绝对浓度控制HA上的酪胺取代度。过量的反应试剂如没有使用的酪胺和EDC随后用透析除去,可以回收高分子量的酪胺取代的HA(T-HA)。每个T-HA制备中的酪胺取代百分比很容易通过测量计算1)制备中酪胺的浓度,可以通过酪胺在275nm处的UV吸收性能进行光谱定量(如实施例2所述);以及2)HA制备中羰基的总浓度,可以通过标准已糖醛酸试验进行光谱定量。通过这种技术,含有一定百分比(4-6%)的酪胺取代的T-HA制备已经是固定的试验合成。这种程度的酪胺取代,大多数的()HA分子的化学性质没有变,因此仍然保持生物功能性。通过这种配方的T-HA(即4-6%酪胺取代),通过在第二步总简单的改变T-HA的浓度得到的大范围的生物物质具有广泛的物理性能。
在交联反应中,T-HA溶液通过酶(过氧化酶)驱动反应交联形成水凝胶,并在临近HA分子上的两个酪胺加合物之间催化形成共价键,从而形成一个二酪胺交联。多个交联,如每个HA分子中几百个这些二酪胺交联的形成三维稳定的支架或水凝胶。极稀的过氧化物(优选为过氧化氢)的加入需要引发交联反应,这是因为是过氧化物而不是HA为真正的过氧化酶的底物。过氧化物上的过氧化酶的反应产物是自由基,优选被酪胺上的羟苯基环吸收,从而形成二酪胺的交联。二酪胺连接结构是蓝色荧光的(参照实施例2),这种性能用于在水凝胶中成像氢和量化交联。由于交联反应是酶驱动的,水凝胶科可以在组织学的情况下形成,从而可以在所包含的细胞或生物活性试剂存在的情况下形成,或者直接和活体组织相邻,保持细胞和组织的活性。
根据T-HA的起始浓度,得到的水凝胶光学清晰,物理性能范围广泛。例如,试验测得6.25、12.5、25、50和100mg/ml的T-HA形成的水凝胶的物理性能(硬度、流变学和晶体结构)分别为胶状物、凝胶、面团、弹性橡胶组合物(类似橡胶球),以及类似软骨材料-参考实施例3。这些材料在临床上有很广泛的潜在应用,包括整形外科的(如软骨、骨骼、腱、半月板、椎间盘等等)和非整形外科(肾、肝脏、胰腺等等)组织、基因和给药途径,体内移植的非生物设备(如葡萄糖传感器、人造心脏等)、伤口修复、生物传感器设计以及声带修复。
本发明的水凝胶的优点包括如下能力1)提供易于表征和质量控制;2)和存在组织基质结合;3)直接和新近形成的基质结合;4)直接包括下雹和生物活性因子;5)保持生物适应性;6)控制生物再吸收;7)容易植入到复杂的解剖形状中(参考实施例4);以及8)显示自然组织如关节软骨的机械性能。
目前,以生物为基础的外科手术软骨修复方法包括自体同源的软骨细胞移植、钻孔、磨损软骨成形术、微结构和关节成形术。这些方法仅仅治疗关节软骨受伤的病灶,而不是关节裸露的连接表面,如在严重的骨关节炎和风湿性关节炎看到的。同时,这些方法采用软骨组织填料或从病人中收集的扩充的软骨细胞来填充软骨的缺损。这些组织或软骨细胞可通过完全新的材料填充缺损,如新近合成的玻璃质软骨,这些材料和存在的软骨基质结合,并具有正常软骨的生物机械性能。不过,这些方法都增加了修补组织(纤维软骨)的形成,而不是机械损害的、真正的玻璃质软骨。而且,作为修复材料的内生长的软骨得到途径有限,这对病人存在风险。从上面的讨论和下面的实施例,合成的大分子网络以及本发明的水凝胶在治疗软骨退化疾病中很有用处。材料完全从商业途径可得到的体内(ex vivo)反应试剂得到,因而对病人没有危害。此外,水凝胶(特别是T-HA)可以作为有效的软骨在软骨退化病人的软骨裸露关节中作为直接的替代物进行移植,这是因为这些物质在合成时可以仿效正常健康软骨的性能。
不是依靠合成或天然的材料或软骨细胞生成新的可移植的、合成的类似软骨的胞外基质(ECM),本发明的发明人开始时集中在提纯能够产生软骨形状和结构特性的分子,然后最小限度的修饰这些分子,以制备能够抗生物降解的物质。当软骨细胞仍然依赖移植后的大分子(如T-HA)网络提供的合成ECM支持时(如上所述的能够嵌入到水凝胶中的软骨细胞),这些分子不依赖新的合成。相反,此处所述的合成材料的基本结构通过二羟基苯的交联进行改性,优选为二酪胺。在进一步的试验和研究中发现水凝胶可用粘弹性的和其它能够适合交联反应的材料制成,从而得到所需的合成的可移植的替代物。
根据下述实施例所示,本发明制备的水凝胶可以有多种不同的性能,从而适合许多合成组织的移植或增加,以及其它的临床应用。如前述,本发明的材料可用用于修复损害或疾病造成的软骨缺损。偶然事故或运动引起的伤害缺损可以进行修复,可能仅涉及表面软骨层,或者可能包括下层的次软骨。疾病造成的软骨缺损可以用本发明的组合物进行修复,包括骨关节炎和风湿性关节炎造成的缺损。无论是疾病或损伤,这些缺损可发生在成熟或生长板的软骨中。合成生长板软骨的水凝胶的配方需要加入未取代的支架材料,从而可以生长时生物材料的再吸收。
另一个潜在的临床应用是替换受损的或关节炎的关节中的滑液。一般称作粘液补充治疗,这种治疗通常包括在受损的或关节炎的关节中注射未交联的HA溶液,即使HA可用在1-2天内从关节中清除,但是疼痛回持续苏州。此处所述的T-HA水凝胶的应用具有显著的优点,这是因为和未交联的HA相比,它们在体内存在的时间长。
本发明的水凝胶的另一个应用是用于头部和颈部的软骨和软组织的修复、重建或增加。在塑料和修复外科手术领域,用于头部和颈部重建的软组织增加的生物材料不易得到。对合适材料和生命周期的材料进行重大研究和投资。结果并不理想。当放置在免疫活性的动物体内时,材料的现有结构被破坏,并被吸收。而且,尽管现有的合成材料有很好的生命周期,但是它们显示有特定的不可避免的缺点。例如,硅树脂被认为是安全、长周期的免疫效果。合成的聚合物PTFE(gortex)和硅橡胶具有较少的组织反应性,但是不具有组织同化性,被体内长期排斥和感染。本申请中的材料可以用于制备合成的软组织支架材料用于颈部和头部软组织的增加和修复。特别的,交联的酪胺取代透明质酸(T-HA)水凝胶是一种非刺激性、非免疫原的,可以制备成合粘弹性的(参见下面的实施例),能够用于有效移植的支架材料。此外,优选的酶驱动交联化学物质保持细胞活性的独特能力允许细胞的加入,如制备时直接在水凝胶中加入软骨细胞,这样可以在缺损的原位起作用。因而,就不用为了和特殊的缺损位置相匹配而需要根据特殊形状进行造型。
上述的二酪胺交联T-HA网络对于生产人工或合成软骨具有特别的用途。例如,本发明的水凝胶材料可以作为新型的生物适合的和生物适应的(biocompliant)的材料进行软骨移植,软骨移植常用于头和颈重建过程以修复外伤或先天畸形中的软骨或骨骼缺陷。专门针对于耳的应用包括耳廓和耳的重建,此应用经常用于修复由于外伤、肿瘤(即鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑素瘤)和先天形成的缺陷如小耳症。专门针对鼻的应用包括鼻和鼻腔隔膜的修饰和重建过程。对外伤、肿瘤、自免疫疾病如Wegeners肉芽肿或先天性缺陷的鼻重建需要软骨进行修复。隔膜穿孔难以治疗并经常治疗失败。将软骨嫁接用于这些治疗非常理想,但是自体或捐赠的软骨经常短缺。专门针对喉的应用包括喉气管的重建,对于儿童通常需要取肋软骨,这也是危险的。耳和隔膜软骨对于这种应用而言经常是不够的。因此在此描述的交联HA网络形成的工程软骨在解决这些问题上将产生重大影响。喉气管重建经常用于治疗由于声门下或气管狭窄而引起的气道狭窄。病源可以是外伤(即插管损伤或气管切开术)或先天性的。其它应用还包括下巴和面颊增高、下眼睑外翻修复以及大量的颅面应用。应当注意的是在这些应用中的软骨可能不需要和关节软骨有着完全一致的机械性质。同时可能希望其中可以包含细胞群或生物活性试剂。
此处所述的水凝胶材料也可以用作修复和缩小鼻腔,从而防止鼻腔中流体慢慢结成硬壳,这通常需要进行很大的外科手术切除。另一个应用是对成人和小孩的喉气管的重建,如在外科手术如心血管手术时由于插管导致喉气管的损伤。气管环前后部分处损伤的气管软骨可以用预制成形的水凝胶替换,如通过实施例4公开的方法。此处所述的水凝胶也可用于■环状软骨环的替换;■颈部癌症切除时保护颈动脉-水凝胶可以放置在颈动脉和皮肤间作为保护层,从而在去掉皮肤层后保护颈动脉;■切除神经后、神经元重新植入期间的作为保护层-通常纤维组织比神经元重新植入形成的更快,从而防止神经元的最终成形。在试管上预制成形的水凝胶中放入神经末梢可用阻止纤维组织在神经元重新植入的位置形成。
■由于耳损伤进行的耳切除手术后的耳后骨腔的重建。
■内耳的重建;特别是弥补手术中植入硅胶替换砧骨/镫骨。水凝胶可用于替换作为这些曲线顶部的天然软骨,或者用完全的水凝胶曲线结构完全替换这些曲线。
■修复软组织缺损,包括下额和面颊的增加,以及用于较低眼睑的睑外翻修复,以及诸如此类的颅面应用。
■除了头部和颈部的重建和美容,如丰胸时进行的胸部植入。
■作为伤口密封剂,例如填充胸部或颈部中除去淋巴结(如由于癌症)后留下的空腔,从而密封淋巴腺,减少不受控制的流体流进可能引起感染或其它并发症的切除部位。
除了上述合成软骨组织以外,本文描述的大分子网状材料及其制成的水凝胶还能够利用上述人造软骨合成的类似策略和方法在其他组织工程应用中生成其他合成矫形组织,包括(但不限于)骨、腱、韧带、关节盘和椎间盘。下述实施例证明,本文描述的材料还能够利用上述人造软骨合成的类似策略和方法来制备合成的非矫形组织,包括(但不限于)声带、玻璃体、心脏瓣膜、肝、胰腺和肾。
本文公开的水凝胶另外一个具有良好应用前景的领域是某些胃肠应用,其中需要治疗或预防腹部或胃肠器官中瘢痕组织或狭窄的形成。已经有许多产品处于临床和FDA审批的不同阶段,统称为“水凝胶”,这些产品被设计或预期用于治疗和预防瘢痕和/或狭窄的形成。本发明的水凝胶优于其他水凝胶,因为本文发明水凝胶能够完全由不同于外源性材料(如硅酮或其他合成聚合物)的非免疫原性材料制成,并且能够在患者体内原位交联。本文公开的水凝胶组合物能够用于现有已知的水凝胶所应用或预期应用的类似应用领域,包括■用于治疗胃肠道狭窄或瘢痕。该治疗包括在预期的狭窄部位注射水凝胶材料来预防瘢痕,或者在治疗后于已经存在的狭窄部位注射水凝胶来扩张缩小的胃肠道来预防狭窄的复发;■用于治疗食管狭窄。食管狭窄是胃食管反流疾病(GERD)的常见并发症。GERD是由反流入食管并损伤食管衬细胞的酸、胆汁和其他有害的胃内容物所引起的。约7-23%的GERD患者发生食管狭窄或食管纤维瘢痕形成。食管纤维瘢痕形成还可以由用于治疗巴雷特食管的烧蚀剂疗法所引起。这类烧蚀剂疗法的主要并发症为烧蚀损伤深度扩展入食管壁并导致食管瘢痕或狭窄。食管狭窄阻碍了正常吞咽,是患者发病的主要原因。本文描述的水凝胶材料可以用来治疗或预防GERD、巴雷特食管和食管烧蚀疗法所引起的食管狭窄。
■用于治疗克隆氏病。克隆氏病引发狭窄或瘢痕,阻挡或变窄肠腔,妨碍了正常的肠功能。本发明水凝胶可以用于治疗或预防这类狭窄。
■用于治疗原发性硬化性胆管炎(PSC)。PSC是罕见的肝胆管疾病。胆管在肝内形成分子网络并通过两个主要分支伸出肝脏,这两个分支结合成总胆管将肝脏和胆囊中的胆汁排入十二指肠。胆管直径非常狭窄,正常条件下,其直径最大的最远端部分只有2mm,但它们必须每天将胆汁从肝脏正常排入十二指肠。这些胆管的任何阻断都能导致已知为黄疸的严重疾病,使许多毒素-特别是血红蛋白降解产物-蓄积于体内。PSC是一种肝内胆管和上述连接肝脏和小肠的胆外胆管中形成瘢痕或狭窄的疾病。PSC的胆管狭窄可以通过本发明水凝胶来治疗或预防。
■用于治疗慢性胰腺炎。慢性胰腺炎是一种慢性胰腺炎性疾病,可以并发胰管的瘢痕或狭窄。这些狭窄阻碍胰液的排出,而这些胰液正常情况下必须通过胰管系统或引流导管排入小肠。胰液中含有许多消化酶和其他对正常消化和营养吸收重要的成份。由慢性胰腺炎引起的胰管阻塞或狭窄能够导致严重的并发症,其中胰腺自我消化并形成威胁生命的腹部感染和/或脓肿。慢性胰腺炎的胰管狭窄可以通过本发明水凝胶来治疗或预防。
■用于治疗胆结石诱导的胆管和胰管狭窄。胆结石是很常见的疾病,其主要并发症是胆管和胰管狭窄的形成,可以通过水凝胶治疗或预防。
■用于治疗局部缺血性肠疾病。肠在血液供应不足时容易形成瘢痕或狭窄。血流不足被称为局部缺血,能够由很多病理引发,包括心血管疾病、动脉粥样硬化、低血压、血容量不足、肾或肝脏疾病诱导的血白蛋白减少、血管炎、药物诱导疾病和许多其他疾病。所有这些病因的结果都能导致肠内狭窄,阻碍肠腔而妨碍其正常功能。本发明水凝胶可以用来治疗或预防局部缺血性肠狭窄。
