专利名称：一种从产聚唾液酸大肠杆菌发酵液中提取聚唾液酸的方法
技术领域：
一种从产聚唾液酸大肠杆菌发酵液中提取聚唾液酸的方法，属于生物工程
背景技术：
1957年，Blix用较为温和的水解方法，从颌下腺粘蛋白中分离出与Bial’s试剂反应呈紫色的物质，将其命名为唾液酸(Sialic acid)，这个名称也用于后来发现的几种物质。此后人们用温和的水解方法从牛初乳、牛颌下腺粘蛋白和燕窝中相继分离得到完整的可结晶的唾液酸。唾液酸在自然界分布很广，是生物杂聚物的重要组成部分，主要以短链残基的形式存在于糖蛋白和糖脂的末端。已经发现唾液酸存在于许多生物体内，随着生物进化程度的增加，唾液酸在生物体内的含量及其衍生物类型亦增加，进化程度较低的生物，如原生动物、星虫、环节动物、多孔动物、扁形动物、钮形动物、栉水母动物、节肢动物等体内均极少有或没有唾液酸的存在。在脊椎动物体内普遍存在唾液酸，如鱼类、两栖类、爬行类、鸟类等动物。哺乳动物体内普遍存在唾液酸，相对而言在脑脊液和粘液中最多。
聚唾液酸(Polysialic acid，Colominic acid)是唾液酸以α-2，8和/或α-2，9酮苷键连接的线性同聚物，是少数几种细菌的胞外多糖组分。1957年Barry和Goebel首先在Escherichia coli K-235和K-1中发现该聚合物，以后又陆续在Neisseria miningitidis B，Salmonella toucra 048，Citrobacter freundii 05中发现该物质。α-2，8酮苷键连接的聚唾液酸末端相邻的两个单体形成内酯(甲单体的羧基和乙单体的9号碳位上的羟基脱水缩合形成)，对聚唾液酸的稳定起到一定的作用，这也是大多数的聚唾液酸以α-2，8酮苷键连接的主要原因之一。
聚唾液酸结构式如下
聚唾液酸是无色的，易溶于水，在水溶液中很稳定，4℃时贮藏数月不发生变化。如果溶液中含有非常微量的有机酸，其稳定性就受到很大的影响。游离的唾液酸能有效地抑制感冒病毒和其他病原微生物入侵红细胞。唾液酸的类似物Zanamivir(N-乙酰基-2，3-二脱氧-4-胍基唾液酸)和Tamiflu(oseltamivirphosphate)的抗流感机理一样，可以抑制流感病毒上唾液酸酶的活性，已经被美国FDA正式批准为治疗禽流感的特效药。唾液酸衍生物Sialyl LewisX作为重要的抗粘附药物，可有效阻止白细胞过量聚集，治疗类风湿性关节炎、脓毒性休克等疾病。同时，唾液酸是一种止咳祛痰剂，对于中心和外周神经性疾病以及脱髓鞘病均有疗效。如唾液酸胆固醇可以治疗老年痴呆症。此外，唾液酸在脑中的含量很高，可能作为神经传导质，参与离子外流和神经兴奋。单唾液酸神经节苷酯对于治疗脑缺血、帕金森症和神经创伤有一定功能。近年来发现，唾液酸还具有免疫抑制作用。以唾液酸为先导进行生物活性物质的探索已经成为新药研究的一个新领域。聚唾液酸可以作为一些药物的缓释剂，也可以用于固定酶以用于诊断，或对一些药物产品进行化学修饰。聚唾液酸可以用作治疗一些疾病的疫苗而避免其它细胞组分如脂多糖或蛋白质引起的副作用。
从产聚唾液酸大肠杆菌发酵液中提取精制唾液酸的方法有很多种，一般是把乙醇加入发酵液获得聚唾液酸粗品，然后水解聚唾液酸，再用离子交换和凝胶色谱法精制唾液酸，这种提取方法步骤复杂，提取过程引入较多的盐分，增加了提取的成本。与唾液酸单体相比，聚唾液酸的分子量和性质与发酵液中其它杂质差别很大，因此，聚唾液酸的分离纯化比唾液酸单体要容易得多，制备纯度较高的聚唾液酸，是减轻唾液酸单体分离纯化负担的有效措施。并且，聚唾液酸有重要的用途，可以单独作为有经济价值的产品，因此，分离得到纯度较高的聚唾液酸，具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种从产聚唾液酸大肠杆菌发酵液中提取聚唾液酸的方法，以降低唾液酸和聚唾液酸的生产成本，使其竞争力更强。