■用于治疗辐射诱导的肠狭窄。用于癌症的辐射治疗与大量疾病的发生有关,其中重要的是肠狭窄的形成。本发明水凝胶可以用来治疗或预防辐射诱导的肠狭窄。
除了制备合成组织,本文公开的水凝胶还能为外科手术或体内移植使用的非生物结构或装置提供涂层,如手术器械或者陶瓷或金属假肢。这种涂层将在非生物装置材料和活体组织之间提供一种屏障。水凝胶作为非生物装置屏障的作用包括(但不限于)1)防止大分子和/或细胞吸附于非生物装置表面,这种吸附能导致装置表面的蛋白污垢或血栓形成;2)为非生物相容性材料制成的装置提供一种非毒性、非炎性、非免疫原性、生物相容性的表面;3)与装置功能相容,如葡萄糖传感器的葡萄糖扩散、压力传感器的机械力传递、或血管移植物或支架的温血作用;4)改善装置功能,如为MEMS人工肾脏中现有大小的屏障提供一种电荷屏障;5)将处于生理相容性水环境中的活力细胞群掺入非生物装置;和6)包裹药物或生长因子、抗病毒剂、抗生素或粘附分子等生物活性因子来刺激血管化作用、上皮形成作用或装置的温血作用。
基于上文,本发明水凝胶可以用来为各种可移植装置提供非变应原性涂层,包括用于控制糖尿病的可移植葡萄糖传感器。另外,该水凝胶可以用来提供电荷屏障,用于发展MEMS人工肾脏;生理相容性水环境,其中含有的肾脏细胞(如足细胞)能够被整合入MEMS人工肾脏的设计中;可移植MEMS装置的涂层,用于多种用途,包括(但不限于)药物传递、机械传感以及作为生物检测体系。
本发明公开的水凝胶,特别是透明质酸水凝胶,还可能与硅材料装置共价连接,例如,通过酪胺的伯胺与硅表面的第一共价连接来提供羟苯基包被表面化学。这一过程可以利用与将游离胺修饰的DNA结合到硅表面相同的化学。然后,通过上述优选交联模式中使用的、相同的过氧化物酶驱动化学将HA水凝胶1与羟苯基包被表面共价配对。
本发明水凝胶还能用于包被非生物心血管装置,如导管、支架和人造血管。这些装置包括由那些因为生物不相容性而一般不使用的材料所制成的装置,而这些装置具有比目前应用的装置具有更优越的设计特征。可以在水凝胶中加入生物活性因子来提高水凝胶的温血作用或上皮形成作用,从而提高植入装置的温血作用或上皮形成作用。
上述非常具有应用前景的是设计和完成用于治疗和控制糖尿病的可移植葡萄糖传感器。有效的血糖控制需要频繁检测血糖水平,目前需要针刺(或“手指棒”)来获得血糖样品。经济有效的可靠血糖检测方法和低血糖的预防有巨大的临床价值,低血糖导致很多严重威胁生命的疾病。从技术角度上,在过去十年间,微传感器在广泛应用领域中取得了非常大的成功。生物相容性长期可移植葡萄糖传感器的成功研发将深刻影响糖尿病个体对葡萄糖水平的常规监测,并将在生物人工肝脏的进一步研发中发挥重要的促进作用。
心血管外科手术中使用的传感器的设计已经被公开,Clark LC,Lyons C,″Electrode system for continuous monitoring incardiovascular surgery,″Annals of New York Academy of Science,10229-45(1962)。随后,研究方向转为开发和测试一种能够模拟天然葡萄糖/胰岛素控制系统的可移植装置。除了作为生物人工胰腺的显著优点之外,这种系统还能与遥测硬件结合,从而事先向患者发出低血糖警告。
针对可移植葡萄糖传感器的先期工作一般有两种方法。第一种方法包括将传感器放入血管中,如腔静脉或颈动脉。第二种方法包括将传感器置于皮下。这些传感器可以包括一微量渗析探针,或者更常见的是包括一安培计的酶传感器。可以相信,血栓形成和感染的血源传播危险妨碍了血管内传感器的长期使用。血液和皮下葡萄糖浓度之间的确切关系尚处于研究之中,近期研究表明质量传递模拟方法能显著提高对基于皮下数据的血糖水平的评估。另外,皮下传感器具有显著优点临床安全性、方便插入和移出、方便与遥测系统相结合、成本优势。实际证据表明葡萄糖传感器的皮下安置将发挥作用,并且比其直接接触血液具有更长的传感器寿命。
但是,在设计任何用于临床的连续葡萄糖传感器中存在的主要问题依然是传感器的长期漂移问题,这通常是由于暴露于人体组织的电极产生污垢或者酶活力的逐渐损失所引起的。作为葡萄糖或过氧化氢屏障而引入的各种膜大体上改善了传感器的性能,但依然没有产生长期的稳定性。之前用于此种目的的许多膜,Nafion,在植入人体后快速变质。移植物向皮下组织植入时会引发极性和慢性炎性反应。所有这些因素导致了新组织的复杂预期生长,最终使移植物被异物囊(FBC)包裹。简言之,可能是炎症细胞引起葡萄糖代谢并从而导致葡萄糖读数失真。当讨论皮下传感器的长期使用问题时,专家认为传感器表面的蛋白质或细胞涂层干扰葡萄糖的大量转运,能够有助于体内反应的降低。如果能提供适当的传感器覆盖膜来排除干扰物或控制涂层或蛋白和细胞的囊化作用,那么在体内能够达到与体外相应的优良性能。可以证明,使用本文描述的HA水凝胶作为包被剂来减少FBC并保持其远离传感器膜是一个有效的解决方案。
在传感器膜上使用HA涂层的目的是控制对可植入性葡萄糖传感器的组织反应。通过防止蛋白质和细胞堵塞葡萄糖和氧扩散入传感器,HA水凝胶护套将为传感器膜提供“呼吸空间”。先前经验表明,HA及其衍生物具有相当好的生物相容性,因此被用于需要减少宿主组织反应的情况(例如,眼移植外科手术中)。因此,当HA水凝胶环绕传感器膜时,将使传感器性能长期得到提高,因为HA水凝胶涉及长期可移植葡萄糖传感器的开发,这种传感器将为糖尿病人群带来改善的血糖监控以及最终改善的生活质量。另外,本文公开的HA水凝胶的新型交联结构将保证这种涂层的长期保持,这将为皮下移植的葡萄糖传感器提供很长的寿命。
另外一个有前景的应用是生产用于治疗肾终末期疾病(ESRD)的生物人工肾脏。目前对于ESRD患者的唯一治疗选择是换肾疗法(所有形式的透析)和移植。移植受供体器官短缺的限制,而且必须终生使用昂贵的免疫抑制药物。另外一个选择中,尽管透析能够延长ESRD患者的寿命,但透析的平均的预期寿命减少50%,而剩下的生命质量也远不如理想状态。反复的血管通透和患者血液的处理导致频繁的威胁生命的感染。
肾脏的功能单位是肾元。肾元开始于一种过滤结构一肾小球,肾小球是一簇毛细血管,由上皮细胞(足细胞)围绕并由间质细胞(肾小球系膜)支撑。肾小球与肾元小管直接相连,肾元小管是一条与极性细胞的单层上皮细胞连接的长管。小管细胞的功能是从滤液中吸收流质、电解质和营养(通过胞内运输和细胞外周运动),将滤液浓缩成尿。所有肾元连接入肾收集系统,肾收集系统是一个上皮细胞排列导管形成的网络,具有附加的再吸收性能,但其主要功能是将尿导入膀胱。肾元的过滤单位—肾小球一组成为毛细管小动脉壁的上皮细胞、毛细管外部环绕的足细胞和夹层于这两种细胞之间的小球基膜(GBM)。肾小球毛细血管是体内一些最小的血管床,血管小球内皮细胞具有窗孔,其专门功能是使血浆与过滤屏障直接接触。尽管这些有孔的内皮细胞限制粒细胞和很大分子进入滤液,但是过滤屏障的选择通透性由足细胞和GMB所决定。
GBM是一种标准的基膜结构,由下述原型分子组成IV型胶原(α3、α4、oc5异质三联体)、层粘连蛋白(层粘连蛋白-11,α5,β2,γ1异质三联体)、HS蛋白聚糖(基底膜蛋白多糖和集聚蛋白)和巢蛋白(巢蛋白-1和巢蛋白-2);以及几种其他ECM分子,包括胶原V、纤维结合素、一种CS蛋白多糖(bamacan)和几种富含亮氨酸的小蛋白聚糖(二聚糖、核心蛋白多糖、podocan)。GBM由内皮细胞和足细胞合成。每种细胞生成一个完整的基膜,两个基膜在随后的发展中融合形成一个双重厚度的基膜。GBM具有重要的功能,为足细胞和内皮细胞提供适宜的微环境。如果没有正常的GBM,这两种细胞都将失去它们的典型形态和细胞分化特征,进而损坏肾小球功能。GBM还可以通过限制水分运动而具有过滤功能,对大小和电荷选择性具有一定贡献,但是,选择通透性主要还是由足细胞控制。
足细胞是一种高度专一的上皮细胞,在肾小球中具有独特功能。足细胞扩展成裹围毛细血管的层形足板,分支分布成非常精细的、与其他足细胞的犬牙交错。在交错部位,这些犬牙交错的细胞扩展被称为足突(FP),在其中发生过滤作用的足突间空隙被称为裂孔。足细胞合成一种跨越裂孔的大分子结构-裂孔隔膜(SD),在相邻足突间形成桥接。还未完全了解SD的分子组成和结构。SD表现为改良的粘附接头,含有附加的足细胞专一蛋白-最著名的已知去氧肾上腺素。从一个足突的质膜分泌的去氧肾上腺素与相邻足突分泌的另一个去氧肾上腺素分子发生相互作用,通过电子显微镜观察,在交叉部位产生一个的拉链状结构。
对于研制下一代生物人工肾脏来说,生物微机电系统(bioMEMS)是一个值得开发的领域。给药系统、免疫分离器、毛细血管网以及细胞分化和生长的精确控制等领域已经证明了生物微机电系统的应用。肾脏是第一个接受了慢性替代疗法的器官,生物微机电系统在治疗ESRD中的应用在技术上是进步的,在终端产品上是革命性的。硅微型机技术已经发展到了能够确保质量的生产特征尺寸量级为1-100纳米的结构。这些尺寸基于肾小球裂孔隔膜的尺寸数量级。使用标准硅容积和表面微型机技术的装置实现了微流控制、细胞和胞外基质蛋白的模式沉积和细胞的免疫分离,将装置本身应用于人工器官的组织工程中。纳米级半导体过滤膜工程能够实现电荷-尺寸选择性的独立控制和考察,有潜力形成生物人工肾小球的组织工程并最终形成完整的肾单元。
生物人工肾脏微型化的第一部分是根据生物微机电系统元件中开发纳米级血过滤膜(NHM)。NHM将服务于生物人工肾脏的肾元样装置中肾小球的血液过滤功能。可以使用标准微型机技术连接NHM阵列,含有约为肾小球裂孔隔膜尺寸的裂孔,并通过实验来证明它的尺寸屏障特征类似于肾小球基膜。本专利申请描述的化学和水凝胶能够为要求有肾小球功能的NHM提供过滤特征所必要的两个附加组成。第一组成是与肾小球基膜类似的电荷屏障组成,这将通过应用一层硫酸乙酰肝素(HS)水凝胶来提供。HS是一种类似于HA和CS的GAG。第二附加组成是足细胞,通过裂孔隔膜负责主要的肾小球过滤功能。足细胞将被应用于HA水凝胶层中HS水凝胶层的表面,HA水凝胶层还用来提供一个生物相容性层。HS层的存在应该会促进适当的基质细胞相互作用并刺激适当的基膜沉积。
本文描述的水凝胶,包括(但不限于)酪胺透明质酸,也能够用作研究和临床试剂。一个应用前景是控制或延缓药物释放。在这一应用中,药物可以被封入球状或其他适宜形状的水凝胶材料中,由中心球状或其他形状的水凝胶核心构成,水凝胶以相对高的大分子浓度配置(因此是低多孔性的),水凝胶核心上包裹有水凝胶的同心球层,每一包裹层的水凝胶以逐渐降低的大分子浓度配置(因此多孔性越来越高)。如果是照此设计,药物的释放就由水凝胶降解速率、药物与水凝胶支架的结合以及药物经支架孔隙的扩散所控制。水凝胶球体被植入患者适当部位来实现药物的延长释放。
基于载满药物的水凝胶颗粒与特异组织和细胞之间设定的亲和力,还可以通过亲和力策略来实现靶向给药。为此,水凝胶能够作为亲和介质用于选择性结合,从而通过在交联过程中或之前将靶细胞结合分子整合入水凝胶来纯化特定细胞群。选定细胞群一经结合到水凝胶亲和介质,它们就能够被释放来做进一步考察,或者在与水凝胶亲和介质结合期间被直接封入其他水凝胶制剂,用于其他组织工程或临床应用。
这种亲和介质还能用于透明质酸结合蛋白的选择性结合与纯化。由于全部介质可以由透明质酸单独制备而不需要其他支持材料,所以结合背景应该很低。通过使用其他材料(如聚蛋白多糖)作为支架材料,可以制备其他亲和介质,用于纯化与这些支架材料选择性结合的分子。
通过在交联过程中将蛋白质A整合入水凝胶,这类亲和基质还能用于特定大分子或细胞群的选择性结合与纯化。可以使用特异性针对这些大分子或细胞群的抗体来包被整合有蛋白质A的水凝胶,抗体最佳导向为抗原结合臂(Fab)向外而恒定域(Fc)与蛋白质A结合。选定细胞群或大分子一经结合到蛋白质A水凝胶,就能够被释放来做进一步考察,或者在与水凝胶结合期间被直接封入其他水凝胶制剂,用于其他组织工程或临床应用。或者,抗体可以被直接整合入水凝胶。
本文公开的透明质酸水凝胶材料还能用于诊断透明质酸酶的存在,透明质酸酶可以预测某些癌症的转移潜力,例如,通过透明质酸水凝胶包被活组织切片并检测水凝胶材料内荧光损失的程度和区域来预测,因为当水凝胶被内源性透明质酸酶消化时会产生二酪胺交联。通过使用其他材料(如聚蛋白多糖)作为支架材料,可以检测其他降解酶,如金属蛋白酶。
结合下述描述性实施例,将理解本发明的其他方面。
实施例实施例1实验用量的本发明的具有二酪胺交联的酪胺取代透明质酸水凝胶按照如下方法制备。HA以基于己糖醛酸的1mg/ml的浓度溶解于250mM2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES),150mM NaCl,75mM NaOH,pH6.5的溶液中,溶液中含有相对于HA羧基基团的摩尔浓度10倍过量的酪胺。随后加入相对于HA羧基基团摩尔浓度10倍过量的EDC起始羧基基团上的酪胺取代。将相对于EDC摩尔量的摩尔比为1/10的N-羟琥珀酰亚胺(NHS)加入反应通过形成活化酯协助EDC催化的酰胺化反应的进行。反应在室温进行24小时,随后通过先后对150mM NaCl和超纯水进行彻底的透析及冻干将大分子从未发生反应的小分子量反应试剂如酪胺、EDC、NHS和MES中恢复过来。在冻干后,根据所需的最终水凝胶的硬度,将酪胺取代HA(T-HA)产物以5-100mg/ml之间的操作浓度溶解于PBS(该缓冲液与细胞悬液、体内组织接触以及交联反应兼容)中进行不同浓度的制备。可选择的,溶剂可以是除了PBS以外的其它任何合适的溶剂,只要溶剂对酶活性基本没有负面影响且不会通过选择性吸收由酶产生的自由基而干扰交联反应的发生。合适的替换溶剂包括水、传统的生物组织培养基和细胞冷冻液(通常由大约90%的血清和大约10%的二甲亚飒)。在将细胞悬浮(见实施例5)或在体内与组织接触之前,应将T-HA通过0.2μm的滤器过滤。随后在每一个T-HA制备中加入10U/ml II型山葵过氧化物酶(HRP)进行酪胺-酪胺连接。加入小体积(1-5μl)的稀过氧化氢溶液(0.012%-0.00012%终浓度)起始交联以生成最终具有理想硬度的水凝胶。为了制备更大量或大体积的理想水凝胶,本领域的普通技术人员可以将本节中提供的试剂量适当放大。
实施例2进行实验确定本发明的T-HA大分子网络的酪胺取代(以及随后的二酪胺交联)程度。首先,根据上述方法制备3种配方的(未交联的)酪胺取代透明质酸(T-HA),命名为0X、1X或10X。0X配方的制备不使用EDC(即不含有碳二亚胺),意味着不存在碳二亚胺介导酪胺NH2基团和HA分子CO2H基团之间生成酰胺键的反应。因此,0X配方可被视作对照。1X配方在反应混合物中含有与HA分子上的CO2H基团量的化学计量比为1∶1的EDC。10X配方在反应混合物中含有与HA分子上的CO2H基团量的化学计量比为10∶1(或10倍过量)的EDC。在所有三个配方中,酪胺的化学计量过量都是相对于HA的CO2H基团的数量而言的。在所有三个配方(0X、1X和10X)中,反应试剂和配方中适量的EDC在试剂瓶中混合并摇晃加速酪胺取代反应。所有的配方在室温反应24小时,随后透析试剂瓶中的内容物去除未发生反应的酪胺分子、EDC和反应副产物酰基脲(EDU)。由于酪胺、EDC和EDU的体积相对于大分子HA而言比较小,通过透析很容易将这些分子与HA和任何已生成的T-HA分子分离。一旦去除了未发生反应的酪胺和EDC,对每个配方的剩余物进行分析以确定对于HA分子上的所有可利用的CO2H总数的酪胺取代率。
酪胺在275nm出现UV吸收峰,根据酪胺标准曲线可以容易地观察出酪胺取代程度。根据对上述三种T-HA配方的UV光谱分析发现在没有EDC存在时(配方0X)进行的HA-酪胺取代反应在HA分子上发生的酪胺取代几乎为0。该结果证实了在酪胺取代反应中使用碳二亚胺反应途径的重要性。但是,酪胺取代反应中以1∶1EDC∶CO2H的化学计量比制备的T-HA配方中的酪胺吸收显示HA链上所有可用的CO2H基团中的酪胺取代率大约为1.7%。10X配方(10∶1EDC∶CO2H)造成了大约4.7%的取代率。
随后,将过氧化氢和山葵过氧化物酶(HRP)以5mg/ml的浓度分别加入三个透析过的HA/T-HA配方中(0X、1X和10X),生成的配方发生反应直至反应完全。在加入过氧化物和HRP的反应完成后观察到0X配方仍保持完全的液体,具有明显的弯月面;没有观察到凝胶的形成,证实了在没有使用EDC的酪胺取代反应中没有或基本没有发生酪胺取代的事实。1X配方只观察到微弱的弯月面且试剂瓶中的内容物已经凝胶化,证实发生了酪胺取代和交联。10X配方形成了较硬的凝胶,事实上相对于容器中初始的液体体积发生了收缩,在其上部留有一定量的液体(具有弯月面)。10X配方制备的胶(有4.7%的酪胺取代率)比具有1.7%酪胺取代率的1X配方坚硬很多。
二酪胺结构暴露在UV光下呈现出蓝色荧光。将上述各配方的产物暴露于UV光下以观察二酪胺交联的存在。和预期的相同,1X和10X水凝胶均呈现出蓝色荧光(10X水凝胶的荧光比1X水凝胶的荧光更强),但是0X配方完全没有蓝色荧光。结果证实在1X和10X水凝胶中存在二酪胺交联,在较硬的水凝胶(10X)中生成的二酪胺比在较软的水凝胶(1X)中更多。
总的结果证明了碳二亚胺介导的反应途径的重要性,证实了本发明中由交联T-HA网络形成的水凝胶的相对硬度与二酪胺交联程度成正比,二酪胺交联程度与HA上的酪胺取代程度成正比。相当惊人和出人意料的结果是根据本发明,即使1.7%的酪胺取代率(以及随后形成二酪胺的连接率)仍可提供合适强度的T-HA凝胶(或水凝胶)。4.7%的取代率(和交联)甚至生成了更加坚固的T-HA凝胶。同样惊人的是在反应混合物中存在的相对于羧酸基团量以化学计量10倍过量的碳二亚胺(EDC)(配方10X)仅造成了大约4.5-4.7%的酪胺取代率,虽然可以得到稳定和粘着的酪胺交联T-HA网络。
这些结果意味着虽然生成的网络是粘着稳定的水凝胶,HA分子上的大部分羧酸基团没有发生取代和酪胺交联而基本保持与天然HA分子中的一样。因此,当本发明的网络在体内用作软骨取代物时,由于和正常软骨中的HA相比,本发明的T-HA网络或凝胶中的大部分HA分子基本没有改变,人们相信身体的天然代谢途径(需要或不需要T-HA网络中提供的细胞的帮助)可将本发明的网络看作天然生物材料并能够进行与其相关的普通的合成和代谢功能。此外,人们注意到在身体内HA是一种高度普遍存在的材料且在人体内不产生免疫性。因此,人们相信本发明的含有大量未发生改变的天然HA的交联大分子网络将在广泛的希望或必须在人体中提供合成组织的组织工程应用中具有重要应用。这标志着技术状态的显著进步。因此,非常让人吃惊地,高度的酪胺取代,例如大于大约10-20%的取代可能是不希望的;上述实验证明生成合适的T-HA网络并不需要高度的取代。优选地,本发明的二羟基苯(例如二酪胺)交联聚羧酸酯(例如HA)网络基于聚羧酸酯(HA)分子上的CO2H总量的羟基苯(酪胺)取代率的百分比低于50,优选地低于40,优选地低于30,优选地低于20,优选地低于15,优选地低于10,优选地低于9,优选地低于8,优选地低于7,优选地低于6,优选地低于5。
实施例3传统地,人们已经相信天然软骨具有粘弹性,并且主要由于聚蛋白多糖基质中存在的相邻硫酸软骨素链上负电性的SO42-基团之间的排斥力,天然软骨能够抵抗变形和吸收压缩载荷。进行试验确定本发明中只含有二酪胺交联透明质酸分子(即没有聚蛋白多糖和硫酸软骨素)的大分子网络在没有SO42-基团的情况下与天然软骨相比在抵抗变形和吸收压力方面的功效。具体的,分别制备了三种网络1)二酪胺交联的HA分子(T-HA);2)二酪胺交联的蛋白聚糖形式的软骨素硫酸盐(T-Aggrecan);以及3)50%的T-HA和50%的T-Aggrecan组成的复合材料。根据实施例1制备和纯化未交联的具有大约5%酪胺取代率的T-HA配方。基于T-HA和T-Aggrecan配方,制备五种不同的T-HA浓度、T-Aggreca浓度和50∶50的T-HA和T-Aggrecan混合物浓度16.25mg T-GAG/ml PBS;浓度212.5mg T-GAG/ml PBS;浓度325mg T-GAG/ml PBS;
浓度450mg T-GAG/ml PBS;浓度5100mg T-GAG/ml PBS。
此处使用的符号T-GAG包括T-HA和T-Aggrecan。尽管聚蛋白多糖不是糖胺聚糖(GAG),本实施例的目的用T-GAG表示T-HA和T-Aggrecan水凝胶。
以上各制备随后在过氧化氢和山葵过氧化氢酶的存在下发生反应,和实施例1中一样在T-GAG分子间形成二酪胺交联,从而分别生成三种组合我的水凝胶1、2、3、4和5。根据制备中T-GAG浓度的不同,每十五种水凝胶(三种组合物,5种浓度)成为具有不同物理性质的稳定和基本粘着的材料。例如,浓度1生成的水凝胶具有与凡士林或果冻相当的硬度和流变学性质;水凝胶稳定且粘着,然而用诸如抹刀或其它传统工具施加外力可以引起流动或伸展。T-HA水凝胶1具有极佳的粘性,是外科手术如眼外科手术中外科器械的非过敏性包被材料的理想候选材料。T-HA水凝胶2比T-HA水凝胶1更加坚硬,这是由于制备中T-HA的浓度更高及随后可预见的T-HA浓度的增加引起的分子内交联的减少和分子间交联的增加。T-HA水凝胶2呈现出凝胶特征性的流变学和硬度性质,以及对于外部载荷一定程度的粘反弹力。在更大的载荷下,T-HA水凝胶2不会流动而是破裂成小碎片,这也是凝胶材料的特征。T-HA水凝胶3具有生面团或可延展面团的性质和一致性,在施加外部载荷力时也不会流动。和T-HA水凝胶1和2相比,该材料显示出更强的粘弹性。T-HA水凝胶4是高度坚硬和粘着的凝胶,能够很强地抵抗外力不会破裂。T-HA水凝胶4是具有高度弹力的类橡胶合成物,在突然性压力(如摔在地板上)下可以产生弹力。T-HA水凝胶4这种对于突然性压力产生弹力的能力使其在一些关节置换/修复应用中成为理想的材料,这些关节要经受重复性的或周期性的压力载荷(如踝关节)。除了所述T-HA水凝胶4的性质外,T-HA水凝胶5具有类软骨性质,外观类似关节软骨且用手术刀片切割时具有软骨的感觉。
进行封闭抗压测试以定量地确定上述五种不同的水凝胶的压缩机械性质。封闭抗压测试使用定制的聚碳酸酯封闭箱和多孔的聚丙稀滤器滚筒(20μm孔,20%有孔率)。用封闭箱和以下实施例4所述的冷冻-融解技术制备五个具有各水凝胶浓度的圆柱形栓(直径为7.1mm,厚度大约3mm)。随后按照下列测试步骤进行封闭抗压中的一系列应力释放实验。所有实验用Instron 5543测试仪在电脑控制下进行,机器以10Hz的频率记录时间-位移-载荷数据。每个实验均使用±5N或±50N的荷重仪(Sensotec)对载荷量全程跟踪。每一步使用30μm(30μm/秒)的速度,该速度相当于1%的张力,直至样品达到平衡。这被定义为弛豫率,当该弛豫率减慢至10mN min-1以下时,下一步自动启动直至完成20个循环(相当于大约20%的张力)。封闭抗压测试中各样品的厚度采用机械法确定,通过Instron 5543仪测量抗压反应引起的样品相对于箱底的位移。测试的厚度用于计算每一步的张力百分比。
十五种水凝胶的压缩机械性质通过前一节所述的方法确定。载荷数据用样品横剖面面积(39.6mm2)进行标准化以计算应力。每种材料配方的平衡应力对所加张力描点作图。每一步的聚集系数定义为平衡应力除以所加张力。对于每种材料,聚集系数定义为平衡应力-张力数据在线性最好的范围内的斜率。图4a-4c显示的是5种浓度的T-HA、T-Aggrecan和50%T-HA/50%T-Aggrecan复合水凝胶的平衡应力。所有的15种水凝胶可以进行封闭抗压测试并在测试中证明了典型的两相材料(如软骨)特征性的张力弛豫反应。6.25mg/ml和12.5mg/ml的T-GAG水凝胶的聚集系数比关节软骨低1-2个数量级。25mg/ml的T-GAG水凝胶和50mg/ml的T-Aggrecan水凝胶的聚集系数低于关节软骨的30%。所有的100mg/ml的T-GAG水凝胶、50mg/ml T-HA水凝胶和所有的复合水凝胶的聚集系数等于或超过关节软骨的文献报道值,。这些数据证明了用标准机械分析可以对水凝胶进行鉴定,并且证明了可以生成与关节软骨具有相似机械性质的水凝胶。
表1列出了5种浓度的T-HA、T-Aggrecan和50%T-HA/50%T-Aggrecan复合水凝胶的聚集系数。
表1聚集系数(MPa)

图4d显示测试系数是T-HA、T-Aggrecan以及复合水凝胶的函数。随着T-HA水凝胶浓度的增加,聚集系数逐渐达到稳定水平,而T-Aggrecan水凝胶的浓度和聚集系数成线性关系。有趣的是,随着复合水凝胶浓度的增加,显示复合水凝胶的应力性能呈指数级增加。这表明水凝胶材料的聚集系数可以考察这些关系进行预测。