本发明的技术方案一株大肠杆菌(Escherichia coli)K235-JY II-74产聚唾液酸的发酵液，经过离心去除菌体，所得上清液用真空浓缩或者超滤浓缩，浓缩至原发酵液体积的1/2～1/4，浓缩液加入3～5倍浓缩液体积95％质量浓度的过量乙醇，pH 4.0～6.0，60～80℃，恒温1～2小时，沉淀出聚唾液酸，并隔夜静置，通过过滤或者离心获得聚唾液酸沉淀，再用2～4倍体积的75％质量浓度的乙醇洗涤2～4次，然后聚唾液酸沉淀再溶解于适量的去离子水中，得到浑浊液体经过15000～20000r/min，10～30min高速离心去除蛋白质，离心得到的上清液经过732阳离子交换树脂脱色，再用两倍体积去离子水洗脱，收集洗脱液，再用1/4体积氯仿振荡脱微量蛋白质，离心得到的清液用截留分子量为12000～14000Da的透析膜进行透析48～72小时，最后透析液体经过冷冻干燥得聚唾液酸产品。
本发明的有益效果本发明提出一种快速简洁的聚唾液酸提取方法。发酵液用过量乙醇使聚唾液酸和蛋白质同时沉淀下来，同时恒温60～80℃使蛋白质更容易变性，有利于后续提取纯化。聚唾液酸和蛋白质等杂质的混合沉淀物溶解于水中，其中变性的蛋白质无法溶解，经过高速离心即可把聚唾液酸和蛋白质分开。含有色素的聚唾液酸溶液经过阳离子树脂处理后可以去除一些色素和杂质，用氯仿振荡脱微量蛋白质，进一步提高产品纯度。利用透析可以去除一些小分子物质，经过冷冻干燥后，聚唾液酸的纯度达到93％以上。
图1聚唾液酸的提取流程示意图。
生物材料样品说明大肠杆菌(Escherichia coli)K235-JY II-74江南大学生物工程学院生化工程实验室保藏和提供，该菌株已在《无锡轻工大学学报》2002，21(5)，456～459公开。
具体实施例方式
实施例1.聚唾液酸发酵液的制备菌株大肠杆菌(Escherichia coli)K235-JY II-74。
发酵培养基(g/L)山梨醇40，氯化铵4.0，磷酸氢二钾20，MgSO40.9，胰蛋白胨1.5，pH 7.8。
利用9L发酵培养基，在15L Biostat C10-3机械搅拌罐上采用pH控制方法进行发酵，接种量4％，灭菌前加入少量聚氧乙烯聚氧丙烯甘油醚(泡敌)以控制发酵过程中的泡沫，发酵罐转速400～500rpm，通风量为10L/min，表压0.05Mpa，发酵温度37℃。调节pH值的氨水是浓氨水，盐酸浓度3M。菌体生长阶段的pH自然下降到6.4，然后用氨水和盐酸把pH值控制在6.4左右，直至发酵结束。
发酵初始山梨醇浓度为40g/L，发酵液培养60h下罐，测定聚唾液酸产量2.6g/L。
实施例2.聚唾液酸发酵液的制备菌株和发酵培养基的组分同实施例1，但发酵初始山梨醇浓度为20g/L。利用9L发酵培养基，接种量4％，在15L机械搅拌罐上采用流加补料法进行发酵(pH控制方法同实施例1)，发酵罐搅拌转速300～400rpm，通风量为25L/min，表压0.05Mpa，发酵温度37℃。发酵过程中，间隔一定时间取样测定山梨醇浓度，发酵至第12h开始补加山梨醇。根据底物浓度的变化，估计菌体对底物的消耗速率，调整控制补料液流加速率，使碳源浓度大约控制在5g/L到20g/L之间。发酵培养60h下罐，测定聚唾液酸产量达到4.5g/L。