基于以上实验,惊人并出人意料地发现二酪胺交联的GAG网络(HA或Aggrecan)可以生成粘着的水凝胶材料,为了适应特定的应用,通过在对酪胺基团进行交联前变化T-HA的浓度可以改变水凝胶的硬度和其它物理性质(流变学)。即使网络中没有(或基本没有)任何SO42-基团提供电荷-电荷排斥力产生材料的抗压性和弹性,仍然观察到这些水凝胶的粘着性和弹性。这个相当惊人和出乎意料的结果在组织工程应用中可能具有相当积极的作用。透明质酸是在人体内发现的高度普遍存在和无免疫反应性的分子。因此,由二酪胺交联透明质酸网络组成的水凝胶可以成为非常合适的组织置换材料移植入人体内,其硬度可以根据应用的需要加以调节。由于这些材料主要由没有发生改变的无免疫反应性的透明质酸组成,人们相信该材料可能引起的免疫反应为零或接近于零。这是和很多传统组织工程材料相比具有的重要优势,传统材料由于在化学合成中苛刻的反应条件或反应试剂,其在体内的应用受到阻碍,且材料最终的化学结构具有更大的诱发免疫反应的可能。
实施例4已经发展了多种制备方法用于在事先确定的三维形状中制备或形成水凝胶,诸如上述实施例3中的水凝胶。这对于很多组织工程应用非常重要,这些应用中必须将人工组织材料填入病人的天然组织缺陷或空洞中。
第一种方法是采用原位点形成技术,在该技术中水凝胶在原位置形成,即以最终应用的位置和结构的形状形成。此原位点形成方法按如下实验方法进行。酪胺取代透明质酸(T-HA)通过在此描述的碳二亚胺介导途径制备。在透析去除未反应的酪胺、EDC、NHS等以及将产物以理想浓度溶解于PBS中后(见以上实施例1),将小量山葵过氧化物酶加入T-HA制备液体中形成第一溶液。将第一溶液加入内部具有特定几何形状的实验室容器中(模拟体内位点)。随后,制备含有很稀的过氧化氢的第二溶液(终浓度为0.012%-0.00012%)。随后将相对于第一溶液而言小体积的第二溶液注射进已经装有第一溶液的容器从而起始二酪胺交联反应生成水凝胶。通过该技术制备的水凝胶具有以上实施例3中所述的不同的硬度和流变学性质,并且很好地与制备容器的内表面轮廓吻合。由于主要的试剂(H2O2、透明质酸和过氧化物酶)是非过敏性分子或扩散性分子,并且由于交联反应在代谢的温度和pH下进行,该技术可作为手术程序在病人体内的手术位点操作,从而生成缺陷适配水凝胶。该方法对于面部重建手术特别具有吸引力,该手术中外科医生可以将未交联的T-HA制备物(包含过氧化物酶)进行皮下注射并操作以形成理想的面部轮廓,随后通过注射小体积的过氧化氢溶液使水凝胶发生交联。
第二种方法是多孔模具技术,适合形成具有更复杂三维结构的水凝胶。该技术中首先根据所需最终结构的形状和轮廓制备多孔中空模具。例如,如果需要立方形水凝胶,制备的模型可以具有立方体形的内表面。模具可以用传统的多孔材料通过传统技术制备或浇铸,例如熟石膏、多孔或烧结塑料或金属等。在特别优选具体实施方案中,模具用纤维素透析膜制备。按以上方法制备第一和第二溶液,将第一溶液装入多孔模具中空的模巢中。随后,将装满的模具用极稀的过氧化物浴浸没。大分子T-HA和过氧化物酶由于其分子尺寸不能从多孔模具中扩散出模具,但是非常小的过氧化物分子(H2O2)能够扩散进模具并在过氧化物酶的存在下发生反应生成二酪胺交联。在该方法中交联自外向内发生生成最终的水凝胶形状,且在过氧化物浴中需要一定程度的试错法以决定最优的或充分的浸没时间。本领域的普通技术人员有能力确定这段时间的长短。通过这种多孔模具技术在实验室实验中已经成功完成了三维水凝胶的制备。
第三种方法是冷冻-融解技术,该技术适用于制备具有预先确定的高度复杂三维形状的本发明的水凝胶,例如人耳内部折回。在该技术中,模具用柔软的或有延展性的材料制备,如具有低玻璃转换温度的多聚体材料,例如低于-80℃。优选的模具材料是具有低玻璃转换温度的硅树胶,如玻璃转换温度大约为-127℃的聚二甲基硅氧烷,当然其它合适的低玻璃转换温度的硅树胶(例如低于-80℃)及其它多聚体也可以使用。首先通过传统或适用技术(即模压成形法、雕刻法等)制备硅树胶(首选材料),使其内部模巢和所需的水凝胶部分的表面形状、轮廓和体积吻合。如上制备第一和第二溶液并将第一溶液加入硅树胶模的内部模巢中。充填后的硅树胶模随后通过与固体CO2(干冰)接触冷冻至大约-80℃。由于第一溶液主要是水,溶液冷冻成固态冰的形式与模具的内表面的形状和轮廓吻合。但是,玻璃转移温度低于-80℃的硅树胶模仍然是柔软且有延展性的,可以轻易地将第一溶液的固态冰形式取出。由于第一溶液在冷冻时发生膨胀,应当使用合适的机械器材确保在溶液膨胀时硅树胶模不会变形或膨胀。优选地,在模中提供出入孔,当第一溶液在冷冻过程中膨胀时允许溶液的膨胀及释放。
一旦第一溶液的固态冰形式被制成模,三维结构中微小的缺陷或瑕疵可以使用合适的工具通过雕刻加以修复,且可以加入更多的液态第一溶液充填表面空洞,液体通过和固态冰形式接触瞬间冻结。同样地,如果希望保证一致的温度以及确保所有加入的第一溶液材料的冻结,可以将冰放回干冰表面。一旦冰的三维形状完美形成,将其浸没于液态过氧化物溶液中自外而内地起始冰冻水的融化及二酪胺的交联。由于交联反应的快速动力学,这种方法是可行的。当形成的水凝胶的中心最后剩余的冰冻水融化时认为交联完成,由于形成的水凝胶基本透明,所以很容易观察到交联的完成。
根据该冷冻-融解技术已经进行了非常成功的实验生成了人耳形状的本发明的固体水凝胶。通过这种方法可以形成的其它结构,如椎间盘、半月板等,对于本领域的技术人员而言是显而易见的。在该冷冻-融解技术中应当注意的是,模具材料的临界玻璃转移温度-80℃是大致根据固体CO2(干冰)的表面温度选择的,从而确保在第一溶液冷冻生成固态冰的形式时模具材料不会变得易碎。但是如果使用CO2以外的其它冷冻材料,合适的模具材料的临界玻璃转移温度可以相应的调整。
对于上述生成水凝胶的三种方法,第一溶液含有过氧化物酶和T-HA,而第二溶液含有过氧化物。尽管可以交换第一和第二溶液中的过氧化物酶和过氧化物,但将过氧化物与T-HA加入第一溶液并非优选。这是因为一旦将过氧化物、过氧化物酶和T-HA混合,T-HA迅速地开始形成交联的大分子网络。如果过氧化物酶(过氧化物酶是大分子)还没有均匀地分布于T-HA内,过氧化物酶可能不能或基本难以通过形成的水凝胶的孔扩散,难以在整个T-HA/过氧化物溶液中生成均一的交联。结果可能导致T-HA不均一的和/或不完全的交联和不均一的水凝胶。相反地,相对小的过氧化物分子(过氧化氢只比水大一个氧原子)可以相对容易地通过水凝胶的孔结构进行扩散,生成均一的水凝胶结构。
此外,过氧化物酶的大分子量使得其与T-HA类似地保留在多孔模具中,该模具只对小分子量过氧化物具有渗透性,过氧化物可以通过模具和新生成的大分子网络(即水凝胶)轻松且均一地发生扩散。由于这些原因,优选在第一溶液中均一分布过氧化物酶和T-HA,在第二溶液中单独提供过氧化物。
第四种方法是交互喷雾层覆或刷涂层覆技术。按上述方法制备第一溶液并包含过氧化物酶和T-HA。但是,第二溶液不仅含有上述的过氧化物,并且含有与第一溶液相同浓度的T-HA。随后将第一溶液的薄层涂在所需位点(原位点)随后覆盖上第二溶液的薄层。重复该步骤连续交替喷刷第一和第二溶液层直至缺陷或使用位点充填完成。非常薄的第一和第二溶液的交替层促进了二酪胺交联的完成,确保了最终水凝胶的高度一致性,且水凝胶具有理想的由两溶液的起始T-HA浓度决定的流变学性质。理想的液体层很薄,以确保第一溶液层中过氧化物酶生成的自由基能够完全渗透进相邻的第二溶液层并完成交联,该交联不依赖于过氧化物酶向第二溶液层的扩散(见上)。在两溶液中均包含T-HA从而保证在最终水凝胶中均一的T-HA浓度。在实验室实验中已经完成了该技术并生成了轮廓吻合和大量充填的均一的水凝胶。当需要生成薄而变化的酪胺交联HA层时该技术高度适用,如在骨关节炎裸露的关节的表面,在病人的移植位点几乎没有健康的软骨。
以上所有四种技术对二酪胺交联透明质酸进行描述,但是应该知道在本发明的范围内的其它组合(其它二羟基苯交联大分子,如聚羧酸酯、聚胺、聚羟基苯分子和它们的共聚物)可以通过以上技术制模。
实施例5将大鼠的软骨细胞埋入(交联的)T-HA水凝胶中以测试它们在交联反应中的存活能力。将活细胞加入第一溶液与T-HA和过氧化物酶共同分散,随后加入含有过氧化物的第二溶液起始二酪胺交联,于是分离得到的软骨细胞被悬浮于实施例2中描述的1.7%和4.7%的T-HA水凝胶中。埋有软骨细胞的1.7%和4.7%T-HA水凝胶中均一地分布了软骨细胞,且凝胶视觉透明,整个凝胶具有可视性。采用葡萄糖利用作为交联形成水凝胶后细胞活力的指示剂,因为软骨细胞对于葡萄糖消耗巨大,在少于24小时内耗尽葡萄糖培养基。结果显示埋于T-HA水凝胶中的软骨细胞与在单层中培养的相同的软骨细胞在24小时中具有基本相同的葡萄糖消耗情况(图5)。该情况持续长达7天,说明细胞是活的且代谢活跃。培养基葡萄糖通过标准己糖激酶分析进行测试。
对于含有软骨细胞和软骨组织的T-HA水凝胶的冻结部分还进行了荧光成像。水凝胶支架和软骨基质的HA样品通过生物素标记的HA结合蛋白(b-HABP)试剂荧光染色成像,而细胞核用标准的DAPI染色成像。b-HABP试剂用纯化的软骨聚蛋白多糖(只含G1结构域)和连接蛋白制备,该试剂识别并不可逆地与天然HA片断结合,这些片断正常情况下与软骨中的聚蛋白多糖和连接蛋白相结合。结果显示b-HABP对T-HA水凝胶的染色比对软骨染色效果更强,因为组织中的透明质酸已经结合了天然聚蛋白多糖和连接蛋白。在水凝胶T-HA支架和悬浮的软骨组织基质之间没有明显分别意味着严密的整合。这些结果证明了在水凝胶交联反应中保持软骨细胞活性的可行性,以及水凝胶严密地整合进已存在的软骨基质的能力,两者均对软骨修复的应用非常有利。结果还证明T-HA中足够多的片段在化学上保持不变,并可以在原位点与新合成的聚蛋白多糖和连接蛋白结合。结果还证实氧气、二氧化碳、葡萄糖和胰岛素可以在本发明的T-HA水凝胶中以一定速率扩散,该速率对软骨细胞代谢不发生限制,这不仅对于软骨置换物非常重要,而且对于其它应用如葡萄糖感应器设计和人工肾的发展非常重要。
为了将细胞如软骨细胞加入用实施例4中的冷冻/融解技术以复杂的组织形态制模的水凝胶中,人们希望酶驱动交联反应在标准的细胞冷冻溶液的存在下进行,比如包含10%二甲亚砜(DMSO)/90%胎牛血清(FBS)的细胞冷冻溶液。这一点已在实验室中通过实施例3中描述的所有T-HA水凝胶配方加以了证实。能够直接加入含有90%FBS的溶液也证明了反应中可以包含生物活性因子,如生长因子、荷尔蒙和控制细胞分化的因子,因为这些因子是FBS的正常组分。
实施例6进行以下实验,将上述T-HA水凝胶植入Yucatan小猪体内以修复关节软骨缺损。以下对本申请的背景知识做一简短讨论,然后介绍本实验的实验方法和结果。
背景组织介绍关节软骨结构与功能——如上所述,关节软骨是形成动关节表面的弹性承重组织。它能吸收机械冲击,并将所施加的负荷偏移或扩散到软骨下骨的较大面积上。它主要包括一大片遍布该组织的具有数量较少的高度分工细胞(软骨细胞)的细胞外基质(ECM)。ECM的主要成分是水、软骨聚集体和II型胶原。软骨聚集体包含透明质酸(HA)、可聚蛋白多糖(大的软骨特异性蛋白多糖)和链蛋白(LP)(一种小的糖蛋白)。可聚蛋白多糖包含一个连接有约100条硫酸软骨素(CS)链的中心核蛋白。该核蛋白有三个球形域,其中N端球形1(G1)域具有连接HA和LP的连接位点。LP与可聚蛋白多糖的G1域的序列有同源性,并且包含连接HA和可聚蛋白多糖G1域的连接位点。各软骨聚集体都包括一条连接有上百个可聚蛋白多糖/LP双体(duplex)的HA链。1/5体积的大型软骨聚集体自由溶液陷在紧密的II型胶原纤维网格内,无法进一步膨胀。正是这种分子结构赋予该组织如上所述的机械特性和功能。
膨胀压力——软骨聚集体中的HA和CS链包含重复的羧基和/或硫酸基。溶液中,这些基团变成离子形式(COO-和SO3-),生理环境下它们需要Na+等阳离子来维持整个中性电荷。间隙水内的这些游离离子的浓度比周围流体(即滑液流体)的离子浓度高,因此产生渗透压(Donnan压)。软骨中,相反阴性反离子(即HA和/或CS链上的COO-和SO3-基团)的固定性及维持电荷中性的需求使得离子不能沿该浓度梯度流出软骨组织。无伸展性胶原网格抑制水流入软骨组织平衡浓度梯度,以预防进一步膨胀。
另外,紧密的软骨聚集体包使固定的负电荷基团仅间隔10-15埃,导致电荷间产生强大的斥力(电荷斥力)。由于Donnan作用,要减小这些斥力的膨胀趋势受到无伸展性胶原网格的抑制。当挤压时,电荷基团之间的距离减小,因此电荷间斥力增大,并且游离的阳性反粒子的浓度也增大。所以Donnan和电荷斥力作用因挤压而增强。这两种作用使关节软骨具有压制膨胀及抑制变形和吸收挤压负荷的能力。
压力防护作用——关节软骨常被描述成一种有黏弹性的两相材料,其包括固体相(软骨聚集体、胶原等)和流体相(水和溶解的离子)。关节软骨的ECM的大分子构造具有使负荷时受到的外力从易磨损的组织固体相转移给抗磨损的流体相或水的功能。具有这种压力防护,是由于软骨ECM的这种绝妙设计所致,其产生的材料的渗透性极低,在间隙流体流动时起拖拽作用。受到挤压负荷时产生间隙流体压力,动态负荷时,它主要负责利用基质抗压来支撑负荷。压缩时,多孔结构进一步缩小,使已经很高的摩擦拖拽力增加。该负荷支撑逐渐从流体相(随着流体压消失)转移到固体相。通常对于正常软骨来说,这种平衡过程需要2.5-6.0小时完成。所以,通过流体压力来支撑负荷在组织内占主导地位。
对人造材料的需求含水量增加,蛋白多糖量减少,这是骨关节炎软骨早期最明显的变化。这些变化导致组织渗透性增加。渗透性增加削弱了软骨中支撑负荷的流体压力机制(压力防护),从而需要胶原-可聚蛋白多糖固体基质来承受更多负荷,这可能是导致软骨退化发生和发展的一个重要起因。生物人造替代软骨不是模拟正常、健康的关节软骨的第渗透性,而是可以被类似机制预先发生退化。
整形外科手术面临的最艰难挑战之一是对局部软骨损伤患者的治疗,对于整个关节替换来说,他们还太小或者非常活跃。这些局部软骨缺损可能非常虚弱,局部修复而非整个关节替换是意义重大的优选之举,因为不仅减小手术需求、缩短痊愈时间、降低花费,而且减缓或阻止负荷承受区进一步恶化。
本实验演示酪胺代HA(T-HA)水凝胶在修复这类局部软骨缺损方面的应用。
实验说明有预期特件的细胞外基质材料的设计天然的关节软骨具有上述弹性及物化特性,这些特性赋予软骨吸收机械负荷和从软骨下骨转移冲击负荷的独一无二的能力。用本文公开的T-HA水凝酸生产合适的人造软骨材料的重要一点是,通过谨慎选用试剂浓度、交联条件、引入的活细胞及其它分子等,为水凝胶设计大分子网格以模拟尽可能近似的特性。
T-HA水凝胶的限制性抗压试验结果(见例3)初步提供了用于合成其特性与正常关节软骨特性相匹配的合成T-HA材料的基础。实验结果还显示通过一种分子式的T-HA所能制成的材料特性的光谱。在这些数据基础上,根据以下标准选用包括二酪胺交联的透明质酸的大分子网格在内的T-HA水凝胶来生产植入软骨人造材料。
由于单使用HA作支架材料(例3)有可能形成具软骨抗压性的水凝胶组合物,而且如果用HA作支架,可以避免宿主可能对可聚多糖蛋白中蛋白成分产生的反应,所以可选用仅包括HA的材料。控制反应条件(酪胺/EDC比例),以产生5%的酪胺替代物(例2),这一比例可保证充分交联得到具有软骨抗压特性的材料(例3),同时大部分天然的HA结构保持不变。如例1所示,HA用约5%酪胺替代,不过为节约试剂,HA溶解量改为5mg/ml,而不是1mg/ml。其它所有试剂的绝对浓度保持不变,这样酪胺和EDC的摩尔浓度是HA羧基基团的2倍而非10倍。无菌生理盐水中HA浓度定为125mg/ml,因为生理盐水中这一浓度产生的抗压聚集体系数最接近关节软骨(生理盐水数据未显示)。另外与我们合作的临床医生们开展的实验中,也认为该浓度最合适。应用前,在下述原位交联方案中加入过氧化酶10U/ml。选用原位交联方案是因为这一方案中与周围软骨基质结合的机会最佳。而且外科手术产生的软骨缺损的填充更为容易和完全,并不需要知道或测量缺损的确切尺寸。预制(体外交联)块或者需要确切尺寸,或者需要对预先形成的形状进行雕琢以保证与缺损吻合。本实验没有加入细胞或生物活性因子,因为本实验是要对不受加入细胞或生物活性因子产生的复杂因素影响的水凝胶进行评估。不过,如上所述可以加入细胞或生物活性因子来产生预期的效果。
手术过程手术前——在Yucatan小猪(约7-8个月大,约30-35kg)到达生物资源单位(biological resource unit)后,圈养至少7天以保证完全适应环境。用麻醉剂克它命(20mg/kg)和预防抗生素Ambipen(40,000U/kg I.M.)进行术前用药后,因为要同时对两侧两个膝盖进行手术,所以切开该动物的后腿,用Betadyne染料涂上颜色。通过氧气管吸入异氟烷(1-2.5%体积)保持全面麻醉。按需使用戊硫代巴比妥(达到25mg/ml I.V.)。手术期间,监控该动物心律、呼吸率、体温等。
切口——沿纵向中线在皮肤上开个口,然后通过膝盖骨囊快速下切。使用电烙止血。确定膝盖骨侧面,切开一侧平行的膝盖骨。侧边的韧带和肌肉组织用1号vicryl缝线做上标记。膝盖骨从中间脱臼暴露出股骨滑车。
软骨修复——参见图6,用mosaiaplasty凿和锋利的弯曲形锐器(currette)在股骨软骨(图6A板)的中间滑车面上制出两个环形的完全厚度的软骨缺损(直径约4.5mm,图6B板),尽量小心不要破坏软骨片。按如下原位交联T-HA水凝胶(生理盐水中125mg/ml)法填充缺损,产生具有如上所述组合物的水凝胶植入体,以重新产生经体外测出的所述天然软骨的抗压性。
首先,每个缺损用0.6%过氧化氢0.01cc清洗,然后立即用无菌纱布吸干。随后外科医生将含0.15cc没有交联的水凝胶糊(图6C)的填充物(所含组合物及其制备如上所述)插入,用来填充各缺损,并用指尖抹平水凝胶植入体表面,与关节表面外形吻合。把一张在0.6%过氧化氢中浸湿的无菌过滤纸(Whatman 50)压在水凝胶植入体表面5分钟使缺损内水凝胶交联。5分钟期间,过滤纸在植入体上来回摩擦以免与植入体结合,并且有效地将植入体表面擦亮。5分钟后拿走过滤纸,削去多余的水凝胶,将约0.01cc 0.6%过氧化氢(1滴)加到每个植入块表面(图6D)。膝盖骨在股骨滑车上上方通过解剖方式减小。将膝盖骨脱臼,再次减小以确保水凝胶的可靠重要的稳定性。
缝合——用无菌生理盐水冲洗关节。用vicryl缝合线缝合各层伤口。具体的操作是用间断1号vicryl缝合线缝合关节切口。用间断2-0vicryl缝合线缝合皮下组织,用间断3-0vicryl缝合线缝合皮肤层。对动物术后活动没有限制。
手术后——手术后动物立即回到全负重。24小时内用丁丙诺啡(buprenorphine)(0.02mg/kg LM)止痛,术后3天内使用芬太奴片(50mcg/小时)止痛。每天服用术后预防抗生素头孢氨苄500mg两次,连续7天。动物保持传统的动物饲养。
植入后数据——植入后一个月,全麻后用过量的巴比妥类药物Beuthanasia D Special(1ml/10kg B.W.,LV.)对受治动物实施安乐死。安乐死后,将整个膝盖关节小心地切开,肉眼观察,并照相记录。如图7所示,1个月时候肉眼观察膝盖,发现没有明显的渗出液,没有明显的炎症反应。伤口局部充满白色材料(植入的T-HA水凝胶和其他可能在术后进入水凝胶的因子或细胞),除了在相对的关节表面上有轻微磨损外,周围的关节软骨和相对的关节表面(股骨)外观正常,参见图7B。无法证明该磨损是与植入体摩擦的结果,尤其是该磨损位于股骨所在位置看起来不像在正常关节接合期间与植入体摩擦。
结果表明,用于原位水凝胶交联的过氧化氢或过氧化物酶反应对关节健康没有产生明显的不利影响,并且显示出本文公开的、包括二酪胺交联的透明质酸大分子网格、作为人造的可植入细胞外基质用作人造的体内软骨替代物或植入材料的水凝胶的功效。
实施例7进行以下实验,将上述T-HA水凝胶植入犬兔模型以修复声带缺损和增加声带。以下对本申请的背景知识做一简短讨论,然后对本实验方法和结果进行说明。
背景知识组织介绍声带是在极细神经纤维控制下的复杂的多层结构。声带上方的粘膜由非角质化的多层鳞片状上皮细胞构成,上皮细胞深处有一多层固有层。固有层下方是由甲杓肌构成的粘膜层,甲杓肌先插入甲状腺软骨,而后插入杓肌软骨的声带突。甲杓肌能变得僵直或松弛,可改变固有层上的紧张度,继而改变上皮细胞的振动力,而产生负责高嗓音的可精细调节的振动。
人发声的生物机制是由固有层的细胞外基质(ECM)内天然存在的某些生物大分子作用产生。透明质酸(HA)是一种普遍存在的分子,大部分集中在声带、滑液流体、脐带、真皮和软骨等专门组织中。其功能多样,影响到组织黏弹性、撞击吸收、伤口愈合以及间隙填充。
从HA的独特结构可以阐释出它的多项功能。在其重复的双糖链上包括D-葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺,双糖链包含多达30000个重复双糖单位,分子量超过10道尔顿。由于HA是多聚糖,不是蛋白质,所以它是非抗原物质。生物条件下,HA是带有负电荷、随机缠绕的多聚体,所占体积比根据单独的分子量和成分所预期的大1000多倍。强负电荷吸引阳离子和水,使得HA表现为极易与水结合的凝胶形式,并具有独特的黏弹性和撞击吸收特性。
声带黏弹性是发出高嗓音的基本要素,因为它直接影响发声和声音维持以及声带基本频率的调节。人声门中的HA集中在固有层,通过比较尸体在HA存在或不存在时声带的生物机械特性可将HA的重要性进行量化。用透明质酸酶治疗声带可使声带僵硬度平均降低35%,高频声带黏弹性平均降低70%,从而说明HA在这些组织中的重要意义。
对人造材料的需求声带修复——声带缺损对发声有严重的影响。或者是新发生,或者是手术干扰,声带内异物块破坏负责高嗓音的细微调节的震动。新伤口患者通常在发病早期出现,由于长期嘶哑。当出现早期恶化过程(T1-T2in the Tumor,Node,Metastasis staging system),患者接受包括外部光束放射线治疗或内窥镜手术。
这些患者得到建议,即恶劣的术后嗓音是有效根除肿瘤的可预见的副作用。当假设出现良性过程时,患者则面临手术治疗经常产生由伤口本身引起的难听的嗓音的难题。遗憾的是,目前标准的喉部手术技术不能有效去除良性或恶性损伤cannot provide for effectiveremoval of either benign or malignant lesions without causingpoor vocal outcomes secondary to vocal fold scarring.这是由于喉部独特骨骼内伤口愈合机理所致。声带的表面振动面因术后伤疤而遍布到更深层,防止生理发音振动。
人喉内HA集中在固有层,一个将发声肌肉与上方上皮组织分离开的组织层。固有层使上皮细胞在紧张的发声肌肉上振动,就像池塘上的散开的涟漪。声带出现良性或恶性损伤时,粘膜波被破坏。甚至在正常的痊愈过程中,伤疤带和杂乱的胶原tether表面粘膜波到声带的更深层,破坏了正常的粘膜波和使发声困难。HA的撞击吸收性使其充当组织减音器,保护粘膜表面在发声时免受摆动伤害。HA还似乎通过减小纤维化和结疤来帮助伤口修复,从而保护声带免受外伤引起的长久损害。
随着使声带上完整地振动发声表面经历激光或冷外科治疗后恢复技术的发展,伤口使大量具有良性和恶性过程的患者群能接受肿瘤治疗,预期获得史无前例的术后说话的成果。
声带扩张——各种症状和疾病对喉功能、声音质量和交流能力造成负面影响。美国约700万人发声困难或嗓子损伤,其中很大一部分受声带局部麻痹或麻痹影响。由于手术期间会不小心损伤迷走神经或喉返神经,所以估计美国1-4%心脏和甲状腺手术会引起声带局部麻痹或完全麻痹。
影响声带功能的其它症状有单侧声带麻痹(UVP)。UVP中,没有知觉的声带位置不正。由于对抗喉内收肌和外展肌的紧张,当伴随神经损伤立即产生中间化时,麻痹的声带快速侧移到靠近中央的位置。喉返神经损伤后,杓状肌软骨下垂到喉内,导致声带的垂直高度发生变化,另外动态紧张减小导致声带成弓形。由于杓状肌因缺少神经刺激而萎缩,所以随后出现声带缩短和弯曲的萎缩现象。由于萎缩和侧移,对侧的声带不能与麻痹的声带接触,导致出现UVP症状。
症状表现包括带呼吸声的嘶哑、轻微咳嗽、不能用力屏气(valsalva)(保护气道)、吞咽困难。并发症包括误吸(固体和液体)和肺炎复发。由于肺部感染复发率增加,可能导致出现对生命有威胁的病症。
正常发声时只需要一个有功能的声带,所以成功的治疗包括麻痹声带中间化,使该声带能与对侧可动声带接触。这可以使发声正常,并且防止误吸,使发生吸入性肺炎的风险降至最低。声带麻痹目前采用两种方法治疗颈部张开法(open trans-cervical approach)或者口腔内窥镜声带注射,又称为喉成形注射治疗(ILT)。Ishiki-I型喉成形术是最常用的开颈法,在甲状腺软骨开一个“窗口”,将硅橡胶植入体置入麻痹声带萎缩体内,有效将它推倒更正中的位置。这个手术会产生永久的效果,不过并发症包括植入体移动、突出或感染。