实施例3.聚唾液酸的提取取2L发酵液，离心去除菌体，上清液用真空浓缩或者超滤浓缩，至原发酵液体积的1/2～1/4，浓缩液中加入浓缩液体积3～5倍的95％质量浓度的乙醇，pH4.0～6.0，60～80℃恒温1～2小时，隔夜静置，通过过滤或者离心获得聚唾液酸沉淀，再用75％的乙醇洗涤4次；然后聚唾液酸沉淀再溶解于适量的去离子水，得到浑浊液体经过15000～20000r/min，离心10～30min高速离心去除蛋白质，离心得到的上清液经过732阳离子交换树脂脱色，再用去离子水洗脱，收集洗脱液，再用1/4体积氯仿处理3次，离心得到的清液，用截留分子量为12000-14000Da的透析膜进行透析，最后透析液体经过冷冻干燥得聚唾液酸产品，纯度高于93％。
表1聚唾液酸提取纯化的收率
权利要求
1.一种从产聚唾液酸大肠杆菌发酵液中提取聚唾液酸的方法，其特征是一株大肠杆菌(Escherichia coli)K235-JY II-74的发酵液为原料，经过离心去除菌体，上清液浓缩，加入过量乙醇沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用去离子水溶解，离心去除蛋白质，上清液经过阳离子交换树脂脱色、用氯仿振荡脱微量蛋白质，透析，冷冻干燥得聚唾液酸产品。
2.根据权利要求1所述的提取聚唾液酸的方法，其特征是发酵液经过离心去除菌体其工艺为3000～8000r/min，离心10～30min。
3.根据权利要求1所述的提取聚唾液酸的方法，其特征是离心去除菌体后的上清液浓缩经真空浓缩或者超滤浓缩至原发酵液体积的1/2～1/4。
4.根据权利要求1所述的提取聚唾液酸的方法，其特征是加过量乙醇沉淀聚唾液酸去除菌体后的上清浓缩液加入3～5倍体积95％质量浓度的乙醇，pH4.0～6.0，60～80℃恒温1～2小时，隔夜静置，进行沉淀处理，沉淀处理液过滤或者离心获得聚唾液酸沉淀，再用2～4倍体积的75％质量浓度的乙醇洗涤沉淀2～4次。
5.根据权利要求1所述的提取聚唾液酸的方法，其特征是聚唾液酸沉淀用去离子水溶解，再离心去除蛋白质，离心工艺为15000～20000r/min，离心10～30min。
6.根据权利要求1所述的提取聚唾液酸的方法，其特征是将去蛋白质后的含聚唾液酸的上清液经过采用732阳离子树脂吸附脱色，再用2倍体积去离子水洗脱，洗脱液再用1/4体积的氯仿振荡，分层去除微量蛋白质。
7.根据权利要求1所述的提取聚唾液酸的方法，其特征是透析脱色脱微量蛋白质后的聚唾液酸采用截留分子量为12000-14000Da的透析膜透析48～72小时。
全文摘要
一种从产聚唾液酸大肠杆菌发酵液中提取聚唾液酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明以一株大肠杆菌产聚唾液酸的发酵液为原料，经过离心去除菌体，上清液浓缩，加入过量乙醇沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用去离子水溶解，离心去除蛋白质，上清液经过阳离子交换树脂脱色，用氯仿脱微量蛋白质，透析，冷冻干燥得到聚唾液酸产品。本发明提出一种快速简洁的聚唾液酸提取方法，得到93％纯度的聚唾液酸产品，以用于药品和化妆品的开发需要。
文档编号C08B37/00GK1896263SQ20061008807
公开日2007年1月17日 申请日期2006年6月22日 优先权日2006年6月22日
发明者詹晓北, 朱莉, 吴剑荣, 郑志永 申请人:江南大学