ILT中,通过内窥镜注射外源物将麻痹声带居中。目前使用各种各样的人造和生物材料,因为用于治疗UVP的注射体包括明胶海绵、羟磷灰石、自体脂肪、非细胞死尸真皮(Cymetra)、胶原或Teflon/Gortex。遗憾的是,经证明这些材料均不太理想,不能满足对理想材料和长期声带扩张所需要的所有标准。因为存在这些局限性,所以需要利用再注射或额外注射法以解决音量损失问题。
有生物相容性的可注射材料,如本文公开的T-HA水凝胶能设计用来模拟天然声带组织的流变特性,并在体内持续存在不会移动。调整对本文所述的T-HA水凝胶的化学和材料特性的设计,使其成为可注射的生物植入体,通过谨慎选择上述成分浓度和交联方法使其专用于ILT等耳鼻喉治疗。
有生物相容性、使用期长的合适材料还有益于治疗先前存在的因外伤而变大或随年龄增长而同时增大的脑沟或疤痕。这样的材料还可能替代生理盐水,在声带手术前方便地用作诊断和手术辅助剂。按照常规,生理盐水注射到声带固有层的HA基质内。操作如下a)确定伤口是否在韧带下方,b)增加伤口和韧带间的距离(冷器械),或者使用散热装置(激光),使手术更容易操作。因为有韧带,所以手术变得复杂,如果可能的话,要避免穿过韧带。在用于增加固有层中HA量并减少引起疤痕的胶原量的水凝胶中引入肝细胞生长因子可能有益于以上手术过程。
实验说明具有预期特性的细胞外基质材料的设计理想的用于声带扩张的人造基质或生物材料具有以下特征1)生物相容性,不会出现不利的免疫反应;2)容易注射,便于医生通过小针头控制精确量和注射定位;3)用最小制剂量,容易可行,时间效率最佳,门诊办公室的设施配置下可潜在应用4)具有与被扩张以使扩张结构的天然功能改变极小的声带组成相同和类似的生物机械特性;5)能抑制吸收或移动,以维持最初的扩张结果;以及6)在矫正手术中容易摘除。
本文公开的T-HA水凝胶满足该6项标准,最重要的是,通过谨慎选择反应物/合成参数和GAG(如HA)浓度,产生必需的大分子网格以生产具有预期粘弹性和生物机械特性的水凝胶,从而可调节T-HA水凝胶的生物机械特性。具体地说,体外和体内初步研究的结果与上述标准相比,已得到理想的比较结果。第一,T-HA水凝胶移植到鼠、兔、狗和猪等各种动物内都未显示有宿主免疫反应。第二,用于固有层或肌肉层中声带扩张的所需浓度的未交联的T-HA水凝胶很容易通过21号针头。
第三,医用级HA容易可行,在FDA批准的Healon和Restylane等制剂中已使用了很多年。另外,未交联的T-HA水凝胶和过氧化氢(交联剂)溶液很容易预先制备成不需要医生制备的现成制剂。第四,本文公开的T-HA水凝胶能制成与包括固有层、甲杓肌和甲状腺或杓状肌软骨的声门的各种组织的机械特性相配合。第五,体内实验中,T-HA水凝胶的独特交联和非蛋白特性显示出能抑制体内吸收,说明最初的扩张结果可以维持。最后,通过本文公开的非免疫蛋白驱动的交联构造,使通过新颖的原位交联方案进行固体连续植入的形式成为可能,这种形式将阻止移动,并使翻修手术所要进行的定位和水凝胶植入体摘除操作变得容易。
关于以上第四点,T-HA水凝胶的限制性抗压试验结果(见例3)初步提供了用于合成合适的、具有与正常声带组织特性相配合特性的人造T-HA材料的基础。根据这些数据,根据以下标准选用包括二酪胺交联的透明质酸的大分子网格在内的T-HA水凝胶来生产可植入的人造声带修复或扩张材料。
支架材料(单用HA)、一定比例的酪胺替代物(约5%)的选用,HA的酪胺替代方案(根据例1改进)以及不引入细胞和生物活性因子如例6所述。无菌生理盐水中T-HA水凝胶的浓度范围在2.5-10mg/ml之间与声带固有层的流变、振动特性最相符。根据与我们合作的外科医师们利用声带组织和用于声带修复和扩张的其他材料开展的广泛临床实验认为2.5mg/ml T-HA水凝胶是最理想的。我们的合作医师们用利用其他修复和扩张声带的可注射材料的实验中,使用体外交联水凝胶,未使用原位交联方案。体外交联如例1所述。根据下述兔、犬实验结果,本发明者认为使用本文公开的水凝胶材料进行声带扩张的优选实施例是使用最适合注射到声带更深层的肌肉层的原位交联方案和一定浓度的T-HA。
手术步骤手术前——在杂种狗或新西兰白兔(依实验而定,如下所述)到达生物资源单位后,关养7天,让它们保证完全适应环境。根据准用IACUC方案进行术前用药和全身麻醉后,每个动物插管保持在手术麻醉III期。让动物仰卧。抓住舌头后,先让舌头缩回,而后放置Dedo喉镜,要保证清楚地看到喉部。喉镜尖要放在靠近真声带上表面几厘米的位置。刚性视频喉镜放在真声带上方,可以完全进行喉部检查和照相。
声带修复——为了进行声带修复,将狗的两个声带中的两侧显微瓣抬高,然后制造相关于50%声带的软组织缺损,包括固有层和下方肌肉。一边用T-HA水凝胶进行软组织重建(填充),而相对侧一边作为不修复(不填充)对照。然后将显微瓣再挂在水凝胶上,使上皮细胞可完全连续。该研究使用如上制备的接近固有层流变特性的含2.5mg/ml体内交联的T-HA水凝胶的生理盐水(5%替代酪胺)。手术后,将狗解除麻醉,转到恢复室。按照IACUC方案,进行止痛,1-2天。
喉成形注射治疗(声带扩张)——麻醉过后,使用27号喉针向兔的左前后膜状声带处注射2.5mg/ml间接体内交联水凝胶生理盐水约0.25ml(5%替代酪胺),在固有层的表面层进行注射。
根据使用狗(声带修复)和兔(ILT)进行的上述实验结果,本发明人认为以下是使用本文公开的水凝胶进行声带扩张的优选实施例。对于ILT来说,向侧移和萎缩声带的甲杓肌层注射50mg/ml未交联的T-HA水凝胶生理盐水(5%替代酪胺)和过氧化物酶。优选的是,使用一个水凝胶团可获得预期的中间化结果,到不要超过两个。用21号喉针注射水凝胶。用27号针头向21号针植入的水凝胶团中心注射少量稀释的过氧化氢,进行交联,为了定位,不要将针头抽回。几分钟内水凝胶交联成固态植入体,并且通过触摸可以确定。手术后,手术后,将狗解除麻醉,转到恢复室。按照IACUC方案,进行止痛,1-2天。安乐死时,将每只动物的声带小心切开,肉眼评估并照相记录。
植入后数据声带修复——安乐死时,小心切开狗的声带,肉眼评估并照相记录。通过咨询病理学家,根据组织学方法,具体注意炎症浸润现象、HA染色(正常基质产生)、水凝胶染色和胶原染色(疤痕)来评估伤口痊愈程度。图8显示有代表性的对照侧(未填充)和实验侧(T-HA水凝胶填充)声带的组织学结果,手术后三个月其中一个狗的声带用阿利新蓝(alcian blue)染色。总的观察表明,与未治疗对照相比,用T-HA水凝胶治疗的声带的外观和振动特性较为正常。组织学结果表明,与实验修复声带的经T-HA填充的伤口痕迹比较,未治疗的对照声带在沿伤口痕迹处有明显的疤痕,说明缺少GAG沉淀(即HA),胶原沉淀增加。
12周时在实验声带上仅能发现一小点T-HA水凝胶症状,说明与观察到周围肥大细胞层发生极小的异源体反应。这可能表明T-HA水凝胶随着含HA的正常组织基质沉淀而分解。但是,如果本研究中使用低浓度(2.5mg/ml),因而有很强流动性的水凝胶,则由于上皮显微瓣与相对的下方组织紧密接合,更有可能出现多数水凝胶在伤口部位闭合前从该部位流失。可精确预测显微瓣和相对下方组织之间的水凝胶,来抑制导致水凝胶从伤口部位流失的接合过程。由于只有一薄层水凝胶停留在伤口部位,而没有最初植入的水凝胶填充团,因此认为可以看到的积极的伤口痊愈效果。这些结果表明水凝胶能组织疤痕产生,并与固有层的流变特性相配合。
喉成形注射治疗(声带扩张)——安乐死时,小心切开兔的声带,肉眼评估并照相记录。通过咨询病理学家,根据组织学方法,来评估炎症反应和水凝胶保持力。图9显示了有代表性的组织学结果,其中对接受扩张手术的其中一只兔子在术后2周用阿利新蓝(alcian blue)染色以检测水凝胶,用苏木素伊红(HE)染色检测总的形态。如图所示,2周时在注射的声带内能发现水凝胶孔,这显示与观察到的周围肥大细胞层有极小的异源体反应发生。
进行以下实验,将上述T-HA水凝胶植入兔模型以填充眼睛的玻璃体腔,从而预防或治疗玻璃体视网膜疾病,如视网膜脱落。以下对本申请的背景知识做一简短讨论,然后对本实验方法和结果进行说明。
背景组织介绍和对人造材料的需求视网膜脱落、糖尿病性视网膜病变等玻璃体视网膜疾病是导致失明的最常见病因。眼睛玻璃体腔一般充满胶状物质。视网膜脱落手术中,手术摘除玻璃体(称为“玻璃体切除术”),视网膜重新复位在眼睛后壁上,将替代物注射到玻璃体腔内。玻璃体替代物在眼睛的玻璃体腔内发挥多种多样的不同作用。包括(1)获得长期的填充物,在视网膜复位术后保持视网膜与眼睛壁平行;(2)在例如展开视网膜裂孔的手术过程中,清除视网膜下面的流体和浮动,除去移位的眼内聚焦结构;(3)用于研发一种能长时间在眼睛后段维持治疗药物水平的缓释系统。
视网膜复位手术后可使用大量的不同化合物作玻璃体替代物。这些化合物具有使视网膜成功复位的物理特性,但是不能获得其他重要的手术目的。向眼睛内注射气体能短时间内用作视网膜填充物,但很快就被吸收,而引起光学畸变。碳氟化合物液体是手术中把脱落视网膜弄平的有效工具,但将其留在眼睛内,长时间后会引起非耐受性毒性。硅油可用作中等时期的视网膜填充物,但也有毒性风险,并引起明显的光学畸变。
另外,替代性玻璃体化合物还要求在眼睛内使用安全的长期或控时释放药物运送载体。许多眼睛的炎症和感染病,如结节病、先天性后段葡萄膜炎和巨细胞病毒性视网膜炎,有必要进行眼内医疗注射。眼内重复注射会导致流血、视网膜脱落和感染等危险。所以需要有一种稳定、无毒性载体用作玻璃体内药物缓释载体。
透明质酸(HA)是非细胞性物质,是人和其它哺乳动物的天然玻璃体的基本成分。一些眼外科过程中已经使用了透明质酸制剂。例如,透明质酸钠是后段和白内障手术中最常用的粘弹性手术设备。遗憾的是,透明质酸钠和其他先前试验的透明质酸替代物在人组织中能很快溶解。这些物质并不能证明在玻璃体手术中有效,因为它们不能作为视网膜长期填充物。
试验说明具有所需性能的胞外基质材料的设计最常见的玻璃体替换需求是在视网膜脱离手术中。大的难题是使视网膜在手术后的时间内能在眼壁平坦的保持很长的时间。理想的玻璃体替代品是光学清晰的,从而在恢复期间能够最大限度的视觉复原。最后,视网膜脱离发生在眼睛的下面,从而也造成一定的困难。为了使视网膜在手术后保持平坦,玻璃体的置换必须直接和视网膜破碎的区域并列。为了填塞下面的缝隙,病人经常手术后必须脸向下躺数周。目前没有合适的玻璃体替代品能够满足所有临床需要。
因此,实践中需要无毒、光学清晰的玻璃体替代品,从而可以改善外科手术效果和经受视网膜脱离手术的病人手术后的视觉恢复。
本发明公开的酪胺取代和交联的透明质酸(T-HA)大分子网络制成的水凝胶是合成玻璃体的一种理想选择。具体的,此处所述的、使用过氧化酶和H2O2交联酪胺取代透明质酸大分子的新的酶驱动交联化学可以使得得到的水凝胶在体源(ex vivo)内交联,并保持动物组织的稳定。例如,对老鼠的研究证实在皮下注射(参考实施例9)后,这种材料几个月后仍不降解。在低浓度时,水凝胶是光学清晰的,可以很容易的通过注射器或玻璃体切除手术口注射,水凝胶的比重大于水。这些物理性能使得T-HA是玻璃体置换时的理想替代品。
根据实施例3封闭抗压测试的数据,可以设计出T-HA水凝胶,以及酪胺交联的透明质酸分子的大分子网络,并具有和天然玻璃体材料匹配的弹性和其它物理性能,从而可以获得合成的、可移植的玻璃体替代品。
支架材料(单独的HA)、一定百分比的酪胺取代(~5%)、HA(实施例1改进的)的酪胺取代方案和不包含细胞与生物活性的因素的选择在实施例6中进行了公开。浓度为2.5-10mg/ml的T-HA水凝胶盐溶液基本和眼睛中玻璃体的流变力学、光学(清晰度、折射指数)和比重(密度)等性能相匹配。根据我们临床合作者丰富的临床经验,浓度为10mg/ml的T-HA水凝胶被认为最适合的。由于视网膜薄的、高度特殊的细胞层的潜在敏感度,根据我们临床合作者的经验,使用体外交联的水凝胶,而不是原位交联的方法。实施例1中公开了体外交联。手术时在交联T-HA中加入不溶的类固醇,使外科医生看得更清楚,这是因为水凝胶材料本身是光学透明和无色的。
手术过程用标准的视网膜外科手术对兔子进行单侧玻璃体切除手术(左侧眼睛的留下),同时用上述的T-HA水凝胶替换眼睛天生的玻璃体,以评价水凝胶材料作为玻璃体替代品的情况。用下述方法进行麻醉(克他命50mg/kg;甲苯噻嗪5mg/kg),在无菌的情况下准备好老鼠并用手术布盖好。用mydriacyl和苯肾上腺素使左眼张开。手术前后在眼睛中慢慢加入两滴Ciloxan点眼液。慢慢滴入proparacaine点眼液。在显微镜下操作,用wescott剪刀进行270°的结膜修补(conjunctival peritomy)。在明显边缘的后面2.5mm处开一注入口,用7-0vicryl缝合线将注入管安全的附到巩膜上。用7-0vicryl缝合线将将透镜圈缝合到巩膜上。在透镜环上放置A 30°的棱镜玻璃体切除术透镜。开一第二注入口,在玻璃体空腔中插入玻璃体切除术的装置。进行完全是玻璃体切除术。此时将其中一个注入口用7-0vicryl缝合线缝合。将BSS瓶尽量放平,将瓶中的~1.2cc的3mg/ml的防腐剂去炎松丙酮化合物(类固醇)和T-HA水凝胶(10mg/ml,5%的;酪胺取代)混合物用18规格的注射器注射到玻璃体腔中。玻璃体切除术后,和正常一样注入类固醇,类固醇的乳白色可使透明的水凝胶材料看得清楚。由于主人了乳白色的溶液,它使得玻璃体腔的填充看得清楚。当填充50%或看到T-HA材料在冲洗导管动堆积(100%填充)时停止注入。玻璃体腔填充后,用7-0vicryl缝合线缝合剩下的开口。用8-0vicryl缝合线缝合结膜。缝合后,将杆菌肽涂在眼上。局部的抗生素/杆菌肽药膏用于眼上bid×1周,然后将兔子放到恢复笼中。当兔子恢复后,再将其放到喂养笼中。
移植后的数据移植后1个月,兔子用克他命(50mg/kg;10mg/kg/hr随后)甲苯噻嗪(5mg/kg;0.5mg/kg/hr随后)麻醉,瞳孔用滴眼液(1%tropicamide;2.5%苯肾上腺素)张开,角膜表面用点眼液(0.5%proparacaine)麻醉。瞳孔完全张开后,用间接的检眼镜检查法和眼底镜检查法对视网膜和眼睛的状况进行检查。此外,用Tonopen检测眼压(IOP),Tonopen是用于临床的设备,和角膜表面的接触最小。最后,在黑暗中将兔子放在加热垫上1小时,视网膜电流图(ERGs)用于记录对照眼睛和玻璃体替换的眼睛对闪光的响应。ERG电极由角膜接触透镜和两个铂0.5英寸的Grass针电极组成,放在面颊和躯干上。还在麻醉的情况下,用安乐死D Special(1ml/5kg)的静脉剂量对兔子实施安乐死。然后将对照眼睛和玻璃体替换眼睛剜出,用10%的缓冲福尔马林固定24小时,进行组织学分析。
和正常的IOP相比,移植1个月后的结果表明外科手术处理的眼睛手术后的感染最小。一周时,和没有手术的眼睛相比,以及在试验的眼睛的后部产生有限视觉的BSS对照手术相比,玻璃体替换的眼睛出现了白内障。眼截面的观察表明白内障在玻璃体替换眼的前部(图10)。通过观察(图10),眼睛前部剩下的部分和所有的后部看起来类似。移植后1个月时水凝胶从试验眼睛中恢复,水凝胶是一清晰的类似凝胶物质,和注射前的形式类似(图10)。玻璃体替换眼的ERG和未手术的对照眼相比是正常的,这表明视网膜细胞是活的,功能正常(图11)。最后,和正常的未手术的眼睛相比(图12),视网膜四个象限的电子显微图片表明玻璃体替换眼的视网膜组织是正常的。这些数据表明T-HA水凝胶可用用于玻璃体的替代,而且不会引起眼睛的感染或发炎,不会损害视网膜,这表明T-HA水凝胶填塞视网膜的方法可用于视网膜脱离的再粘附。
相关的眼科应用除了前述的视网膜填塞应用和接着的视网膜再粘附手术外,本实施例中的T-HA水凝胶也可用于下述相关的应用■作为外科手术进行时发生的玻璃体替换,如视网膜破裂的伸展、视网膜下液和漂浮的除去、以及脱离的眼内晶状体的除去。
■作为结合持续释放的给药系统的玻璃体的替换,从而长时间在眼后部保持治疗药物量(类固醇、抗生素、抗病毒药物,等等),从而治疗眼睛的慢性炎症和感染,如类肉瘤病、先天性的后部葡萄膜炎以及细胞巨化病毒视网膜炎。
■用于前部的手术,包括作为角膜折射手术的塑料聚合物插入物的替代。这些外科移植在角膜中的插入物用于改变角膜的形状和矫正轻微近视。光学清晰和生物相容性的T-HA水凝胶和人体组织一起可以很好的用于这种用途。
■作为角膜移植手术中部分或全部厚度的替代,如前部手术、由于感染造成的角膜疤痕、圆锥形角膜或其它原因。光学清晰等物理性能的水凝胶可以用作角膜组织的替代品。
■用于前部和白内障手术中的粘弹性装置。低浓度时,水凝胶可用保持前腔的形状和压力,从而允许外科医生清楚的看到眼睛的结构。
■眼眶整形手术,包括皮下注射除去面部皱纹。
■用于经受剜出或摘除手术病人的眼部移植的眼眶整形手术。在人眼中形成的水凝胶可以用于植入填充眼眶,从而改善眼球摘除后的外观。
■用于涂敷玻璃体-视网膜手术中使用的MEMS装置。
■用于扩展激光视觉矫正手术(LASIK)的应用,包括如下情况角膜体积需要增加而不是通过除去进行矫正视力。矫正的激光手术可以用于产生理想视觉效果所需的合适尺寸,接着有意植入超过尺寸的水凝胶塞。
■作为典型麻醉剂(typical gases)的替换,过碳氟化合物液体和硅油通常用于眼科手术的填塞。这些应用包括但不限于以下应用巨大视网膜破碎、增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)、“鱼嘴”现象中的大破裂、后期破裂或斑点洞、视网膜下液排出后的眼内体积的恢复、多次破裂和大折叠(large meridional folds)的视网膜的全脱落、眼内损伤引起的或PVR复杂化的或相关脉络膜损伤的视网膜脱落、脱落的晶状体、脉络膜上和黄斑下出血、物PVR的孔源性视网膜脱离、严重的类风湿糖尿病视网膜病、压力过低的慢性葡萄膜炎和传染性视网膜炎。
实施例9进行了如下试验,其中上文所述的T-HA水凝胶填充剂皮下植入到免疫活性鼠中,从而考察和证实这些材料在体内的持久性和寿命,以及检测宿主的免疫反应。如上所述,含有交联大分子网络(如酪胺取代和交联的透明质酸网络)的水凝胶能够制成物理和粘弹性能范围广泛的材料。例如,这些材料可以调制成模仿天然软组织,病可以用于软组织缺损的修复和强化,以及用于整形手术或从重建手术。具体的,如实施例3和4所述,材料的粘弹性、硬度和其它物理性能可以大范围的调制,从而模拟天然软组织的多样性能;该材料可以形成或铸成多种复杂的解剖形状,从而成为理想的塑造替代或重建组织的组成,如面部重建中耳朵或鼻子的形状。
从上述实施例已经清楚的认识到,这些材料可以塑造成合适的形状,同时具有合适的物理性能,本发明证实了将T-HA水凝胶用作合成组织基质或体内替代材料的可行性。简单的背景讨论后,对试验、包括试验方法和得到的结果进行说明。
背景组织说明和合成材料的需求用于头部和颈部重建和软组织的增加的生物材料对于塑料和重建性手术领域仍是主要的挑战。对合适材料和生命周期的材料进行重大研究和投资。当前组织工程中的焦点是试图将纤维原细胞和软骨细胞培养液作为一种在移植中生成内生软骨和胶原质支持结构的方法。这种方法的原型用后背上有一新型软骨耳朵的裸体老鼠。其基础是聚乳汁和聚乙二醇酸结构框架的软骨细胞培养液。前提是软骨细胞能产生软骨的胞外基质(ECM),以及能生成完全相容的新型功能的生物填充剂。这项研究的结果的临床应用并不乐观。当放到免疫活性动物中是,新型软骨的结构完整性由于被吸收而遭到破坏。基本上,当软骨细胞可以成功培养和繁殖时,软骨细胞不能在宿主自卫机能引起的水解前在框架上生成软骨。
通常,临床医生限制使用异种材料如牛胶原质和没改型的水凝胶(HA),以及合成材料如硅烷、硅橡胶和羟磷灰石。合成材料容易导致排异反应和感染,而生物底物一定时间后容易分解。此外,合成PTFE(gortex)聚合物和硅橡胶的组织反应活性较小,也不提供组织完整性,从而对排异反应有一定的风险性。
本发明公开的水凝胶以该材料提供软骨功能和感觉的材料(HA),而不是软骨细胞需要产生软骨ECM组织工程模型。在本发明中,透明质酸直接用作底物产生替换天然HA-富含软组织的稳定的工程材料。事实上,此处使用的HA为基础的水凝胶结合了产生软骨形式和结构特性的相同材料,但是进行了改型(酪胺取代和交联),从而防止该材料发生生物降解。因而得到了适合体内移植和长寿命的理想的合成胞外基质材料。
试验说明具有所需性能的胞外基质材料的设计将本发明的HA材料作为头部和颈部重建的合成软组织和软骨替代物需要注意以下几点1)用透明质酸作为支架材料的酶选择交联水凝胶的优化;以及2)TOHA水凝胶作为软骨替代和软组织填充剂的应用。这些包括体内交联水凝胶效果特征。
再次根据实施例3封闭抗压测试的数据,可以设计出T-HA水凝胶,以及酪胺交联的透明质酸分子的大分子网络,并具有和天然软组织材料匹配的弹性和其它物理性能,从而从而适合体内鼠移植,以测定它们产生免疫和寿命的特征。
支架材料(单独的HA)、一定百分比的酪胺取代(~5%)、HA(实施例1改进的)的酪胺取代方案和不包含细胞与生物活性的因素的选择在实施例6中进行了公开。浓度为6.25-100mg/ml的T-HA水凝胶包括了面部重建材料所需的物理性能的宽谱。因此,根据我们临床医生的临床经验,实施例3中使用的相同的5中浓度被认为石适合进行鼠皮下测试。使用体外交联水凝胶生成用于分析形状保持的规定形状的水凝胶,我们的临床医生认为这很重要。体外交联在实施例1中进行了说明。
手术过程根据HA浓度,规定的机械性能和规定形状、重量和体积(直径为7mm、厚度为3mm)的T-HA水凝胶填充物用外科手术的方法皮下移植到免疫活性鼠的背部,从而根据前面公开的评价胶原质和其它HA为基础的水凝胶的方法来评价它们在体内的持续力和宿主免疫反应。在腹膜内注射克他命(100mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)进行麻醉后,鼠接受一次60,000单位的普洛卡因青霉素的肌肉注射以预防感染。用11#手术刀在鼠的腰下部区域切1cm的切口。14g的针作为套管针解剖皮下,形成一个口袋。用于测试的一种浓度的HA的三种使用的水凝胶填充物(~直径7.1mm×厚度3mm)插入到外科手术袋中。单一可吸收的缝合(3-0铬)再次接近皮肤边缘。在移植1周、1个月、3个月和6个月后,鼠用CO2窒息杀死。组织周围的T-HA水凝胶切离,并保存在4℃的福尔马林中,直至进行组织学分析。
移植后的数据测试的水凝胶包括由6.25、12.5、25、50和100mg/ml的HA制成的填充物;生成的水凝胶填充物的物理性能从凝胶到膏状物到类似橡胶的材料(实施例3)。移植1周、1个月、3个月和6个月后收集植入的T-HA水凝胶填充物。对离体的填充物进行体内持续性和宿主免疫反应的测试。
图13显示的是用H&E、阿利新蓝、MC/giemsa、Movats、Reticular和三色对100mg/ml的TB-HA的水凝胶填充物进行染色1个月的组织学典型结果。图13清楚显示的是毛囊表面、表面肌肉层、水凝胶填充物和由于体内排异反应导致的水凝胶填充物周围的纤维囊。人造物品由于水凝胶存在从石蜡嵌入过程的收缩,这可以通过使用冷冻部分避免。结果显示仅在填充物周围的柱状细胞薄层有很小的免疫反应,没有证据显示宿主细胞渗透到填充物中。测试时,组织学处理过程填充物留下的空间体积为3mm(原始的填充物厚度),表明水凝胶基质基本没有被生物降解和变形。染色表明填充物不含蛋白质如胶原质或弹性蛋白,在其中积存并保持初始的HA水凝胶组成。这些结果表明五种浓度范围的水凝胶填充物持续6个月后几乎没有降解、宿主免疫反应和细胞渗透,从而可以在软组织重建中作为注射材料大范围使用。
实施例10通过前面的讨论和实施例的公开,明显的,此处所述的由透明质酸分子的交联(原位或体源(ex vivo)的)大分子网络组成的水凝胶适合作为合成的、可移植的胞外基质组织材料用于多种组织工程和修复,其中水凝胶分子通过合适的二羟苯基和所述的合适的化学物质交联。此处公开的水凝胶材料的一个特殊应用是用于心脏二尖瓣的修复或强化。
二尖瓣是体内最复杂的连接组织结构。它包括两个小叶和多个腱索。这些腱有高度成胶的核,以及薄的弹性纤维外鞘和内皮细胞。该两个小叶是层积组织,该组织在心室侧主要含有成胶层,在心房侧主要为弹性层,以及含有丰富的蛋白多糖(PGs)和透明质酸(HA)的内侧松质层。这些层的相对厚度介于两个小叶之间,也在每个小叶的边缘和自由端之内。
不同小叶层的变化导致二尖瓣的结构要素由小叶和腱的具体功能作用决定。封闭的二尖瓣保持张力和应力的平衡,当前小叶的中心区域和腱处于拉紧状态,而前小叶的自由端和大部分的后小叶处于并列压缩状态。相应的,二尖瓣装置的主要成胶组分是腱和环面与上部并列边界之间的前小叶部分。在后小叶和前小叶的自由端中,成胶层相对较薄,而PG富含松质较厚。粘多糖(GAGs)的广泛多样性和它们的母PGs对胞外基质的物理性能的控制有相当大的可变性。
功能性二尖瓣返流(MR)指的是由于左心室(LV)官能障碍,和正常结构的二尖瓣一起发生的返流,因此,约半数LV官能障碍的病人至少有轻微的MR。功能性MR在充血性心力衰竭(CHF)中起关键作用,是心脏病变和死亡的主要原因。几种研究表明病人中伴随CHF的功能性MR的结果不好。尽管这种观察表明MR仅仅是CHF严重性的指示,它也清楚的表明MR的发展加速了CHF的进展。功能性MR的准确机理仍然存在争议,这种机理和隔膜侧轴(S-L)的二尖瓣环形扩张或对累积心室改变起次级作用的小叶范围相关。MR导致的LV大体积的超载伴随着累积的环形扩张和增加的MR,从而导致加剧问题的“恶性循环”。MR通常被认为是CHF的指示剂,以及疾病发展的推动力。
外科纤维环成形术(annuloplasty)在二尖瓣修复中被广泛使用,能够提供长期的效果。不过,外科手术过程需要通过心房切开术对二尖瓣进行操作。此外,手术需要对病人进行心肺分流术(CPB)。延长的CPB时间不仅是手术后LV官能障碍的一个原因,也是主要器官官能障碍的一个原因。在CPB期间使用肝磷脂导致出血并发症的风险加大。增加的发病率和死亡率导致许多护理者直接选择不对早期心力衰竭的病人不进行MR治疗。
最近,二尖瓣修复的几种最小程度侵入的方法得到了发展。例如,几个研究者报告了通过胸切开的非体外循环(off-pump)二尖瓣修复方法的初步理论。也有人报道了可以经由皮肤插入到冠状窦和大心脏静脉的新设备,以降低二尖瓣环面的S-L尺寸。不过,长时间在冠状窦中放置装置可能有潜在的副效应,如冠状循环的阻塞或扰动。
由于CPB的影响导致相对高的手术死亡率,包括纤维环成形术的二尖瓣修复和人造二尖瓣置换在内的功能性MR的外科手术治疗对严重CHF的病人很有限。因此,就需要有一种不妨碍冠状循环的最小程度侵入的方法,并可用降低二尖瓣环面的S-L尺寸,从而降低功能性MR和其它形式的MR。二尖瓣组织中的粘液瘤的变化导致小叶下垂和二尖瓣返流。
此处公开的T-HA水凝胶材料可以用于这种目的;即不可吸收物质用心外膜的方法注射(即T-HA水凝胶材料设计有必需的粘弹性和物理性能)到后二尖瓣环面中产生的二尖瓣环面改造。这种方法可以有效的降低S-L尺寸,从而降低MR,而不使用CPB或在冠状窦中植入装置。这种二尖瓣环面再造方法改进后允许通过冠状窦经由皮肤注射物质。
对于不能进行常规二尖瓣手术的、伴有功能性MR、患有严重CHF的病人,此处公开的T-HA水凝胶的这种应用可以使得不可吸收的物质通过冠状窦经由皮肤注射。这种最小程度的侵入方法将消除了CPB和切开手术的需要,以及降低了常规手术引起的主要副效应,如手术后LV官能障碍和器官的灌注。此外,这种方法向轻微到中等CHF病人提供一种早期恢复二尖瓣功能的选择,引起对破坏性心力衰竭的发生和发展的注意。
特别的,由此处所述的交联大分子网络组成的水凝胶,特别是HA,可用根据上述实施例3解释的机理进行设计,从而得到的水凝胶材料具有可用于这种应用的特性■可注射、不可吸收;■低度刺激性反应;■体外迁入的低识别性;■有助于防止移动的胶原质封装;■不是特别的有延展性,也不是特别的硬;注射T-HA水凝胶材料强化跳动心脏的二尖瓣的方案已经建立。该方案如下所述。
注射阶段-二维心外膜超声心动图(2D EE)和经食管超声心动图(2D TEE)用于评价LV末端心脏舒张和末端收缩量(EDV和ESV)、注射分数(EF)、二尖瓣环面的S-L尺寸和MR程度。可以收集血液动力学数据如LVP、LAP、中心静脉压力(CVP)、肺部动脉压力(PAP)、肺部毛细血管楔嵌压(PCWP)、CO、LAD流和LCX流。LV末端心脏舒张和末端收缩量的关系可以通过瞬时IVC闭塞得到,其中使用了闭塞导管评价LV收缩和舒张(注射前为基线)。
用于非体外循环冠状旁路移植的商业上可得到的心动稳定剂可用用于稳定目的区域。在2D TEE指导下,未交联的T-HA水凝胶组合物(50mg/ml的消毒盐水)在心脏跳动时从心脏外注射到后二尖瓣环面。在注射时,2D可以用于估计注射针顶端的位置,以及后环面中的物质所占的范围。一旦合适的填充和二尖瓣的重新配置完成,通过注射0.2cc的0.6%过氧化氢引发交联。完成水凝胶移植的交联后,应该收集包括血液动力学、冠状流、LV压力-体积循环(LV P-V循环)、2DEE和2D TEE的数据(注射后的数据)。
前述的注射方法通过用死犬和猪的心脏作为模型进行了研究和评价。图14显示的是死犬心脏注射T-HA水凝胶材料,以及通过前述的注射方法在原位交联。为了生产本试验的T-HA水凝胶材料,支架材料(单独的HA)、一定百分比的酪胺取代(~5%)、HA(实施例1改进的)的酪胺取代方案和不包含细胞与生物活性的因素在实施例6中进行了公开。浓度为25、50、100mg/ml的T-HA水凝胶盐溶液基本和二尖瓣中所需的心动(心脏)组织相匹配。根据我们的临床合作者的临床经验,经由皮肤注射的50mg/ml的T-HA水凝胶被认为最适合二尖瓣环面改造方法。在应用下述原位交联方案之前,需要加入10U/ml的过氧化酶。原位交联的方案是优选的,这是因为该方案允许未交联的T-HA穿过合适尺寸的针,而交联的水凝胶可能不行。另外,原位交联的方案允许外科医生首先通过注射未交联的水凝胶到达二尖瓣的合适位置(靠近),得到信息确定二尖瓣被正确的重新配置后,将水凝胶结合到实心移植中。
在图14中,植入的水凝胶在植入后切开,以说明其实心、原位交联后的粘弹性,以及评价其在心脏中放入的情况。特别的,这些模型用于1)评价模拟交联后心肌一致性和交联前通过注射部分所需水凝胶的合适浓度;2)验证所需体积(~2ml)完成体内交联的体内交联方案的重复性;以及研发合适的注射技术。这些目的都有信心实现,即注射方法和合适的T-HA水凝胶能够很好的调节二尖瓣环面上的约束条件。
虽然上述具体实施方案组成了优选实施方案,应该清楚的是,在不悖离所附权利要求书中所述的本发明的精神和范围的情况下,可以对本发明进行各种改变或修正。
权利要求
1.一种合成的、可移植的组织基质材料,该材料包括大分子网络,该大分子网络包含 其中R1和R2分别包含选自聚羧酸酯、聚胺、聚羟基苯分子和它们的共聚体的结构,其中R1和R2可以是相同或不同的结构。
2.如权利要求1中所述的合成的、可移植的组织基质材料,其中R1是聚羧酸酯。
3.如权利要求1中所述的合成的、可移植的组织基质材料,其中R1是聚胺。
4.如权利要求1中所述的合成的、可移植的组织基质材料,其中R1是多酚。
5.如权利要求1中所述的合成的、可移植的组织基质材料,其中R1包含选自组成粘多糖基团的结构。
6.如权利要求1中所述的合成的、可移植的组织基质材料,其中R1包含透明质酸。
7.如权利要求1中所述的合成的、可移植的组织基质材料,其中R1包含软骨素硫酸盐。
8.如权利要求7中所述的合成的、可移植的组织基质材料,其中软骨素硫酸盐为聚蛋白多糖。
9.如权利要求1中所述的合成的、可移植的组织基质材料,其中在大分子网络中进一步包含了有活力的活细胞群。
10.如权利要求1中所述的合成的、可移植的组织基质材料,其中在大分子网络中进一步包含了生物活性因子。
11.一种合成的、可移植的软骨材料,该软骨材料含有权利要求1所述的合成的、可移植的组织基质材料。
12.一种合成的、可移植的声带材料,该软骨材料含有权利要求1所述的合成的、可移植的组织基质材料。
13.一种合成的、可移植的玻璃体材料,该软骨材料含有权利要求1所述的合成的、可移植的组织基质材料。
14.一种合成的、可移植的软组织材料,该软骨材料含有权利要求1所述的合成的、可移植的组织基质材料。
15.一种合成的、可移植的二尖瓣材料,该软骨材料含有权利要求1所述的合成的、可移植的组织基质材料。
16.如权利要求1中所述的合成的、可移植的组织基质材料,所述网络包含了由羟基苯化合物取代的聚羧酸酯分子,其中至少一个二羟基苯键在分别与相邻聚羧酸酯分子连接的两个羟基苯基团之间形成。
17.如权利要求1中所述的合成的、可移植的组织基质材料,所述网络包含由羟基苯化合物取代的聚胺分子,其中至少一个二羟基苯键在分别与相邻聚胺分子连接的两个羟基苯基团之间形成。
18.如权利要求16中所述的合成的、可移植的组织基质材料,所述聚羧酸酯分子中的羟基苯化合物取代率相对于所述聚羧酸酯分子上的CO2H位点摩尔量小于10%。
19.如权利要求1中所述的合成的、可移植的组织基质材料,所述大分子网络包含由多个酪胺取代的透明质酸分子,其中至少两个相邻的透明质酸分子有一个二酪胺键连接。
20.一种合成的、可移植的软骨材料,该软骨材料含有权利要求19所述的合成的、可移植的组织基质材料。
21.一种合成的、可移植的声带材料,该软骨材料含有权利要求19所述的合成的、可移植的组织基质材料。
22.一种合成的、可移植的玻璃体材料,该软骨材料含有权利要求19所述的合成的、可移植的组织基质材料。
23.一种合成的、可移植的软组织材料,该软骨材料含有权利要求19所述的合成的、可移植的组织基质材料。
24.一种合成的、可移植的二尖瓣材料,该软骨材料含有权利要求19所述的合成的、可移植的组织基质材料。
25.如权利要求19中所述的合成的、可移植的组织基质材料,其中所述透明质酸分子中的酪胺取代率相对于所述透明质酸分子上的CO2H位点摩尔量约等于或小于10%。
26.如权利要求19中所述的合成的、可移植的组织基质材料,其中所述透明质酸分子中的酪胺取代率相对于所述透明质酸分子上的CO2H位点摩尔量约等于或小于5%。
27.如权利要求1中所述的合成的、可移植的组织基质材料,其中所述的R1和R2分别包括羟苯基取代的透明质酸。
28.如权利要求27中所述的合成的、可移植的组织基质材料,其中R1和R2中的透明质酸分子含有连接的聚蛋白多糖。
29.如权利要求27中所述的合成的、可移植的组织基质材料,其中所述的羟苯基取代的透明质酸的羟苯基取代率小于10%。
30.如权利要求27中所述的合成的、可移植的组织基质材料,其中所述的羟苯基取代的透明质酸的羟苯基取代率小于5%。
31.如权利要求27中所述的合成的、可移植的组织基质材料,其中所述的羟苯基取代的透明质酸为酪胺取代的透明质酸。
32.如权利要求31中所述的合成的、可移植的组织基质材料,其中所述的酪胺取代的透明质酸的酪胺取代率小于10%。
33.如权利要求31中所述的合成的、可移植的组织基质材料,其中所述的酪胺取代的透明质酸的酪胺取代率小于5%。
34.如权利要求1中所述的合成的、可移植的组织基质材料,其中所述的R1和R2分别包括羟苯基取代的软骨素硫酸盐。
35.如权利要求34中所述的合成的、可移植的组织基质材料,其中R1和R2中的软骨素硫酸盐是聚蛋白多糖的形式。
36.如权利要求34中所述的合成的、可移植的组织基质材料,其中所述的羟苯基取代的软骨素硫酸盐为酪胺取代的软骨素硫酸盐。
37.如权利要求36中所述的合成的、可移植的组织基质材料,其中所述的酪胺取代的软骨素硫酸盐的酪胺取代率小于10%。
全文摘要
本发明提供了二羟基苯交联的大分子网络,该网络可用于人工组织和组织工程应用中,特别提供了一种适合多种组织类型的合成的、可移植的组织基质材料,如人工或合成软骨、声带、玻璃体材料、软组织材料和二尖瓣材料。在实施例中,大分子网络由酪胺取代和交联的透明质酸分子组成,其中交联通过过氧化酶调制的而酪胺键形成,可以在体内使用。二酪胺键提供稳定、连续的透明质酸为基础的、具有很好物理性能的水凝胶。
文档编号C08G63/48GK101052684SQ200580030330
公开日2007年10月10日 申请日期2005年7月8日 优先权日2004年7月9日
发明者安东尼·卡拉布罗, 李·阿克斯特, 丹尼尔·阿拉姆, 詹姆斯·陈, 阿尼克·B·达尔, 深町清隆, 理查德·A·格罗斯, 大卫·海恩斯, 蒲原庆滋, 丹尼尔·P·诺特, 伊莱尔·李维斯, 艾里克斯·梅拉穆德, 安东尼·米尼亚奇, 马歇尔·斯特罗梅 申请人:克利夫兰临床基金会
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